El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Resumen

El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.

Resumen

Muchas enfermedades crónicas de las vías respiratorias resultan en el taponamiento de moco de las vías respiratorias. Los pulmones de un individuo con fibrosis quística son un caso ejemplar en el que sus bronquiolos taponados con moco crean un hábitat favorable para la colonización microbiana. Varios patógenos prosperan en este entorno interactuando entre sí y conduciendo muchos de los síntomas asociados con la enfermedad de los FQ. Como cualquier comunidad microbiana, las condiciones químicas de su hábitat tienen un impacto significativo en la estructura y dinámica de la comunidad. Por ejemplo, diferentes microorganismos prosperan en diferentes niveles de oxígeno u otras concentraciones de soluto. Esto también es cierto en el pulmón de la FQ, donde se cree que las concentraciones de oxígeno impulsan la fisiología y la estructura de la comunidad. Los métodos descritos aquí están diseñados para imitar el entorno pulmonar y producir patógenos de una manera más similar a la de la que causan la enfermedad. La manipulación del entorno químico de estos microbios se utiliza entonces para estudiar cómo el chemistry de infecciones pulmonares gobierna su ecología microbiana. El método, llamado el sistema WinCF, se basa en medio esputo artificial y tubos capilares estrechos destinados a proporcionar un gradiente de oxígeno similar a la que existe en los bronquiolos moco enchufado. La manipulación de las condiciones químicas, tales como el pH del medio del esputo o antibióticos presión, permite la visualización de las diferencias microbiológicos en estas muestras usando indicadores de color, en busca de la producción de gas o biofilm, o de la extracción y secuenciación de los contenidos de ácido nucleico de cada muestra.

Introducción

El método descrito en este manuscrito se llama el sistema WinCF ^1. El objetivo general de WinCF es proporcionar un montaje experimental capaz de simular el ambiente de un bronquiolo de pulmón lleno de moco. Esto permitirá un sistema tratable para estudiar los patógenos microbianos de las enfermedades pulmonares con un fenotipo hipersecreción mucosa incluyendo la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y otros. El procedimiento fue diseñado específicamente para el estudio de CF, que se caracteriza por mutaciones que causan las secreciones pulmonares a convertirse espeso y difícil de limpiar, con el tiempo de llenado bronquiolos y otros pasos de pequeñas con mucosidad ^2. Tales bloqueos en el pulmón inhiben el intercambio de gas, porque el aire inhalado ya no es capaz de alcanzar muchas alvéolos y también proporcionar un hábitat para la colonización bacteriana ^{3, 4.} La incapacidad para prevenir el crecimiento microbiano en elExcesivo moco pulmonar eventualmente conduce al desarrollo de complejas infecciones crónicas de las vías respiratorias. Estas comunidades contienen una variedad de organismos, incluyendo virus, hongos y bacterias como Pseudomonas aeruginosa , que interactúan entre sí ^{5 , 6 , 7 , 8} . Se cree que la actividad del microbioma pulmonar de la FQ está implicada en brotes de síntomas llamados exacerbaciones pulmonares ^{1 , 9 , 10 , 11} . WinCF permite estudiar el comportamiento de la comunidad microbiana en torno a estas exacerbaciones y ahora se está expandiendo para actuar como un sistema experimental base para estudiar la ecología microbiana pulmonar. Tradicionalmente, las exacerbaciones se han estudiado a través del análisis directo de muestras tomadas del pulmón. Muchos factores de confusión hacen que el análisis directo de microbios bEl comportamiento en los pulmones desafiante, con el sistema WinCF, muchos de estos factores se eliminan y el comportamiento del microbioma pulmonar se puede estudiar más directamente, lo que permite un análisis más fino de la actividad bacteriana en un mucosidad taponada bronquiolos.

El sistema WinCF proporciona un método para crecer y analizar las bacterias de una manera que imita eficazmente el ambiente pulmonar. Los métodos tradicionales para el cultivo de bacterias pulmonares a menudo implicaban el cultivo de muestras en placas de agar tradicionales. Estos métodos dejan las muestras abiertas al oxígeno atmosférico, dejando de lado las condiciones hipóxicas ya menudo anóxicas encontradas en los bronquiolos pulmonares taponados con moco ^{12 , 13} . El cultivo en agar bajo condiciones aeróbicas no es nada como el ambiente del pulmón de la FQ y puede inducir a error a los clínicos e investigadores sobre el comportamiento de los patógenos que tratan de tratar. Además, los nutrientes disponibles para las bacterias en placas de agarSon disímiles a los disponibles en el esputo real, que se explica en WinCF utilizando medios de esputo artificiales (ASM). Como se muestra por los cultivos de Pseudomonas en Sriramulu et al. ¹⁴ , ASM incluye un conjunto específico de componentes que imita los recursos disponibles para los microbios de esputo y también reproduce la consistencia física del esputo. Debido a que un pulmón enfermo tiene un microbioma específico, el estudio de tales microorganismos debería tener lugar idealmente en las condiciones específicas del pulmón también.

El sistema WinCF permite un análisis rápido y una fácil manipulación de las condiciones experimentales para observar cambios microbianos similares a cómo ocurrirían en un bronquio pulmonar real. Esta técnica permite la inoculación de una miríada de tipos de muestras relacionadas incluyendo esputo, saliva, otras secreciones corporales y cultivos bacterianos puros o mixtos. La naturaleza de la configuración experimental permite la interpretación visual inmediata deel comportamiento de la comunidad microbiana y está diseñado para permitir una fácil aplicación aguas abajo de una multitud de procedimientos microbiológicos y ómicas. Tales estudios son importantes porque bacterianas cambios en la composición de la comunidad basados ​​en las condiciones fisicoquímicas de su entorno. Con WinCF las condiciones químicas de los medios de comunicación pueden ser manipulados para analizar los efectos sobre la actividad bacteriana. Por ejemplo, la acidez de los medios de comunicación puede ser alterada antes de la inoculación con una muestra. Después de la incubación, la actividad bacteriana en cada una de estas condiciones puede ser comparado directamente, y se pueden sacar conclusiones acerca de cómo las bacterias en las muestras de esputo se comportan en respuesta a la variación del pH. A continuación, describimos los procedimientos de aplicación del sistema de WinCF y ejemplos de cómo la química de los medios puede ser manipulado para estudiar los efectos sobre el microbioma de pulmón.

Protocolo

1. Preparación de existencias para el medio de esputo artificial

1. Crear una solución de mucina al 5%. Añadir 1,0 g de mucina estomacal deshidratada de cerdo a 20 ml de agua desionizada. Autoclave la solución resultante.
   NOTA: La esterilización de la mucina destruirá su estructura inherente; Otros métodos para esterilizar la mucina en su forma seca incluyen esterilización UV e irradiación. Sin embargo, estos métodos no se han utilizado ampliamente para el sistema WinCF.
2. Añadir 2,2 g de KCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Añadir 5,0 g de NaCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Autoclave estas dos soluciones.
3. Añadir 100 mg de ADN de esperma de salmón a 10 ml de agua estéril desionizada. Calentar esta solución a unos 85 ° C en un baño de agua durante unas horas para asegurar la disolución.
4. Añadir 5,0 mg de ferritina a 5,0 ml de agua desionizada estéril.

2. Preparación del medio de esputo artificial

1. CombinarLos siguientes componentes: 16 ml de solución madre de mucina, 2,0 ml de solución madre de KCl, 2,0 ml de solución madre de NaCl, 200 μl de emulsión de yema de huevo, 5,6 ml de solución madre de ADN, 120 μl de solución madre de ferritina, 5,78 ml de solución madre esencial Aminoácido, 5,78 ml de solución de aminoácidos no esenciales y 2,44 ml de agua estéril.
   1. Si aparecen pequeñas cantidades de sedimento, agite suavemente para mezclar.
   2. Pipetee 5,0 mL de medio en ocho tubos de centrifugación estériles de 15 mL.
      NOTA: Las condiciones químicas de cada tubo pueden ser manipuladas como se desee. Por ejemplo, se pueden añadir soluciones tampón e indicadores de pH a cada tubo con el fin de comparar el comportamiento microbiano a distintos niveles de pH. Una demostración de esto se muestra en la sección de resultados representativos con 8 niveles de pH distintos, de 5,0 a 8,5 en 0,5 incrementos de pH.
2. Una vez que las condiciones químicas de los medios se manipulan con éxito, congelar para su uso posterior. Los medios permanecerán establesZen a -20 ° C durante varios meses. Vórtice al descongelar.

3. Preparación de un recorrido de control de los tubos capilares

1. En una biopsia estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 250 μl de medio cada uno.
2. Adquiera ocho tubos de centrífuga más estériles de 15 ml, correspondiendo cada tubo a un tubo de microcentrífuga mencionado en el paso 3.1.
   1. Esterilizar una toalla de papel con solución de etanol al 70% y dejar secar. Una vez seco, lágrima la toalla en pedazos alrededor de cuatro pulgadas cuadradas cada uno, y arrugue cada pieza en el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml. Para tubos adicionales, rocíe y seque las toallas de papel adicionales según sea necesario.
   2. Con un manojo de papel en la parte inferior de cada tubo de centrífuga, humedezca ligeramente cada capa de papel con aproximadamente 1,0 ml de agua estéril para crear un ambiente húmedo.
3. Obtener tres tubos capilares de vidrio para cada tubo de microcentrífuga preparado en el paso 3.1 y un bloque de tubo capilar seala sealaNuevo Testamento.
4. Para cada tubo de microcentrífuga, llene tres tubos capilares con medios a unos 5 mm del marcador azul cerca de la parte superior del tubo.
   1. Llene con un extremo del tubo en el tubo de microcentrífuga e inclínelo hacia la orientación horizontal, permitiendo que la acción capilar guíe el medio dentro del tubo (ver Figura 1 ).
   2. Detenga el relleno colocando suavemente un dedo enguantado sobre el extremo abierto del tubo y, a continuación, cierre el otro extremo del tubo presionándolo hacia abajo en el bloque de sellador.

Figura 1: Ejemplo de gradiente de pH, tubo capilar de relleno con medio de esputo artificial. El medio se añade insertando un extremo del tubo en el líquido e inclinándolo para facilitar la acción capilar. La coloración media en este ejemplo se debe al indicador de pH añadido para ayudar al demonioLos cambios potenciales en la acidez después de la incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Coloque cada conjunto de tres tubos capilares en tubos de centrífuga de 15 mL llenos de toallas de papel completamente humedecidas con agua estéril, con el lado sellado con masilla. Tape el tubo y la etiqueta. Estos tres tubos capilares son para la replicación de cada condición de control.
6. Cuando todos los tubos de centrífuga de 15 mL se llenen con sus tubos capilares designados, coloque los tubos en un soporte. Coloque la rejilla de manera que los tubos se incuban horizontalmente (para atrapar las burbujas de gas) (ver Figura 2 ). Incubar los tubos capilares en el interior de los tubos de centrífuga (que contienen los trozos de papel humedecidos) a 37 ° C durante 48 h.

Figura 2: Ejemplo de Gradiente de pH, Tubos Capilares Listo para Incubación. Una vez que se han llenado y sellado tres tubos capilares, se colocan en un tubo de centrífuga con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Este tubo se tapa y se coloca en un estante. La rejilla debe estar orientada lateralmente durante la incubación, como se muestra en la imagen, de modo que se puede observar la producción de gas una vez que se ha completado la incubación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Imágenes de los tubos capilares de control después de la incubación

1. Retire la rejilla de los tubos de centrífuga de la incubadora, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Deslice cuidadosamente los tubos capilares de los tubos de centrífuga, manteniendo cada conjunto de tres separados de otros conjuntos.
2. Coloque los tubos capilares uno junto al otro sobre una caja de luz, todos alineados de modo que el contenido de los tubos sean visIluminado. Deje un hueco cada tres tubos para separar diferentes condiciones químicas.
3. Con los tubos alineados y la caja de luz encendida, fotografíe directamente desde arriba. (Ver Figura 3 )

Figura 3: Ejemplo de gradiente de pH, ensayo de control, preincubación, no se añadió esputo. Medio de esputo artificial después de ser añadido a los tubos capilares en grupos de tres, aumentando el pH de izquierda a derecha. La combinación de indicadores añadidos al medio dan como resultado que los tubos más ácidos aparezcan más amarillos, mientras que los tubos menos ácidos se vuelven más morados. Los tubos están dispuestos horizontalmente y están iluminados desde abajo, fotografiados desde arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Deshágase delControl de materiales en residuos biológicos peligrosos.

5. Inoculación de los tubos capilares WinCF con una muestra de esputo

1. En una biofunción estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 225 μl de medio cada uno.
2. Homogeneizar la muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa.
3. Añadir 25 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio ASM) preparado en el paso 5.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente.
4. Añada el medio a los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento descrito en los pasos 3.2 a 3.5.

6. Imágenes de tubos capilares de muestra después de la incubación

1. Después del tiempo de incubación de 48 h, retirar e imitar los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento que los pasos 4.1 a 4.3.
2. Si las burbujas están presentes en los tubos,de que las fotografías tomadas claramente representan la delimitación entre las burbujas y los medios de comunicación en los tubos. Si biopelícula está presente, asegúrese de que las fotografías pueden mostrar claramente su presencia también.

7. La eliminación de los medios de comunicación para aplicaciones posteriores

1. Para facilitar el análisis de aguas abajo, eliminar los medios de comunicación de los tubos capilares después de formación de imágenes. Las aplicaciones potenciales incluyen el cultivo y el ADN / ARN secuenciación y perfilado metabolomic.
   Precaución: Los tubos capilares de vidrio llenas de agentes patógenos son un peligro biológico significativo, por lo tanto, estas medidas debe hacerse con mucho cuidado con el equipo específico. Si tubos capilares se rompen, disponer en un recipiente adecuado de riesgo biológico de objetos punzantes.
2. Utilice agujas extremos romos de calibre 25 y de 0,5 pulgadas de longitud para eliminar los medios de comunicación. Insertar la aguja de extremo romo en el extremo enchufado del tubo para romper el sello.
3. Después de romper el sello, gire el tubo capilar al revés y los medios de comunicación gotear desde la parte superior. yoSi el medio no se escurre fácilmente, use una pipeta con una punta de 200 μL y expulsar el medio del tubo presionando el émbolo de la pipeta cuando se inserta en el extremo del tubo capilar. Recoja el medio del tubo expulsado en un recipiente apropiado (tubo de centrífuga de 1,5 ml).
   NOTA: Para el análisis transcriptómico u otro análisis de ARN, los medios pueden ser expulsados ​​directamente a tampones estabilizadores de ARN.

8. El sistema WinCF FLUD

NOTA: El sistema de dispositivo de carga de fluidos WinCF (FLUD) es un conjunto opcional de dispositivos complementarios diseñados para optimizar el rendimiento del sistema WinCF. El sistema WinCF FLUD se compone principalmente de materiales imprimibles en 3D. La fabricación impresa 3D permite el reemplazo rápido y fácil de los materiales para asegurar el tiempo de inactividad mínimo para los investigadores así como requisitos mínimos de la fabricación. Diseños, archivos stl, instrucciones de impresión en 3D y el manual WinCF FLUD están disponibles en el suplemento en líneaNuevo Testamento.

1. Preparación de medios para la carga de tubos capilares
   1. En una biofundidad estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles de 2 mL con 900 μl de medio cada uno.
   2. Homogeneizar cualquier muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa.
   3. Añadir 100 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio) preparado en el paso 8.1.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente.
   4. Introduzca los tubos de microcentrífuga llenos y abiertos en el soporte del tubo rotatorio orientado de modo que los tubos sean verticales.
2. Colocación de tubos capilares
   1. Recuperar tres tubos capilares para cada tubo de microcentrífuga en el paso 8.1.
   2. Introduzca tres tubos en el soporte de goma para que se alineen con los tubos de microcentrífuga en el otro extremo del aparato.Asegúrese de que los extremos marcados de los tubos estén afuera de los tubos de microcentrífuga. Coloque los tres orificios en la parte inferior de la cuna correctamente sobre los tres pernos en el soporte de la cuna.
   3. Con los tubos capilares colocados que descansan en sus canales de guía en el aparato, coloque el tampón de goma sobre sus midsections con seguridad para evitar el cambio. (Ver Figura 4 )

Figura 4: El sistema FLUD completamente cargado con tubos capilares asegurados por el caucho Tamp sobre su Midsections. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Carga de medios en los tubos capilares
   1. Con cuidado use una mano para agarrar el extremo del aparato donde están los tubos capilaresADED, y utilizar la otra mano para sostener el bastidor de los rotadores en el que se cargan los tubos de microcentrífuga.
   2. Delicadamente girar el bastidor de microcentrífuga de modo que los tubos de microcentrífuga son casi horizontal y proceden a empujar lentamente la cremallera hacia los tubos capilares. (Ver Figura 5)
   3. Cuando los extremos de los tubos capilares hacen contacto con los medios de comunicación en los tubos de microcentrífuga, garantizar que la acción capilar comienza inmediatamente el llenado de los tubos capilares. Para ajustar la tasa de relleno y el nivel de llenado, gire suavemente el aparato como un todo. Mientras hace esto, tenga cuidado de no derramar el material fuera de los tubos de microcentrífuga. (Ver Figura 6)
   4. Cuando los tubos capilares se llenan a los niveles deseados, colocar el nivel de aparato sobre una superficie y cuidadosamente todavía tirar rápidamente el bastidor de tubos de microcentrífuga de los extremos de los tubos capilares para cesar el llenado. Los tubos de microcentrífuga ahora se pueden retraer todo el camino de vuelta a la posición vertical y se cerraron.
   5. Sellar los extremos salientes de los tubos capilares pulsando un bloque sellante en cada conjunto por triplicado, sellando un conjunto a la vez hasta que todos los conjuntos están sellados. Para reducir el riesgo de contaminación, pulse una parte diferente del bloque sellante en cada conjunto por triplicado (Ver Figura 7).

Figura 5: El Sistema Flud con medio Tubos desplegado en una orientación horizontal, listo para entrar en contacto con tubos capilares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El sistema de Flud con capilar tubos de carga con los medios de comunicación a través de la acción capilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Sellado de tubos capilares llenos en el sistema FLUD Un conjunto de triplicado a la vez usando un bloque de sellador. Este bloque sellante tenía plástico a lo largo de los bordes que se cortó para evitar el contacto con conjuntos triplicados vecinos durante el sellado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Incubación
   1. Retire el tapón de goma sobre las secciones del tubo y levante la base de goma del aparato principal. Esto debe tomar todos los tubos capilares con él. Ahora coloque la cuna y los tubos en el bastidor de imágenes. Esta raCk tiene tres talones que caben en la cuna, así como pequeños canales de guía para colocar los tubos en.
   2. Coloque el bastidor de imágenes en su totalidad en la caja de incubación de plástico transparente. Sumerja pequeñas cantidades de toallas de papel estériles en agua estéril y colóquelas a lo largo de los dos lados más cortos de la caja para proporcionar humedad durante la incubación. (Ver Figura 8 )
   3. Cierre la caja completamente y colóquela en una incubadora a 37 ° C, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Incubar durante 48 h.

Figura 8: Tubos capilares en la cuna de goma transferida del sistema FLUD a un estante de imagen, que se ha colocado en una caja de incubación transparente junto a las toallas de papel húmedas para proporcionar humedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande dees figura.

5. De imágenes y extracción
   1. Retire la rejilla de imágenes que sostiene los tubos de la caja de incubación y la puso en una caja de luz, iluminada desde abajo. Con ya los tubos en el bastidor de formación de imágenes, los conjuntos por triplicado estarán debidamente espaciados y dispuestos a imagen inmediatamente.
   2. Enfoque la cámara en los tubos de tal manera que todos son visibles en el campo de visión y la luz de la caja de luz proporciona un contraste suficiente y visualización del color en los tintes de tubo. Fotografía directamente desde arriba.
   3. Para extraer los contenidos de los tubos, retirar los tubos capilares de la goma base un conjunto de triplicados a la vez. levante suavemente los tubos hacia arriba y fuera de la cuna o deslice hacia fuera.
   4. Para cada conjunto de triplicados, siga el procedimiento de extracción se detalla en los pasos 7.1 a 7.3.

Resultados

crecimiento microbiológico a través de las diversas condiciones químicas inducidas dentro de las muestras varió dramáticamente en algunos casos y de manera más sutil en otros. Muchos cambios en la actividad fueron visual en la naturaleza, siendo fácilmente evidentes tan pronto como el período de incubación terminó. En el ejemplo de la manipulación del pH, las muestras de todo el espectro pH variaron en gran medida como se muestra por múltiples factores que se hicieron evident...

Discusión

La composición microbiológica de un pulmón con CF contiene una gran variedad de organismos, pero las condiciones dentro del pulmón probablemente tienen una influencia significativa sobre qué tipos de microbios pueden sobrevivir y prosperar [ ^{13 , 15]} . Los mecanismos específicos a través de los cuales estas condiciones cambian y los efectos exactos que tienen en el microbioma pulmonar son generalmente poco claros en la actualidad. En este método experime...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Color-Coded Capillary Tubes	Fisher Scientific	22-260943
Cha-seal Tube Sealing Compound	Kimble-Chase	43510
Mucin from porcine stomach	Sigma	M1778
Ferritin, cationized from horse spleen	Sigma	F7879
Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)	AppliChem Panreac	A2159
MEM Nonessential Amino Acids	Corning cellgro	25-025-CI
MEM Amino Acids	Cellgro	25-030-CI
Egg Yolk Emulsion, 50%	Dalynn Biologicals	VE30-100
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P2157500
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271500
15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps	VWR	89039-666
50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps	VWR	89039-656
1.5 mL microcentrifuge tubes	Corning	MCT-150-R
2.0 mL microcentrifuge tubes	Corning	MCT-200-C