Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

Resumen

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Resumen

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introducción

Células T CD4 ⁺ son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 ⁺ vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local ^1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también están implicados en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple y psoriasis ^{2, 3.} Células Th17 humanos pueden ser generados a partir de células T CD4 ⁺ vírgenes in vitro, proporcionándoles un ambiente de polarización apropiado ^4. Vario nos combinaciones de las citoquinas IL-1β, IL-23, TGF, y IL-6 se han utilizado para el desarrollo de las células Th17 humanos. Células Th17 humanos expresan CCR6, un receptor de quimioquinas que se utiliza comúnmente para identificar esta población de células y se define por la expresión de su director factor de transcripción, RORγt (codificada por RORC) ^{5, 6.} células Th17 tienen la capacidad de expresar múltiples citocinas, pero IL-17A es la citoquina efectora linaje-definir producido por estas células. Se examinó la expresión de los tres marcadores Th17-asociado (CCR6, RORγt, IL-17A) para evaluar la solidez de nuestro ensayo de diferenciación humana Th17 in vitro. Además, se cultivaron células T CD4 ⁺ humanas en condiciones no polarización, donde no se añadieron citoquinas o anticuerpos de bloqueo a los medios de cultivo para su uso como un control negativo ya que la expresión de estos marcadores Th17 debe ser muy baja o ausente.

ve_content "> Una manera de estudiar el desarrollo humano normal T biología celular y es manipular la expresión génica durante su desarrollo.-ARN corto de interferencia (ARNsi) son pequeñas moléculas de ARN sintéticos que se dirigen a ARNm codificantes de proteínas y pueden ser utilizados para reducir la expresión de genes específicos . microARNs (miARN) son endógenos no codificantes ARN pequeños conocidos para modular la expresión del gen post-transcripcionalmente. miRNAs han sido demostrado que desempeñan un papel importante tanto en murino y la biología de células T humanas, incluso en las células Th17 ^{7, 8, 9.} se es crucial tener métodos fiables de manipulación de la actividad de ARN pequeño en las células T humanas para estudiar sus efectos sobre la expresión de genes y en última instancia, sobre la biología de células T humanas. a continuación, describimos un protocolo fácil de uso, consistente y fiable que hemos desarrollado para introducir pequeños RNAs sintéticos y ácidos nucleicos bloqueados (LNA, modificar químicamente los ácidos nucleicos con una mayor estabilidad)en células inmunes, y específicamente en células Th17 humanos.

Hay varios métodos alternativos de introducción de pequeños ARN en células de mamífero, que generalmente se dividen en categorías químicas, biológicas o físicas ^10. métodos químicos normalmente usados, incluyendo transfecciones basadas en lípidos y transfecciones de calcio-fosfato, se basan en la creación de complejos de ADN-químico que se toman más eficientemente por las células. En general, los métodos químicos no son tan eficientes para la transfección de células T primarias. El método biológico más común es usar un vector viral (por ejemplo, retrovirus o lentivirus), que inserta directamente ARN extraño en un huésped como parte de su ciclo de replicación natural. transducción viral típicamente tarda más tiempo en completar, especialmente cuando se toma en cuenta el tiempo para la clonación molecular de los plásmidos proviral. Además, los vectores virales de transducción pueden ser potencialmente dañinos para los investigadores humanos. La electroporación es un m físicaétodo de inducir permeabilización de la membrana sometiendo las células a pulsos de alto voltaje, permitiendo que los ácidos nucleicos para introducir transitoriamente en la célula donde pueden actuar en su objetivo. instrumentos de electroporación tradicionales no eran eficaces para transfectar linfocitos primarios. Sin embargo, optimizado siguiente electroporación generación ha demostrado ser capaz de transfectar las células T a muy alta eficiencia, especialmente cuando el material a transfectar es pequeño ARN. El término próxima generación se utiliza libremente para diferenciar las dos plataformas más recientes (por ejemplo, neón, Amaxa) de máquinas de electroporación tradicionales. Además, este método es fácilmente escalable para pantallas de rendimiento moderados con hasta aproximadamente 120 pequeños RNAs en un solo experimento, a menudo utilizando reactivos sintéticos validados. Es importante destacar que las transfecciones con éxito se puede lograr en tan poco como 16 h después de la activación de células T. La desventaja de este método, sin embargo, es que no da como resultado de plástic genómico establesucesivamente, y es por lo tanto transitoria. Por lo tanto, vale la pena el esfuerzo extra para crear una construcción de expresión estable que puede ser empaquetado en un vector viral y se expresó con éxito en las células T en los casos en que se requiere la expresión a largo plazo de un pequeño ARN.

Hemos utilizado una próxima generación de transfección (por ejemplo, neón) para ofrecer diversas herramientas sintéticos individuales o de doble hebra de ARN o de oligonucleótidos LNA para diferentes propósitos ^{11, 12, 13.} la interferencia de ARN eficiente puede ser inducida en el ratón primario y las células T humanas utilizando ARN-interferencia corto de doble hebra (siRNA). Este protocolo describe condiciones optimizadas para el uso de esta técnica en las células Th17 humanos. Además de siRNAs, disponibles comercialmente imita e inhibidores de miARN sintéticos pueden ser utilizados para estudiar el aumento de miARN y pérdida de función. imita miARN son moléculas de ARN de doble cadena muy similares a siRNAs, pero designed con la secuencia de miRNAs maduros endógenos. inhibidores de miARN están químicamente modificados de ARN y / o LNA basado oligonucleótidos monocatenarios que se unen a miRNAs nativas y antagonizan su función. Hemos encontrado que todas estas herramientas se pueden utilizar de manera efectiva en los linfocitos T primarias cultivadas, incluyendo pero no limitado a las células Th17 humanos.

Protocolo

Este protocolo se adhiere a las directrices de la UCSF para la ética de investigación en humanos.

1. Preparación de T cultivo celular, el aislamiento de células T CD4 ⁺ y la polarización Th17

1. En el Día 0, capa placas de cultivo tisular de 6 pocillos con 1,5 ml por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm.
2. Preparar las células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   PRECAUCIÓN: Trabajar con cuidado y asegurar que el equipo de protección personal (EPP) se utilizar para la manipulación de la sangre humana para evitar cualquier riesgo de exposición a patógenos transmitidos por la sangre.
3. Una vez que se han aislado y se lavó las células mononucleares, lleve a cabo el aislamiento de células T CD4 ⁺ humano por sele negativocción utilizando un kit comercial de células T CD4 humano ^+.
   NOTA: Si hay contaminación de glóbulos rojos después del aislamiento de células mononucleares, una lisis de glóbulos rojos opcional puede llevarse a cabo antes de las etapas de aislamiento de células T CD4 ^+. Resuspender las células mononucleares en 1 ml de tampón de aislamiento (2% de FBS en PBS). Añadir 5 ml de solución de lisis 1x. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, añadir 5 ml de tampón de aislamiento y se centrifuga a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células.
   1. Resuspender las células mononucleares a una densidad de 50 x 10 ⁶ por 500! L en el tampón de aislamiento en un nuevo tubo de 5 ml.
   2. Añadir 100 ml de FBS y 100 l de la mezcla de anticuerpo por tubo a continuación, incubar cada tubo a 4 ° C durante 20 min en un agitador orbital a mezclar bien.
   3. Después de la incubación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento para lavar las células. Centrifugar las células a 300 xg durante 8 minutos a 4 ° C para sedimentar las células. aspirar con cuidado la supernatant.
   4. Durante este giro, antes de lavar las perlas magnéticas. Transferir la cantidad deseada de perlas magnéticas en un nuevo tubo (utilizado a 1: 1 con las células) y se añade un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas. Mezclar bien usando una micropipeta ml 1 y luego colocar el tubo en el imán durante al menos 1 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las perlas magnéticas en el mismo volumen inicialmente transferido antes de la colada.
   5. Resuspender las células en cada tubo con 500! L del tampón de aislamiento y añadir 500 l de perlas magnéticas pre-lavado.
   6. Se incuban las células con las perlas magnéticas durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para mezclar bien.
   7. Después de la incubación, pipetear a fondo las células utilizando una micropipeta de 1 ml, al menos 10 veces. A continuación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante 2 min.
   8. Transferir cuidadosamente las células T CD4 ⁺ seleccionadas negativamente que se encuentran enel sobrenadante a un nuevo tubo.
4. Una vez que se ha completado el aislamiento de células T CD4 ^+, contar las células con un hemocitómetro y mantener las células en hielo.
5. Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 1,5 ml de 2x mezcla de medios Th17-polarizar a cada pocillo: IFN anti-humano (20 g / ml), anti-IL-4 humana (20 mg / ml), TGF humano (10 ng / ml), humana IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 humana (50 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol).
   NOTA: La transfección y la interferencia de ARN hace el trabajo en medios que contienen suero. El propósito de usar medios libres de suero con este protocolo es para lograr una mejor producción de IL-17A.
6. Centrifugar las células T CD4 ⁺ humanos a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Aspirar con cuidado la Supernathormiga. Entonces resuspender las células en medios de base libre de suero y la placa de las células a una densidad de 3 x 10 ⁶ en 1,5 ml por pocillo de modo que el volumen final es de 3 ml por pocillo y las citocinas polarizantes están ahora a una concentración final de 1x.
   1. Colocar las placas en 5% de _CO2, 37 ° C incubadora durante dos días.

2. Las células Electroporación de In Vitro Polarized Th17 humana

1. En el Día 2, la capa de placas de cultivo tisular de 48 pocillos con 250! L por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm.
2. Preparar pequeños ARN para la transfección. Para cada transfección, alícuota de 1 l de una 5 M solución madre de siRNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incluir pequeñas contr ARN química con ajuste apropiadool. Mantenga todos los tubos en hielo.
3. Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 500 l de 1X Th17-polarizando medios de comunicación a cada pocillo: IFN anti-humano (10 g / ml), anti-IL-4 humana (10 mg / ml), TGF humana (5 ng / ml), IL-humana 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 humana (25 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol).
4. Después se preparan las placas de cultivo y reactivos de transfección, resuspender las células con un 1 ml micropipeta, pipeteado suave pero que garantiza que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Reunir las células en un tubo cónico y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
   NOTA: Para los períodos de cultivo más largo que el protocolo de cuatro días presentado en el presente documento, las células deben transfectarse aproximadamente cada 3 días usando este mismo protocolo. Paso 20.4 debería modificarse sin embargo ya que las células tratadas con diferentes ARNs pequeños no se mezclarán. Todas las condiciones se están probando debe recogerse, contados, y se transfectaron por separado.
5. aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego volver a suspender las células en al menos 1 ml de PBS para lavar. Contar las células Th17 en vivo (por ejemplo con un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano para evaluar la viabilidad) y luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga.
6. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar las células.
7. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego resuspender las células usando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit de sistema de transfección 10 l a una densidad de 2,5-4 x 10 ⁷ células por ml. Mantener las células a temperatura ambiente.
   NOTA: Como pauta, tratar de preparar sólo como muchas células como se puede transfectadas dentro de 30 min. Varios lotes se pueden comparar.
8. Añadir 9 l de células a 1 l de ARN pequeño en cada MicroCtubo entrifuge. Pipetear una vez para mezclar las células y los pequeños ARN para la transfección a continuación, cargar en la punta del electrodo pipeta proporcionado.
   NOTA: Típicamente, añadir 9,5! L de suspensión de células para asegurar que hay suficiente de la mezcla para evitar la creación de burbujas en la punta del electrodo de pipeta antes de la transfección.
9. Llenar la cubeta proporcionado con 3 ml de temperatura ambiente electrolítico Buffer E. Place la cubeta dentro de la estación de pipeta y luego colocar la pipeta en posición dentro de la cubeta.
10. Inmediatamente electroporar cada 10? L de la mezcla de células y pequeños ARN utilizando los siguientes parámetros: voltaje de impulso 1,500-1,550 V, anchura de impulso de 10 ms, y 3 pulsos total en el dispositivo de la transfección.
11. Después de la electroporación es completa, añadir directamente a la mezcla de células a 500 l de medio 1X Th17 polarizante en pozos preparados de una placa de cultivo. Placas lugar en un 5% de _CO2, 37 ° C incubadora durante dos días más.
    NOTA: Lavar la punta del electrodo pipeta pipeteandoarriba y abajo en PBS entre cada transfección.

3. Las células de cosecha Th17 humana

1. Resuspender las células en medios de cultivo con una micropipeta, pipeteando suavemente pero asegurando que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Preparar las células para ensayos de expresión funcionales y / o de genes.
   NOTA: Rutinariamente, suficientes células se produjeron a partir de un único pocillo de células Th17 transfectadas para ser utilizado para el análisis de citometría de flujo de marcador de superficie e intracelular de citoquinas y factor de transcripción tinción o para la preparación de ARN para el análisis de la expresión génica.

Resultados

El primer paso para desarrollar un sistema fiable de electroporación con éxito células Th17 humanos era generar robusto en cultivos de células Th17 humanos in vitro diferenciados. Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes expresan el receptor de quimiocinas CCR6 y el factor de transcripción RORγt (Figura 1A, izquierda). Estos marcadores no se expresaron cuando se cultivaron las células T en condiciones no polarizante (THN)

Discusión

Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 ⁺ vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cult...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use