Métodos in vitro para comparar la unión de diana y la inducción de CDC entre anticuerpos terapéuticos: Aplicaciones en análisis de biosimilitud

Resumen

Este protocolo describe la comparación in vitro de dos características funcionales clave del rituximab: la unión al diana y la inducción de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos se emplearon para una comparación lado a lado entre el rituximab de referencia y un biosimilar de rituximab. Estos ensayos se pueden emplear durante el desarrollo biosimilar o como un control de calidad en su producción.

Resumen

anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) son relevantes para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo los cánceres. El desarrollo de anticuerpos monoclonales biosimilares por las compañías farmacéuticas es una oportunidad de mercado, pero también es una estrategia para aumentar la accesibilidad de drogas y reducir los costes asociados a la terapia. Los protocolos detallados aquí describen la evaluación de unión a la diana y la inducción CDC por rituximab en células Daudi. Estas dos funciones requieren diferentes regiones estructurales del anticuerpo y son relevantes para el efecto clínico inducida por rituximab. Los protocolos permiten la comparación de lado a lado de un rituximab referencia y un biosimilar rituximab comercializado. Los productos evaluados mostraron diferencias tanto en unión a la diana y la inducción CDC, lo que sugiere que hay diferencias fisicoquímicas subyacentes y poner de relieve la necesidad de analizar el impacto de esas diferencias en el entorno clínico. Los métodos aquí presentados constituyen simple y barato in vitro </ Em> para la evaluación de la actividad de rituximab biosimilares. Por lo tanto, pueden ser útiles durante el desarrollo biosimilar, así como para el control de calidad en la producción biosimilar. Además, los métodos presentados pueden extrapolarse a otros mAbs terapéuticos.

Introducción

Los anticuerpos terapéuticos son anticuerpos monoclonales recombinantes (mAbs) desarrollados para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes y crónicas, trastornos neurológicos y otros ¹ . Actualmente, la FDA ha concedido la aprobación a más de 40 mAb terapéuticos, y se espera que lleguen más al mercado en los años siguientes.

Rituximab es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidad aprobado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de células B CD20 ⁺ , LNH folicular CD20 ⁺ , leucemia linfocítica crónica y artritis reumatoide ^{2 , 3} . El reconocimiento de CD20, que está sobreexpresado en células B, por rituximab induce apoptosis; activación del complemento; Y citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) ³ . Las patentes de este fármaco expiraron en Europa y en los EE.UU. en 2013 y 2016, Respectivamente. Así, las compañías farmacéuticas en todo el mundo están desarrollando biosimilares de rituximab. Como en cualquier otro medicamento para consumo humano, los biosimilares requieren la aprobación de las agencias reguladoras. Directrices internacionales indican que para los mAbs, la biosimilaridad debe demostrarse mediante la comparación de las características físico-químicas, farmacocinéticas, la eficacia y la seguridad de los productos nuevos y de referencia [ ^4] .

Por consiguiente, las metodologías utilizadas en tales comparaciones deben evaluar las características estructurales y funcionales de los mAb, especialmente aquellos con relevancia clínica. Para ello, los ensayos in vitro muestran varias ventajas sobre los experimentos in vivo (revisados ​​en Chapman et al. ) ⁵ : i) los estudios in vitro son más sensibles a las diferencias entre el biosimilar propuesto y el producto de referencia; Ii) deben realizarse estudios in vivo en especies relevantes, que para muchos mAbs sonPrimates no humanos; Y iii) ya que el mecanismo de acción, la toxicología preclínica y los efectos clínicos del producto de referencia son bien conocidos, los estudios in vivo con biosimilares pueden no proporcionar información útil adicional. En consecuencia, la Orientación de la Unión Europea para biosimilares permite a los candidatos a entrar en ensayos clínicos basados ​​en sólidos datos in vitro sólo [ ^6] .

Presentamos dos ensayos rápidos, económicos y sencillos que evalúan la actividad biológica de rituximab utilizando células cultivadas con CD20 ⁺ . Estos ensayos pueden incluirse como parte del ejercicio de comparabilidad para los candidatos biosimilares de rituximab.

Protocolo

1. Evaluación de la unión de diana por citometría de flujo

1. Preparación de materiales biológicos y reactivos
   1. Hacer 500 mL de medio de cultivo RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (H-IFBS).
   2. Cultivo de linfoma Daudi Burkitt (Daudi) y células Daudi GFP ⁺ usando RPMI y frascos de cultivo de 75 cm2. Mantener los cultivos a 37 ° C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 hasta que alcancen 6 - 9 x 105 células / ml.
   3. Hacer 50 ml de tampón de tinción diluyendo 1/100 H-IFBS en PBS; Este tampón es estable a 2-8 ° C durante al menos un mes.
   4. Preparar las soluciones de prueba para los mAbs biosimilares y de referencia. Hacer diez diluciones en serie 1: 2 (500 μ l cada uno) en el tampón de tinción, a partir de 5 μ g / mL.
   5. Utilizar tampón de tinción para diluir la IgG humana (control de isotipo) a 5 μg / ml y IgG anti-humano de ratón PE-Cy5 (anticuerpo secundario)Sugerido por el fabricante.
   6. Preparar paraformaldehído al 4% en PBS (tampón de fijación).
2. Enlace de destino
   1. Se recogen las suspensiones de células Daudi y Daudi GFP ^{+ de} los matraces de cultivo de 75 cm2 y se transfieren a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
   2. Lavar las células mediante la adición de 5 ml de PBS y la centrifugación de la suspensión celular a 400 xg durante 5 min.
   3. Resuspender las células en PBS y realizar un recuento de células y el análisis de viabilidad con azul trypan. Utilizar cultivos con niveles de viabilidad celular ≥ 95% para el análisis.
   4. Diluir la suspensión celular a 4 x 106 células / ml con tampón de tinción fría.
   5. En tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 50 μl de la suspensión celular a 100 μl de las diferentes concentraciones de ensayo de los mAbs de referencia o biosimilares. Incluya repeticiones para cada condición experimental.
   6. Prepare tubos adicionales para(IgG1 humana en lugar de rituximab) y control negativo (anticuerpo secundario sin anticuerpo primario).
   7. Incubar a 4 ° C durante 20 - 30 min.
   8. Lavar las células mediante la adición de 1 mL de PBS y la centrifugación de la suspensión celular a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Deseche el sobrenadante.
   9. Suspender las células en 100 μl del anticuerpo secundario e incubar durante 20 - 30 min a 4 ° C, protegido de la luz.
   10. Lavar las células dos veces con PBS y suspenderlas en 200 μl de tampón de fijación.
   11. Analizar las células en un citómetro de flujo.
       NOTA: La señal permanece estable durante varios días si las muestras se almacenan a 4 ° C y se protegen de la luz.
3. Adquisición de datos
   1. Abra dos parcelas de puntos en una hoja de trabajo del software de operación del citómetro de flujo. Fije el FSC-A frente al FSC-H en el primero y el FSC-A frente al SSA-A en el segundo. Abra un histograma para el canal PE-Cy5.
   2. En el gráfico FSC-A versus FSC-H, haga una puerta (R1) seleccionando eventos singulares ( Figura 1A ).
   3. Establezca la población R1 en el diagrama de puntos FSC-A versus SSA-A y luego haga una nueva puerta (R2) seleccionando las células objetivo ( Figura 1B ). Establezca la población de R2 en el histograma de intensidad PE-Cy5 para ver la distribución de frecuencia de las células.
   4. Ajuste el límite inferior de intensidad de fluorescencia (FI) para el canal PE-Cy5 usando el control negativo y de isotipo ( Figura 1C ).
   5. Adquirir 10.000 eventos dentro de R2 de la muestra con la mayor concentración del producto de referencia. FI de esta muestra debe ser el más alto esperado ( Figura 1C ].
   6. Adquirir el resto de las muestras.
   7. Para cada muestra, obtenga la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) en el canal PE-Cy5.
   8. Para muestras con el mAb de referencia o biosimilar, calcule la diferencia entre la MFI de muestra y la del control de isotipo (ΔMFI).

2. Evaluación de los CDC

1. Preparación de materiales biológicos y reactivos
   1. Preparar las células medio de cultivo celular y la cultura Daudi y Daudi GFP ⁺ como se describe anteriormente (pasos 1.1.1 - 1.1.2).
      NOTA: Además, el ensayo CDC requieren RPMI sin suero.
   2. Diluir normal de complemento de suero humano (NHSC) 1: 2 con medio RPMI libre de suero. Preparar 2,5 ml.
   3. Preparar 1 ml de inactivado por calor (30 min / 56 ° C) NHSC diluido 1: 2 con medio RPMI.
   4. Preparar conjuntos de soluciones de ensayo para la referencia y mAbs biosimilares en RPMI libre de suero. Hacer diez diluciones (200 l cada una) de 1 a 0.025 g / ml.
2. ensayo de CDC
   1. Recoger las células Daudi y Daudi GFP ⁺ procedentes de los cultivos y cuantificar la viabilidad celular (consulte los pasos 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Preparar una suspensión de células con 4 x 10 ⁵ células / ml en RPMI libre de suero.
   3. Añadir50! L de suspensión de células a 50 l de cada referencia o concentración de ensayo mAb biosimilar en 96 pocillos cónica (V) -fondo microplacas. Incluir repeticiones para cada condición experimental.
   4. Preparar pozos adicionales para el control negativo (es decir, sin mAb), control de la muerte basal (es decir, inactivado por calor NHSC en presencia de mAb), y el control positivo de tinción (es decir, células expuestas a 50 l de EtOH al 70%).
   5. Se incuban las células durante 20 - 30 min a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5% humidificada.
   6. Añadir 50 l de NHSC (diluido 1: 2) a cada pocillo e incubar las células opsonizadas durante 2,5 horas a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5% humidificada. Utilice NHSC inactivado por calor en los pocillos de control muerte basales.
   7. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar el sobrenadante.
   8. Lavar las células mediante la adición de 150! L de PBS y centrifugando la suspensión de células durante 5 min a 400 xg y 10 ° C. diScard el sobrenadante.
   9. Mancha las muestras con 7-aminoactinomicina (7-AAD), como se describió anteriormente ^{7 , 8} .
   10. Analizar las células en un citómetro de flujo en el mismo día.
3. Adquisición de datos
   1. Abra dos parcelas de puntos en una hoja de trabajo del software de operación del citómetro de flujo. Fije las parcelas como en los pasos 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Cree una tercera parcela que sea un diagrama de puntos para GFP versus 7-AAD en la población de R2.
   2. Definir los límites adecuados FI utilizando las células Daudi, células Daudi GFP ⁺ , y el control de muerte positiva ( Figura 2C ].
   3. Para cada muestra, mida el porcentaje de células diana 7-AAD ⁺ . Adquirir al menos 5.000 eventos de R2.
   4. Calcular la citotoxicidad inducida por el mAb específico restando el porcentaje de 7-AAD ⁺ en el control basal de muerte del porcentaje encontrado en muestras con diferenciasDe concentraciones de mAbs ( Figura 2D ).

3. Análisis de biosimilitud

1. Introduzca los valores de concentración y respuesta en un software gráfico.
2. Generar gráficos y calcular las regresiones no lineales con las siguientes consideraciones: i) utilizar la transformación logarítmica de la concentración de mAb como "X"; Ii) utilizar el modelo matemático de pendiente variable (Y = respuesta mínima + (respuesta máxima - respuesta mínima) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * pendiente de pendiente)); Y iii) limitan los valores inferiores a cero, ya que se ha restado la respuesta basal.
   NOTA: Se esperan curvas con una forma sigmoidal simétrica.
3. Comparar ambos ajustes no lineales con un ajuste global usando una prueba F (muchos programas de software de gráficos incluyen esta característica).
   NOTA: Estas pruebas establecen como hipótesis nula que la respuesta máxima, logEC ₅₀ , y la pendiente de Hill son los mismos para los dos conjuntos de datos, que coincide con elpregunta biológico destinados a tratar.

Resultados

Usando los protocolos descritos anteriormente, se comparó la unión de diana y la inducción de CDC de rituximab de referencia en paralelo con las de un rituximab biosimilar producido y comercialmente disponible en Asia.

En las células de Daudi, ambos mAbs se unieron a CD20 de una manera dependiente de la concentración ( Figura 1D ). Las regresiones no lineales de datos de unión mostró un r ² d...

Discusión

La expiración de la patente de un mAb terapéutico está promoviendo el desarrollo de los biosimilares. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos simples que pueden identificar diferencias en las actividades de relevancia clínica de estos productos. Se emplearon células CD20 ⁺ cultivadas para la evaluación de dos características funcionales clave de rituximab: unión a la diana y la inducción CDC. La actividad anterior requiere el reconocimiento de CD20 por la región Fab del mAb, mientras que el ?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.