El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Resumen

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

Resumen

La respuesta al daño del ADN (DDR) se ha caracterizado ampliamente en estudios de doble filamento se rompe (DSBs) inducida por irradiación con haz de micro láser en células vivas. El DDR a la hélice que distorsionan modificaciones del ADN covalentes, incluyendo entrecruzamientos de ADN entre hebras (ICL), no está tan bien definida. Hemos estudiado la DDR estimulado por ICL, localizada por fotoactivación de psoralenos láser immunotagged, en los núcleos de las células vivas. Con el fin de abordar cuestiones fundamentales sobre distribución de aductos y encuentros horquilla de replicación, se combinaron localización láser con otras dos tecnologías. fibras de ADN se utilizan a menudo para mostrar el progreso de las horquillas de replicación por inmunofluorescencia de análogos de nucleósidos incorporados durante pulsos cortos. puntos Immunoquantum han sido ampliamente empleado para obtener imágenes de una sola molécula. En el nuevo enfoque, las fibras de ADN de las células que llevan ICL láser localizada se extendieron sobre portaobjetos de microscopio. Las ICL etiquetados se muestran con puntos immunoquantum y THe distancias entre las lesiones determinadas. colisiones horquilla de replicación con ICL se pueden visualizar y diferentes patrones de encuentro identificaron y se cuantificaron.

Introducción

DNA está bajo asalto constante de los agentes exógenos tales como la radiación, luz ultravioleta, toxinas ambientales, productos de combustión, etc. Además, también es atacado por las especies de radicales endógenos producidos por el metabolismo oxidativo. Todos estos tienen el potencial de alterar química o físicamente la integridad del ADN ^1. Las perturbaciones en el genoma pueden activar la respuesta al daño del ADN (DDR), un reclutamiento y la cascada de la modificación post traduccional con cientos, si no miles, de proteínas y microRNAs implicados en la reparación de la lesión, la regulación del ciclo celular, apoptosis, senescencia, y las vías inflamatorias ^2.

La mayor parte de nuestra información sobre el DDR proviene de estudios con DSB. Esto es en gran parte debido a la disponibilidad de tecnologías para la introducción de roturas, incluidas las pausas específicos de secuencia, en el ADN genómico en las células vivas ^3. Además, el propensity de descansos para inducir focos de proteínas de DDR, que se pueden visualizar mediante inmunofluorescencia, ha sido muy útil para la identificación de la cinética y requerimientos de proteínas que responden. Una de las tecnologías clave para el estudio de la DDR fue introducido por Bonner y colegas, que utiliza un rayo láser para dirigir una banda de DSBs en una "región de interés" (ROI) en los núcleos de las células vivas ^4. En efecto, crearon un enfoque muy largo en el que las proteínas de la RDA podrían ser identificados por inmunofluorescencia. Esto se ilustró por su demostración de la fuerte de la raya de la histona H2AX fosforilado (γ-H2AX) en las células expuestas a láser. Desde entonces, el enfoque de láser se ha empleado en numerosos estudios de la DDR inducidos por DSBs. Aunque potente y popular, y la fuente de las imágenes de inmunofluorescencia dramáticos, cabe señalar que en la mayoría de los experimentos de la intensidad del láser se ajusta a fin de producir resultados observables, sin preocuparse por la identidad de la lesión,densidad, o espaciado. De hecho, puede ser difícil hacer estas estimaciones. Por lo tanto son ignorados en gran medida, a pesar de la multiplicidad de las lesiones introducidos en ADN por láser ^5. Esto contribuye a las muchas contradicciones en la literatura ^6.

En contraste con DSBs, la mayoría de modificaciones químicas de ADN no estimulan la formación de focos discretos de las proteínas de DDR. Esto es importante a la luz de nuestra comprensión actual de las frecuencias de la lesión. Se ha estimado que las células humanas en cultivo incurren en tanto como 50 DSBs por ciclo celular, formadas en gran medida durante la fase S ^{7, 8, 9.} Menos se forman en las células no proliferativas. Esto contrasta con el número de pérdidas de nucleobases o eventos de modificación, que están en las decenas de miles por célula / día ^{1, 10.} Por lo tanto, la mayoría sabemos acercala DDR inducida por eventos que son relativamente raras, y mucho menos acerca de los inducidos por lesiones hélice distorsión, que en conjunto son mucho más comunes.

Con el fin de abordar cuestiones relativas a la respuesta celular a las modificaciones covalentes de ADN genómico, queríamos trabajar con una hélice que distorsionan aductos de ADN que tenía actividad inherente de inducción DDR. Además, para facilitar el diseño experimental y la interpretación que estábamos interesados ​​en una estructura cuya introducción podría ser controlado con respecto al tiempo y era susceptible de visualización. En consecuencia, hemos desarrollado una estrategia basada en psoraleno. Los psoralenos están bien caracterizados intercaladores de ADN fotoactivos que favorecen 5' TA: AT sitios. A diferencia de otros agentes de reticulación tales como mostazas de nitrógeno y mitomicina C (MMC) que no son ADN reactiva a menos expuesto a la luz UV de onda larga (UVA). Las moléculas intercaladas reaccionan con bases de timina en hebras opuestas para producir hélice distorsionar reticulaciones entre cadenas (ICL) ^11. Con el psoraleno trimetil usado en nuestros experimentos mayoría de los productos son ICL, se generan relativamente pocos monoaductos (menos de 10%) ^12, y reticulaciones intracatenarios entre bases adyacentes en una cadena no se forman. Debido a que son potentes bloques a la replicación y transcripción, psoraleno y otros agentes de reticulación, como cis-platino y MMC, se utilizan comúnmente en la quimioterapia. Por lo tanto permitido psoraleno estudios que siguieron a la activación de la DDR por una estructura que distorsionan hélice, y también proporcionado información sobre la respuesta celular a un compuesto con importancia clínica.

Se sintetizaron un reactivo en el que psoraleno trimetil estaba relacionado con digoxigenina (Dig), un esterol de planta no se encuentra en células de mamífero y se utiliza con frecuencia como un immunotag. El requisito para la fotoactivación permite la localización por la luz láser (365 nm) de ICL de psoraleno en ROI definido en núcleos en las células vivas. Éstas se pueden representar por la IMMunofluorescence contra la etiqueta Dig. La reparación del ADN y las proteínas de DDR aparecieron en las rayas de láser localizadas ICL ^{13, 14.}

El DDR activado por las intensidades altas de láser usados para producir DSBs podría ser debido al daño aislado o agrupado ^{15, 16.} En consecuencia, la relevancia de los resultados de estos experimentos a lesiones de origen natural, presente en mucho menor concentración, es incierto. Para hacer frente a preguntas similares acerca de la frecuencia aducto psoraleno y el espaciamiento en el ADN, nos aprovechamos de la tecnología de fibra de ADN y ¹⁷ puntos immunoquantum. Los puntos cuánticos son mucho más brillantes que los tintes fluorescentes y no se blanquean por la exposición a la luz. Por lo tanto se utilizan con frecuencia para la imagen única molécula de ^18, una solicitud de que los colorantes fluorescentes no son suficientemente brillante. fibras de ADN individuales se pueden estirar en gdiapositivas Lass y se pueden visualizar por inmunofluorescencia contra análogos de nucleósidos incorporados durante incubaciones anteriores a la celda de la cosecha. Se han tratado las células con Dig-psoraleno y expuesta la ROI a micro láser irradiación. Las fibras se preparan a partir de las células y los aductos individuales DIG-psoraleno puede ser visualizado con los puntos immunoquantum. Exponer las células a los análogos de nucleósidos para tiempos relativamente cortos (20-60 min) permite la visualización de secciones de replicación en las proximidades de los ICLs láser localizado.

Protocolo

1. Preparación de Dig-TMP

1. Mezclar 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-clorometil-4,5' , 8-trimetilpsoraleno y 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina en un lugar seco 25 ml ronda matraz -fondo bajo nitrógeno. Añadir 10 ml de tolueno y reflujo durante 12 h. Eliminar el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida.
   1. Se purifica el residuo por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Eluir la columna con cloroformo, metanol y solución al 28% de amoniaco (9: 1: 0,5). Se evapora el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida, y recuperar el puro 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', 8-trimetilpsoraleno como un pálido amarillo viscoso líquido.
   2. Mezclar 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5', 8-trimetilpsoraleno con 5 mg (0,008 mmoles) de éster NHS digoxigenina en un matraz de fondo redondo seco bajo nitrógeno. Añadir 0,5 ml de dimetil formamida (DMF) anhidra unad 3,4 l de trimetilamina y se agita a 50 ° C durante 18 h.
   3. Eliminar el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida.
   4. Se disuelve el residuo en una cantidad mínima de diclorometano. Aplicar la solución en 2 puntos mu l horizontalmente a través de la parte inferior de una placa preparativa de capa fina con gel de sílice como fase estacionaria. Ejecutar la preparativa TLC en cloroformo: metanol: hidróxido de amonio 28% (8: 1: 0,1).
   5. Máscara la placa, excepto para los bordes verticales e identificar la banda de producto con longitud de onda corta UV 254 lámpara nm. Raspar el producto de la placa con una espátula y aislar el producto puro usando cloroformo: metanol: hidróxido de amonio 28% (8: 1: 0,1) mezcla.
   6. Eliminar los disolventes en un evaporador rotatorio a presión reducida. Disolver los pellets residuales en 1 ml de 50% de EtOH: H ₂ O, dispensar en 50 alícuotas en tubos de 1,5 mL (~ alícuotas de 20) y se seca en un evaporador centrífugo hasta que todo el disolvente se evapora (~ 3 h).
   7. Se vuelve a disolver cada alícuota en 200? L de 50% de EtOH: H ₂ O y se seca de nuevo en un evaporador centrífugo. Disolver cada alícuota de nuevo en 200 l de 50% de EtOH: H ₂ O, seco en un evaporador y almacenar centrífugas gránulos a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
2. Para su uso, disolver el precipitado en 50 l de 50% de EtOH: H ₂ O. Preparar una dilución 1: 100 de la disuelto Dig-TMP en H ₂ O y medir la DO a 250 nm. El coeficiente de extinción de Dig-TMP es 25.000. La solución es estable durante aproximadamente un mes si se almacena a -20 ° C. Verificar la concentración midiendo la DO a 250 nm antes de cada uso.
   1. Calcular la concentración Stock: Abs x 100 x10 ^6/25000 = concentración (en M). Típicamente, la solución madre es de aproximadamente 3 mM. Es importante estar en este intervalo con el fin de minimizar el volumen de EtOH se añade al medio.

2. Láser localizadas DIG-TMP ICL

1. Educación físicarforma localización láser con un microscopio confocal con un láser de nitrógeno SRS (337 nm) bombea a través de una célula de tinte que emite una línea de 365 nm y disparando 3 ns pulsos a 10 Hz, con una potencia de 0,7 nW.
2. Hacer una marca vertical en el lado de un vidrio de 35 mm tocó fondo placa de cultivo celular con un marcador. Rasguño una cruz en el centro del vidrio sobre la superficie de cultivo con una pluma de diamante de manera que la raya negro en el lado del plato es en la parte superior de un brazo de la cruz. La cruz está marcado en la superficie de crecimiento del cristal de modo que las células y estará en el mismo plano focal.
3. Esterilizar la placa después de marcar con un enjuague de 70% EtOH. Seco antes de placas células.
4. células de la placa (cepas de laboratorio estándar tales como HeLa o U2OS) en la cruz marcados placas de cultivo de uno o dos días antes. Cell debe dividen activamente y 50-70% de confluencia en el día del experimento. Incubar 24 h con 1? M 5-cloro-2-desoxiuridina (CldU) al ADN de etiqueta de manera uniforme.
5. AñadirDig-TMP en 50% de EtOH: _H2O al medio de cultivo celular a una concentración final de 20? M. Llevar el medio a 37 ° C. Cambiar el medio sobre las células y el lugar en la incubadora (37 ° C, 5% _CO2) durante 30 min para permitir que el Dig-TMP se equilibre.
6. Mientras que las células están incubando, establecer las coordenadas X / Y del campo de vista en el que el láser está activo. Siga el procedimiento de calibración del fabricante en la que el láser es dirigido por el software para grabar un portaobjetos de vidrio de espejo a lo largo de una línea horizontal y diagonal. Las dos líneas definen los límites del campo en el que el láser puede lograr un objetivo.
7. Colocar la placa en la cámara ambiental, a 37 ° C con CO ₂ controlada y humedad, en la platina del microscopio y se centran con el objetivo aceite de 60X en la intersección de la cruz.
8. Dirigir el haz láser 365 nm a una ROI, establecida por el investigador con la herramienta forma en el software, para formar una franja de 3 &# 181; mx 0,6 m. El contorno de la ROI se coloca el cursor en el núcleo de las células situadas en las inmediaciones de la intersección de la cruz. Ajustar el plano focal z para apuntar la mitad del camino láser a través del núcleo. Utilizar un láser en el rango de 350-370 nm. 405 láseres nm no pueden inducir reticulaciones ^19.
   NOTA: Localizamos la ROI en áreas fuera de la nucleoplasmic nucleolos, que puede ser distinguida de nucleoplasma en formación de imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC).
9. Verificar el enfoque y la actividad del láser mediante el aumento del valor de corriente a un nivel suficiente para destruir una célula (la célula se oscurecerá y luego desaparecen). Este es un importante diagnóstico para una trayectoria de la luz sin obstáculos para el láser a través del microscopio y luego a través del cubreobjetos y en las células.
   1. Bajar el valor de corriente a basta con activar el psoraleno y la RDA ICL inducida (esto debe ser determinado empíricamente para cada láser / micrófonoROSCOPE combinación). Use un valor de intensidad del láser (1,7% aquí) que no activa la RDA en ausencia de psoraleno (controlado por la formación de γ-H2AX).
      NOTA: Esta es una determinación importante y la configuración puede requerir ajuste si se cambia la fuente de láser o un componente en la trayectoria de la luz. Sigue la acumulación de GFP etiquetada proteínas de reparación tales como XPC o FAN1, ambos de los cuales son reclutados rápidamente (en segundos) a las franjas de psoraleno láser, pero no a Roi expuesta al láser solo. Algunas proteínas de la RDA aparecen en cuestión de segundos, mientras que varios minutos pueden ser necesarios para otros. Es necesario llevar a cabo las determinaciones del curso de tiempo para cada proteína de interés. También observamos que en las células no expuestas al láser no hay bandas de proteínas que responden.
10. Después de todas las células en un campo han sido objeto de mover la placa a un nuevo campo, permaneciendo cerca de la intersección de la cruz.
11. En experimentos diseñados para determine la distribución de las distancias inter lesión exponer las células al láser en 20-25 campos (4-5 células / campo) alrededor de la intersección. Con el fin de analizar los patrones de replicación en las proximidades de los ICLs localizadas incubar las células con 10? M 5-yodo-2-desoxiuridina (IDU) después de la cocción láser.
    NOTA: El tiempo de incubación con el UDI es un tanto arbitraria. Hemos utilizado tan corto como 20 min y el tiempo que 60 min (ver más abajo). pulsos más largos (unas pocas horas) a menudo resultan en múltiples extensiones de replicación de coalescencia, perdiendo así la oportunidad de imagen del progreso de tenedores individuales. En algunos experimentos ces se etiquetan con CldU para 24 h de forma homogénea ADN etiqueta antes de la exposición a Dig-TMP seguido de etiquetado pulso de extensiones de replicación.

3. Cosecha de las células y el estiramiento de las fibras de ADN

1. Retirar la placa de la etapa, eliminar el medio y lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Eliminar la solución de PBS. Coloque una gota de 10 l de una tripsina comercial/ Solución de EDTA en la intersección de la cruz en el centro de la superficie de vidrio.
2. Incubar durante 3-4 min a temperatura ambiente (RT) y luego extraer la solución de tripsina con las células separadas en la punta de la pipeta. No hay necesidad de neutralizar la tripsina.
3. Coloque la gota de tripsina / EDTA con las células en un extremo de un portaobjetos de microscopio de vidrio silanizado. Lisar las células y liberar el ADN mediante la adición de 10 l de solución de SDS al 0,5% y se incuba durante 3-4 min a RT la mezcla suavemente con la punta de la pipeta, permitiendo que la periferia de la piscina a secar.
4. Inclinar la placa de 20º y permita que el líquido deteriorado hasta el final. Las fibras de ADN se amplían / ​​estirado por las fuerzas hidrodinámicas del líquido que fluye. Deje que el portaobjetos de aire seco (~ 10 min) y fijar en 3: 1 de metanol / ácido acético durante 10 min. Retire las diapositivas de la solución de arreglo y secar al aire de nuevo. En este punto se pueden almacenar indefinidamente en EtOH al 70% a -20 ° C. Al retirar del EtOH 70% dejar secar al aire antes de la nepaso xt.
5. Lavado de los portaobjetos en PBS, y luego desnaturalizar en HCl 2,5 M durante 1 h a TA. Este tratamiento depurinates hacer las nucleobases halogenados incorporados accesibles a los anticuerpos de ADN.
6. Neutralizar diapositivas en 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavar dos veces en PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) durante 5 min cada uno.
7. Bloquear desliza con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) y suero de cabra al 10% en PBS. Cubra los portaobjetos suavemente con un Parafilm para difundir la solución de bloqueo de manera uniforme sobre el portaobjetos y se incuba durante 1 h a TA.
8. Pipetear 100 l de dilución 1: 200 en solución de rata anti-bromodesoxiuridina bloqueo (detecta específicamente CldU) anticuerpo primario a cada diapositiva. Cubra los portaobjetos suavemente con un Parafilm para difundir la dilución de manera uniforme sobre el portaobjetos y se incuban en una cámara humidificada durante 1 hora a RT. Quitar la parafina y lavar los pocillos tres veces en PBST durante 5 minutos cada uno.
9. Pipetear 100 l de diluido (1: 100) de cabra anti-rata de Alexa Fluor 647 en solución a cada corredera de bloqueo. Cubrir eldesliza suavemente con un parafilm y se incuba durante 45 min a TA. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno.
10. Pipetear 100 l de diluido anti-bromodesoxiuridina (1:40) del ratón (detecta LDU y CldU Esta doble especificidad requiere el bloqueo de CldU por la rata anti BrdU en la incubación previa.) Anticuerpo primario y anticuerpo de conejo anti-DIG (1: 200 ) en solución a cada corredera de bloqueo. Cubra los portaobjetos suavemente con un parafilm y se incuba en una cámara humidificada durante 1 hora a RT. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno.
11. Pipetear 100 l de diluido (1: 100) de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 y c (1: 5000) sonda anti-conejo de cabra (por ejemplo, Qdot 655) en solución a cada corredera de bloqueo. Cubra los portaobjetos suavemente con parafilm y se incuba durante 45 min a TA. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno.
12. Drenar el exceso de PBST en una toalla de papel. Añadir 50 l de antifade medio de montaje sobre cada portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos. Imagen o tienda parano más de 48 h a -20 ° C.

4. Fibra de imagen por microscopía de fluorescencia

1. Realizar la adquisición de imágenes a través de un objetivo 63X en un microscopio invertido con una rueda de filtros motorizada completamente unida con FITC, Cy5 y Q del punto 655 de detección. El filtro de excitación es de 425 nm, y el filtro de emisión es 655 nm con 20 nm centrada en el pico de emisión ^20.

Resultados

ICL láser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) se pueden visualizar por inmunofluorescencia en contra de la Dig-tag vinculado al psoraleno. Aunque el láser puede ser dirigido de huelga en una superficie de cualquier contorno, rayas no son formas "naturales" en las células, y las señales legítimos se pueden distinguir fácilmente de los artefactos debido a la unión no específica por los anticuerpos primarios o secundarios. Esta característica es muy útil cua...

Discusión

La tecnología de localización láser requiere el uso de células adherentes con núcleos que son visibles en microscopía de campo claro. Hemos tratado de unir las células no adherentes, tales como linfocitos primarios, o células cultivadas de baja adherencia, tales como AD293, a la superficie de cristal con preparaciones adhesivas de células tales como polilisina o colágeno, o mezclas más complejas. Aunque estos tratamientos pueden unir las células a la superficie, nos encontramos con que por lo general se qued...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107