Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

Resumen

Transporte iónico celular a menudo puede evaluarse mediante el control de pH intracelular (pH). Genéticamente codificada pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH intracelular en las células intactas. Este protocolo detalla la cuantificación de pH intracelular a través de celular ex vivo vivo-proyección de imagen de los túbulos de Malpighi de la Drosophila melanogaster con pHerry, un pseudo-radiométrica genéticamente codificada en indicador de pH.

Resumen

Transporte iónico epitelial es fundamental para la homeostasis de iones sistémica así como el mantenimiento de gradientes electroquímicos celulares esenciales. PH intracelular (pH) está influenciado por muchos transportadores de iones y así control de pH es una herramienta útil para evaluar la actividad de transportista. Moderno codificado genéticamente pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH en las células intactas a escala celular y subcelular. Este protocolo describe la cuantificación en tiempo real del pH celular Reglamento en túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster por ex vivo vivo-proyección de imagen de pHerry, un pseudo-radiométrica GEpHI con un pK_un adecuadas para el seguimiento de los cambios de pH en el citosol. Mosca adulta extraída MTs se componen de secciones morfológicamente y funcionalmente distintas de epitelios capa unicelular y pueden servir como un modelo accesible y genéticamente manejable para la investigación del transporte epitelial. GEpHIs ofrece varias ventajas sobre los convencionales tintes fluorescentes sensibles a pH y electrodos ion-selectivos. GEpHIs puede etiquetar poblaciones celulares distintas siempre elementos promotor apropiado están disponibles. Este etiquetado es particularmente útil en ex vivo, en vivoy en situ preparados, que son inherentemente heterogéneos. GEpHIs también permiten la cuantificación de pH_i en tejidos intactos en el tiempo sin necesidad de externalización de tratamiento o tejido tinte repetidas. El principal inconveniente de GEpHIs actual es la tendencia a agregar en inclusiones citosólicas en respuesta al daño tisular y construir sobre expresión. Estas deficiencias, sus soluciones y las ventajas inherentes de GEpHIs se demuestran en el presente Protocolo mediante la evaluación del transporte de protones (H⁺) basolateral en células principales y radiadas funcionalmente distintas de mosca extraído MTs. Las técnicas y análisis descritos son fácilmente adaptables a una amplia variedad de vertebrados e invertebrados preparados y la sofisticación del análisis puede ampliarse desde laboratorios a intrincados determinación del flujo de iones a través de transportadores específicos de enseñanza.

Introducción

El objetivo de este protocolo es describir cuantificación de pH intracelular (pH_i) utilizando un genéticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) y demostrar cómo este método puede utilizarse para evaluar transporte basolateral H⁺ un insecto modelo (D. melanogaster) estructura renal, los túbulos de Malpighi (TM). MTs sirven como los órganos excretores de la mosca de la fruta y son funcionalmente similares a la nefrona mamífera en varios aspectos clave¹. MTs se arreglan como 2 pares de túbulos (anteriores y posteriores) en el tórax y el abdomen de la mosca. El sola célula epitelial tubo de cada MT está compuesto por metabólicamente activas principales células con distinta apicales (luminal) y basolateral (hemocoel) polaridad así como células radiadas intercaladas. Anteriores MTs se componen de 3 morfológico, funcional, y con distintos segmentos, en particular la inicial dilatada segmento, segmento de transición y secretor principal segmento, que une el uréter². En la escala celular transporte trans epitelial ion en el lumen se logra por una membrana plasmática apical V-ATPasa³ y un intercambiador⁺ de álcali-metal/H así como un basolateral Na⁺-K⁺-⁴de la ATPasa, hacia adentro-rectificador K⁺ canales⁵, Na⁺-conducido Cl⁻/HCO₃⁻ intercambiador (NDAE1)⁶y Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, mientras que células radiadas median Cl^– y agua transporte^8,9. Este sistema fisiológico complejo pero accesible ofrece excelentes oportunidades para la investigación de mecanismos de transporte iónico endógeno cuando se combinan con los diversos conjuntos de herramientas genéticas y de comportamiento de Drosophila.

La justificación de este protocolo fue describir un sistema genéticamente maleable para el estudio de transporte iónico epitelial con potencial para la integración de la célula de a conducta y exportación de herramientas para otros sistemas modelo. Expresión de pHerry¹⁰, un GEpHI derivada de una fusión de verde pH-sensible Super eclíptica pHluorin^11,12 (SEpH) y rojo mCherry insensible pH¹³, MTs permite la cuantificación del transporte de H⁺ en MT las células a través de la alta K⁺/nigericin calibración técnica¹⁴. Medida que muchos transportadores de iones equivalentes de H⁺ , cuantificación de pH intracelular sirve como una representación funcional de movimiento de iones a través de una variedad de transportadores. El sistema de modelo de Drosophila MT también ofrece potentes herramientas genéticas en tejidos específicos del transgén¹⁵ y RNA de interferencia (ARNi)¹⁶ expresión, puede combinarse con la proyección de imagen de celular y todo órgano ensayos^{17 , 18 , 19} de la función del túbulo para crear un sólido conjunto de herramientas con integración vertical de las moléculas al comportamiento. Esto contrasta con muchos otros protocolos para evaluar biología epitelial, como históricamente tales medidas han confiado en el intrincado y difícil electrodos ion-selectivos micro disección, sofisticado^20,21, y caro pH-sensible tintes²² con requisitos de carga restrictiva y pobre especificidad celular en tejidos heterogéneos. GEpHIs se han utilizado para medir el pH en una gran variedad de tipos de célula²³extensivamente. Trabajo temprano explota la inherente sensibilidad al pH de la proteína fluorescente verde (GFP) para controlar el pH en células epiteliales cultivadas²⁴ pero las dos últimas décadas han visto utilizado en neuronas²⁵, glia²⁶, hongos^{27 GEpHIs} , y²⁸de las células de la planta. La combinación de las posibilidades de orientación celular de construcciones genéticas a través de la expresión de GAL4/UAS sistema¹⁵ y la accesibilidad fisiológica de la Drosophila MT hacen de esta una preparación ideal para las investigaciones de pH_i regulación y transporte iónico epitelial.

regulación de pH ha sido estudiado durante décadas y es vital para la vida. La preparación de MT ofrece un modelo robusto para enseñar fisiología de la regulación de pH pero también realizar sofisticadas investigaciones de pH_i regulación ex vivo e in vivo. Este protocolo describe la cuantificación del movimiento de la H⁺ a través de la membrana basolateral de las células epiteliales de la Drosophila MT con NH₄Cl ácido de pulso carga técnica²¹, pero como el indicador de pH es genéticamente codificada, estos métodos y su marco teórico se pueden aplicar a cualquier preparación favorable a la transgénesis y las imágenes en vivo.

Protocolo

Todos los pasos de este protocolo cumplen con las directrices de uso de animales de la Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. cría de la mosca

1. Levante vuela y conjunto de cruces según estándar cría²⁹.
   Nota: La expresión del reportero fluorescente por el sistema de GAL4/UAS es proporcional a la temperatura y así cría de temperatura se puede ajustar para alterar el nivel de expresión. Mientras que niveles altos de expresión a menudo conducen a una mejor relación señal a ruido esta condición también está asociada con aumento citosólicas y organellar agregados cuando usando GFP a la fusión de la proteína fluorescente roja (RFP) construye como pHerry^{10, 30,31}. Si la agregación es inevitable, la cuantificación es posible mediante la realización de calibraciones en cada experimento y normalización de datos tal que punto un cociente de la fluorescencia de 1.0 corresponde al pH 7.0 (ver paso 7.4 Nota sobre calibración más abajo).
2. Establecer cruces de homocigótica capaR-GAL4³² machos homocigóticos pHerry UAS¹⁰ hembras vírgenes y homocigótica c724-GAL4² machos a homocigótica UAS pHerry hembras vírgenes para permitir la proyección de imagen de pH en las células principales y células radiadas de la MT, respectivamente. Lugar 6 UAS-pHerry hembras con 3 machos de GAL4 en frascos frescos del alimento y dejar mate a 28 ° C.
   Nota: Las larvas deben ser evidentes dentro d 4 y adultos comenzará a eclose alrededor del día 10.
3. Recoger las moscas hembra en eclosión y apartar a la edad de 10 días a 28 ° C.
   Nota: El tiempo de experimentación se puede ajustar para que coincidan con cualquier análisis comportamiento restrictivos (como Ramsay secreción ensayo^17,19) que se correlaciona a la imagen del pH intracelular en. Pueden utilizar moscas macho pero los túbulos de las hembras son a menudo más grande y más robusto.

2. preparación de portaobjetos de poli-l-lisina.

1. Dibujar un borde de 40 x 20 mm con una pluma PAP hidrofóbica alrededor de la parte superior de diapositivas estándar 75 x 25 mm y dejar de lado que se seque durante 15 min a cubreobjetos grande RT. uso si las diapositivas no son compatibles con la proyección de imagen óptica.
2. Transferir 2 mL de solución 0.01% Poly-L-lisina (PLL) en cada diapositiva y deja reposar durante 1 h a TA.
3. Retire el exceso PLL con una pipeta. Guardar la solución en un frasco cónico de 50 mL para uso futuro. Almacenar a 4 ° C.
4. Aspirar cualquier resto de solución con una línea de vacío. Ejecutar la línea de vacío sobre la superficie del portaobjetos todo para garantizar que no hay solución en las diapositivas.
5. Configurar las diapositivas para 1 h adicional en antes RT. Almacenar las diapositivas seco a temperatura ambiente hasta por 1 mes en un libro de diapositiva estándar.

3. preparación de plato y varillas de vidrio de disección

1. Añadir 0,5 mL de agente de curado de elastómero a 4,5 mL de elastómero base en un poliestireno de 35 x 10 mm plato de Petri a temperatura ambiente para producir una profundidad de 5 mm. mezclar con una pipeta desechable. Permiten elastómero curar O/N a TA.
   Nota: Elastómero debe ser clara y libre de burbujas. Claro de burbujas puede facilitarse manteniendo las placas de elastómero en un tarro vacío de 10-15 min después de verter.
2. Sostener una varilla de vidrio de 5 mm de diámetro entre las manos y derrita el centro de la varilla en un mechero de Bunsen encendido mientras tira de los extremos separados. Como el vidrio se funde Tire más rápidamente para producir un fino (0.1 mm) y eje cónico (figura 1).
   Nota: Un ángulo de 45 ° en la caña es a menudo útil en el manejo de los túbulos. Esto se logra bajando una mano como se tira la caña (ver figura 1).
3. Romper el eje de la fino en el centro con el lado embotado de una cuchilla de un solo filo acero al carbono. Inspeccione el extremo fino de la varilla en un ámbito de disección para asegurar que la rotura es limpia.

Figura 1: Fabricación de varillas de vidrio para el manejo de los túbulos de Malpighi.
A - E. Proceso de calentamiento y tirando de una varilla de vidrio para producir una forma cónica y del ángulo conveniente para manejar mts. flechas denotan dirección y magnitud de la fuerza a aplicar. F. fotografía de un instrumento de vidrio fabricado adecuadamente. Barra de escala = 10 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. preparación de soluciones y sistema de perfusión

Nota: Sistemas de perfusión difieren según el fabricante. Este protocolo se basa en un depósito abierto 8 canales de gravedad con un regulador de velocidad de flujo de entrada y una salida basada en el vacío, pero el método de montaje MTs como se describe aquí pueden ser adaptados para trabajar con cualquier sistema de perfusión.

1. Preparar las siguientes soluciones:
   1. Medio (40 mL en frascos cónicos de 50 mL) alícuota Schneider y almacenar a 4 ° C.
   2. Preparar soluciones (es decir, insectos Phosphate-Buffered salina (EICP) y EICP con NH₄Cl) a temperatura ambiente cuando sea necesario según tabla 1). Soluciones calientes RT antes del uso en el día del experimento.
      Nota: EICP EICP con 40 mM de NH₄Cl puede ser preparados en grandes volúmenes (1 L o más) y almacenados a 4 ° C.
   3. Preparar 8 soluciones de calibración en volúmenes de 500 mL a pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 y 9.0, como se indica en la tabla 1 y almacenar a 4 ° C. Ajustar el pH de cada solución por titulación con N-metil-D-glucamine (NMDG) y ácido clorhídrico.
   4. En el día de los experimentos, caliente alícuotas de 5 mL de soluciones de calibración a RT y agregar solución de nigericin stock (20 mM en dimetil sulfóxido (DMSO)) para producir una concentración final de 10 μm.
      PRECAUCIÓN: Manipule nigericin con guantes. Tratar a todo el equipo que entra en contacto con nigericin como desechables. Nigericin sigue siendo en vidrio y plástico y pondrá en peligro biológico Preparaciones si equipo se reutiliza.
2. Sistema de perfusión:
   1. Cebe el sistema de perfusión por llenar los depósitos con ddH₂O (figura 2). Abra los canales uno a la vez permitir que todas las líneas proximal para el regulador de velocidad de flujo para llenar.
      Nota: Puede ser necesario limpiar el aire de las líneas abriendo el canal estancado y utilizando un émbolo al flujo de la unidad de la reserva.
   2. 2 canales abiertos y permiten ddH₂O al desagüe. Una vez que los embalses están casi vacíos, se llenan el primer depósito EICP y el segundo depósito con NH₄Cl-pulsada EICP. Establecer el caudal máximo con el regulador de velocidad de flujo hacer durante 1 minuto llenar las líneas distales de cada solución y detener el flujo (figura 2).
   3. Posición 2 juegos de pinzas "ayudando a las manos" de soldadura en la platina del microscopio de proyección de imagen. Coloque una abrazadera a cada lado de la plataforma de proyección de imagen.
   4. Calentar cuidadosamente el distales 0.5 pulgadas de un pedazo de vidrio capilar (diámetro interno de 1.5 mm, diámetro externo 0.86 mm, longitud 100 mm) sobre un mechero de Bunsen. Crear una curva de 45 ° por lo que el extremo distal a la curva por gravedad y quitar el cristal del fuego una vez que se obtiene el ángulo deseado. Repita este proceso con una segunda pieza de vidrio capilares.
   5. Inserte los tubos capilares de vidrio doblado en la línea de flujo y la línea de vacío conectado de la salida, respectivamente y montarlos en las "manos" para alinear con la etapa de proyección de imagen del microscopio (figura 3).

Figura 2: Sistema de perfusión y configuración de la imagen.
Componentes necesarios para la evaluación fisiológica de la función de transporte basolateral de MT a través de simultánea en vivo cambio de fluorescencia proyección de imagen y rápida solución. Líneas de gas se muestra son opcionales y permiten la expansión de experimentos para la evaluación del transporte HCO₃^– . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Esquema del flujo de perfusión aparatos de NH₄Cl pulso experimentos.
Flechas representan la trayectoria del flujo y válvula de conmutación puntos. La solución pasa de depósito a muestra por flujo de gravedad y se extrae de la cámara de muestra al matraz de residuos por la succión del vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. disección de los túbulos de Malpighi Anterior adulto Drosophila .

1. Recoger el plato de disección y sacó la varilla de vidrio de sección 3, un portaobjetos recubierto de PLL de la sección 2, un divisor de perfusión-bien adhesivo, grasa para vacío, una tira de 4 x 2" de la película, 2 pares de #5 finas pinzas y alícuotas de 40 mL de medio y RT EICP helada Schneider.
2. Difundir la grasa para vacío en el precinto y pulse el divisor de perfusión-bien adhesivo en cinta para cubrir el fondo con grasa. Despegue el adhesivo divisor de perfusión-bien y colocar grasa hacia abajo sobre un portaobjetos recubierto de PLL. Retire el divisor de perfusión-bien para dejar a muestra individual de pozos en grasa hidrofóbica.
3. Lugar 200 μL del EICP RT en el cercado de grasa bien en el portaobjetos recubierto de PLL y córralo bajo el estereoscopio.
4. Lugar UAS-pHerry/capaR-GAL4 moscas en un vuelo vacío del frasco y anestesiar en hielo durante 10 minutos.
   Nota: Este método de la anestesia, a diferencia de CO₂, asegura que las moscas no deshidratan.
5. Vierta medio helada de Schneider en la disección y pinzas finas para transferir una sola mosca hembra anestesia en el plato bajo un estereoscopio de disección.
6. Mantener la marcha por el tórax con un conjunto de pinzas y el otro para agarre suavemente la parte posterior del abdomen. Abra la parte posterior de la mosca usando las pinzas, movimientos deliberados. Una vez visible el hindgut, agarre el extremo distal y sin la tripa y MTs tracheoles subyacentes tirando el hindgut lejos del cuerpo a través de remolcadores repetitivos, breve.
   Nota: Los metros anteriores y posteriores serán visibles donde se encuentran el cruce del midgut y hindgut a través del uréter. El primer par de MTs a libre voluntad probable ser los túbulos posteriores rodean al intestino grueso. Estos pueden ser ignorados (Figura 4A).
7. Una pizca de las anteriores MTs en el uréter con pinzas finas una vez que el segundo conjunto de MTs está libre del abdomen. Esto separa el anterior MTs en el intestino y cerrar el uréter.
8. Recoger las libres MTs anteriores con la varilla de vidrio tirado deslizando la varilla bajo el uréter tal que los túbulos a los lados. Levante el MTs recto fuera de la solución.
9. Gire la varilla de vidrio que la MTs y el uréter se adhieren a la parte inferior de la varilla y bajan el uréter derecho en la diapositiva. Afijo el uréter y selle los extremos distales de las MTs presionando el uréter sobre el portaobjetos de cristal (Figura 4B). No manipule el MTs más que necesario. El MTs deben estar flotando en la solución con el uréter a la diapositiva.
10. Utilice el extremo fino de la varilla de vidrio para barrer suavemente cada túbulo a través de la superficie del portaobjetos. Apoyo de la barra contra el portaobjetos para evitar aplastar el túbulo y deslice la varilla por encima de los túbulos, movimiento distal a la proximal, para unir toda la longitud de cada túbulo a la superficie del tobogán cubierto de PLL (figura 4).
11. Coloque el adhesivo divisor de perfusión-bien en la diapositiva para formar un pequeño llenado de líquido más el túbulo montado.
12. Coloque al espécimen en la platina del microscopio. Coloque la entrada y salida capilares sobre la entrada y la abertura de salida de la perfusión bien, respectivamente.
    Nota: El divisor bien puede dejarse si se desea una cámara abierta de la perfusión. En este caso los capilares de entrada y salida se pueden alinear a lados opuestos de una imagen bien.

6. validación de la proyección del túbulo salud y Protocolo de

Nota: Este protocolo se realiza en un microscopio epifluorescente invertida de gran campo con GFP (SEpH) y filtro RFP (mCherry) (470/40 nm excitación (ex), emisión de longpass de 515 nm (em), 500 nm nm dicroico y 546/10 ex, 590 em de longpass nm, 565 nm dicroico), 10 X / 0.45 de aire objetivo, una cámara monocromática para captura de imágenes en vivo y proyección de imagen de software. El protocolo puede ser adaptado para cualquier posición vertical o microscopio invertido con filtro automático de conmutación entre GFP y RFP óptica e imagen software de adquisición, aunque variarán parámetros binning, intensidad de la luz y tiempos de exposición óptima. En todos los análisis, la intensidad de fluorescencia debe analizarse como intensidad de pixel media en la región de interés (ROI), después de la sustracción de fondo en cada canal mediante un ROI con no contiene ninguna fluorescencia junto a la señal de retorno de la inversión.

1. Encender el microscopio, fuente de luz y sistema de proyección de imagen.
2. Software abierto de imagen asociado.
3. Mire por el ocular y ajustar el foco manualmente hasta que la luz de la MT es claramente visible bajo luz transmitida.
4. Haga clic en la pestaña de "Adquisición" de software de análisis de imagen y seleccione "2 x 2" en el menú desplegable "Binning" en la sección "Modo de adquisición".
5. Inserte un filtro de densidad neutra de 5% en la trayectoria de la luz para reducir la luz de la iluminación y minimizar el fotoblanqueo.
6. El canal GFP (SEpH) en el menú "Canales", haga clic en "Live" para observar la señal fluorescente a través de la cámara.
7. Ajuste el control deslizante de "Tiempo" para ajustar el tiempo de exposición tal que los más brillantes valores de píxel en el histograma de intensidad aproximadamente el 40% del valor máximo, luego haz clic en "Stop" para detener la iluminación.
8. Repita los pasos 6.6-6.7 en la RFP (mCherry) canal y confirman la presencia del segmento inicial dilatada de la anterior TA y la ausencia de mCherry citosólica agregados (indicativa de daño tisular o sobreexpresión) (figura 4).
   Nota: El segmento dilatado debe ser claramente evidente como lo es el segmento más proximal del túbulo y el diámetro de la luz interior de este segmento es ~ 20 μm mayor que la de adyacente del segmento transicional. 2 x 2 binning pixel es a menudo suficiente pero se puede aumentar para reducir la intensidad de iluminación requerida. Tiempos de exposición típicos son entre 150 y 800 ms/canal. Utilizar como poca luz como sea posible para minimizar el fotoblanqueo. Minimizar el fotoblanqueo es vital para el uso de indicadores de doble-fluoróforo como pHerry como los dos fluoróforos pueden blanquear independientemente, invalidando así cualquier calibración de relación.
9. Habilitar un protocolo Time-lapse de imágenes haciendo clic en la casilla de verificación "Series de tiempo".
10. Ajustar la "duración" en el menú desplegable en la sección de "Series de tiempo" a 10 min y el deslizador de "Intervalo" a 0 para configurar el tiempo de captura total con una tasa de adquisición de imagen máxima. A menudo basta con una tasa de adquisición total de 0,2 Hz.
11. Compruebe los cuadros de RFP (mCherry) en la sección "Canales" y GFP (SEpH).
12. Abrir la línea EICP del sistema de perfusión, activando el controlador de la válvula adecuada y empezar el protocolo de imagen haciendo clic en "Start experimento." Después de 1 minuto, interruptor de NH₄Cl solución de pulso de 20 s abriendo la válvula correspondiente y cerrando la línea EICP, volver a EICP por NH₄Cl línea de cierre y reapertura de la válvula del EICP. Permitir el protocolo completo de imágenes completar antes de parar el sistema de perfusión.
    Nota: Time-lapse análisis deberían revelar una señal mCherry estable y una señal de la SEpH que aumenta en presencia de NH₄Cl, sacia al lavado y poco a poco se recupera.
13. Realizar una calibración de 2 puntos.
    1. Retire el divisor bien pelando lejos la diapositiva subyacente y eliminar los capilares de la perfusión y las abrazaderas de la proyección de imagen bien.
    2. Aplique 200 μL EICP de calibración (pH 7,4, 10 nigericin μm) para la proyección de imagen con una pipeta de 200 μl. Retire la solución de la proyección de imagen con la pipeta, luego cambie por otro 200 μL de solución de calibración. Repetir este proceso 4 veces para asegurar la solución completa de exchange.
    3. Incubar la preparación en solución de calibración para 30 minutos antes de la proyección de imagen. Repita el protocolo de imagen utilizando los mismos parámetros determinados en los pasos 6.6-6.11, con la modificación de solamente 1 minuto de la imagen de captura.
       Nota: El sistema de perfusión y los capilares no son necesarios en esta etapa y no debe estar conectados a la proyección de imagen bien para evitar exponer a los capilares a nigericin.
    4. Añadir 200 μL EICP de calibración (pH 9.0, 10 nigericin μm) a la proyección de imagen con una pipeta de 200 μl. Retire la solución de la proyección de imagen con la pipeta, luego cambie por otro 200 μL de solución de calibración. Repetir este proceso 4 veces para asegurar la solución completa de exchange.
    5. Incubar la preparación en la segunda solución de calibración para 10 minutos antes de la proyección de imagen. Repita el protocolo de imagen como en el paso 6.13.3.
    6. Revise la pila de la imagen capturada en el software de análisis de imagen para confirmar que no hay píxeles de cada canal están saturados por clic "Significa ROI" y el desplazamiento aunque la pila de la imagen con el slider de "Marco" mientras observa que no hay valores reportados en el histograma de intensidad alcanzar el máximo valor detectable. Si cualquier Marcos contienen pixeles que alcanzan la máxima intensidad detectable, reducir la intensidad de tiempo o iluminación de la exposición y repetición sección 6.
       Nota: Una vez establecido no cambia parámetros de proyección de imagen entre experimentos o calibración a menos que punto calibraciones deben ser utilizadas en cada preparación (ver paso 8.3).
14. Analizar la pila imagen para trazar la intensidad fluorescente y cociente de la fluorescencia (SEpH/mCherry) como una función del tiempo.
    1. Haga clic en "Significa ROI" y seleccione la herramienta forma libre. Mantenga el botón izquierdo del ratón para trazar una ~ 50 μm de longitud de MT Haga clic para terminar de dibujar el ROI, luego repetir en un área adyacente a la MT para definir un fondo ROI (figura 5A).
    2. Haga clic en la opción de "Media intensidad" bajo "Medidas". Crear una tabla de valores de intensidad haciendo clic en "Exportar > tabla de datos > crear."
    3. Haga clic en el icono de rueda dentada de configuración y anular la selección de todos los parámetros excepto el "Tiempo" y "Significa intensidad." Haga clic en la ficha de la tabla de datos recién creada, seleccione "Guardar como" y exportar los datos como un archivo .csv.
       Nota: Medidas similares también es posible usar software libre como el ImageJ.
    4. Abrir una tabla de hoja de cálculo y la tabla de datos de importación seleccionando la pestaña de "Datos" seguida de "De texto".
    5. Utilizar funciones en la hoja de cálculo para disminuir la intensidad de fondo SEpH de la intensidad de la señal de la SEpH en cada momento. Repita este proceso para la señal mCherry.
    6. Parcela de cada intensidad de canal como una función de tiempo seleccionando las columnas que contiene el tiempo y corregir de fondo datos de intensidad y luego clic en "Insertar > dispersión (diagramas) > dispersión con líneas rectas" (figura 5B).
    7. Utilizar funciones de hoja de cálculo para calcular el cociente de la fluorescencia de SEpH/mCherry en cada momento.
    8. Trama de fluorescencia relación como una función de tiempo seleccionando las columnas que contienen los datos de tiempo y ratio y luego clic en "Insertar > dispersión (diagramas) > dispersión con líneas rectas" (figura 5).

7. completa calibración de pHerry en túbulos de Malpighi Ex Vivo.

1. Disecar y montar una nueva serie de MTs anteriores como se describe en la sección 5.
2. Intercambio EICP para calibración EICP (pH 7,4, nigericin del μm 10) como se describe en el paso 6.13.2. Incubar durante 30 minutos.
3. Localice el MTs y recoger pares de imágenes de SEpH/mCherry como se describe en pasos 6.1-6.11. Reemplazar la solución con otro stock de calibración EICP como se describe en el paso 6.13.4, espera 10 minutos y otra vez la imagen. Repita este proceso hasta que el cociente de la SEpH/mCherry ha sido reflejado en todas las soluciones. Obtener pH 9,0 imágenes durar mientras el espécimen rara vez se recupera de pH alto.
4. Parcela cociente de la fluorescencia de la SEpH a mCherry de calibraciones en las ocho muestras en función del pH impuesto como se describe en el paso 6.14.9. Ajustar los datos de calibración con una curva de Boltzmann para obtener la función de calibración completo según la ecuación 1 (figura 5). Si los datos son inconsistentes, trazar sistemas de calibración de cada ejemplar normalizado que un cociente de la fluorescencia de 1.0 corresponde a pH_i 7.0 y volver a analizar (figura 5E).
   Nota: Si este último proceso es necesario experimentos individuales tendrá sus propias calibraciones de punto interno³³ (ver cuantificación procedimiento siguiente (paso 8.3)).
5. Ecuación 1
   
   Donde R = relación de SEpH/mCherry y un₁,₂, x_oy dx es curva de parámetros de conexión que representa la proporción mínima de la fluorescencia, fluorescencia máxima proporción, pK_unay anchura de la función respectivamente. x_o = aparente pK_una de pHerry, que puede variar entre 7.1 y 7.4 dependiendo del tipo de la célula y las condiciones de la calibración exacta.

8. cuantificación de ácido Basolateral extrusión de epitelios de túbulos de Malpighi Ex Vivo .

1. Imagen expresando pHerry células radiadas y principal pHerry expresando las células simultáneamente.
   1. Disección anteriores MTs de una mosca UAS-pHerry/capaR-GAL4 como se describe en la sección 5, pero no transfieren MTs de medio de Schneider de la disección a la proyección de imagen bien.
   2. Disección anteriores MTs de una mosca UAS-pHerry/c724-GAL4 en el mismo plato de disección utilizando el procedimiento descrito en la sección 5.
   3. Transferencia de los 2 conjuntos de MTs en el mismo la proyección de imagen así como se describe en pasos 5.8-5.11.
      Nota: Cuando barrido de los brazos de las MTs hasta la diapositiva, coloque los metros que la UAS-pHerry/c724-GAL4 y cerca de los túbulos UAS-pHerry/capaR-GAL4 mutuamente las células principales y radiadas pHerry-expresando así que se pueden visualizar en el mismo campo ( Figura 6A).
2. Aplicar el NH₄Cl prepulso como se describe en el paso 6.12.
   Nota: Si no podría lograrse calibración consistente (Figura 4B), realice una calibración de punto ajustando pH_i a 7.0 al final de cada experimento con EICP de calibración (pH 7.0, 10 μm nigericin, incubación de 30 min) después del adhesivo divisor de perfusión-bien y el equipo de perfusión se han quitado.
3. Calibrar rastros de células radiadas y principal de diversos segmentos de MT (con el cociente normalizado o absoluto según el caso) con la ecuación 2 y analizar la fase de recuperación después de NH₄Cl retiro aplicando funciones del decaimiento exponencial con software de análisis estadístico y teniendo en cuenta la constante de decaimiento (τ) (Figura 6B).
   Ecuación 2
   
   Donde R = relación de SEpH/mCherry y un₁,₂, x_oy dx es curva de parámetros de conexión determinados por calibración en el paso 7.4 (ecuación 1).
   1. Calcular tasa de extrusión ácido (J_{H +}, ver ecuación 3) en función del pH para tener en cuenta las variaciones en pH y ácido carga entre preparaciones³⁴de reclinación. Utilizar las funciones exponenciales en paso 8.3 para calcular la derivada de pH en cuanto a tiempo en cada intervalo de tiempo.
      Ecuación 3
      
   2. Calcular la capacidad tampón intrínseca (β_i; Ecuación 4) el citosol en el pH desde el inicio de cada intervalo en el paso 8.3.1 basado en literatura anterior (véase ecuación 4).
      Nota: En Drosophila, la caracterización más completa de β viene del nervio motor larvas terminales³⁵ y estos datos se pueden suponer que se mantenga para las celdas de MT en ausencia de otros datos disponibles.
      Ecuación 4
      
   3. Calcular el producto de β_T (de paso 8.3.2)_y dpH/dt (del paso 8.3.1) para determinar J_{H +} (ecuación 3).
      Nota: En soluciones nominalmente libres de bicarbonato como los descritos en este protocolo, derivados del bicarbonato búfer capacidad (β_b) se asume que es ~ 0 mM. Almacenamiento en búfer capacidad (β_T) total es la suma de β y_βby β_{i =} β_T en ausencia de HCO₃^–/CO₂³⁶.
   4. Parcela J_{H +} en función del pH al principio de cada intervalo de tiempo como se indica en el paso 6.14.9.
   5. Las funciones del decaimiento exponencial se aplica a la porción de todos los conjuntos que se superponen en el pH utilizando el software de análisis estadístico. Comparar las tasas de cambio de las funciones resultantes de comparar las tasas de ácido protuberancia entre las células y MT segmentos (figura 6).
      Nota: La función más apropiada utilizada para ajuste de curvas puede no siempre ser un solo exponencial. Otras funciones pueden ser sustituidas si mejoran la bondad de ajuste.
   6. Calcular ácido (ver ecuación 5) del flujo en función del pH para tener en cuenta las variaciones en forma y tamaño de la célula.
      Ecuación 5
      
      Nota: Dimensiones de la célula pueden ser medidos directamente en imágenes o aproximados. Las células principales se pueden representar como mitades de un tubo hueco con las siguientes dimensiones: diámetro interno 24 μm; diámetro exterior 48 μm; altura 50 μm. transición células radiadas son variables, pero pueden representarse aproximadamente como cilindros con alturas de 50 μm y el diámetro de 10 μm. Véase el párrafo final del Representante resultados a continuación.
   7. Funciones del decaimiento exponencial se aplica a la porción de los conjuntos de datos que se superponen en el pH utilizando el software de análisis estadístico. Comparar las tasas de cambio de las funciones que resulta comparar flujos de ácidos entre las células y MT segmentos (figura 6).

Resultados

Tejidos sanos y correcta identificación de los MTs anteriores son vitales para el éxito de este protocolo. Durante la disección, debe tenerse cuidado que no toque el MTs y a manija única por el uréter como agarre el MTs directamente conducirá a la rotura (Figura 4A– B). Cuando se barren MTs plana sobre la diapositiva, los túbulos se deben tocar lo menos posible y exceso movimiento evitado ya que esto puede dañar la...

Discusión

El éxito de cuantificación de pH en Drosophila MTs depende totalmente de la salud de MTs extraídos y la calidad del montaje y la disección (Figura A – C). Así, la manipulación cuidadosa del tejido como descrito es indispensable. Diapositivas recién revestidos en PLL substancialmente ayuda MT de montaje ya que tienden a ser mucho más pegamento que las diapositivas que han sido expuestos previamente a solución. Montaje cuidadoso también ay...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.