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Method Article
Transporte iónico celular a menudo puede evaluarse mediante el control de pH intracelular (pH). Genéticamente codificada pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH intracelular en las células intactas. Este protocolo detalla la cuantificación de pH intracelular a través de celular ex vivo vivo-proyección de imagen de los túbulos de Malpighi de la Drosophila melanogaster con pHerry, un pseudo-radiométrica genéticamente codificada en indicador de pH.
Transporte iónico epitelial es fundamental para la homeostasis de iones sistémica así como el mantenimiento de gradientes electroquímicos celulares esenciales. PH intracelular (pH) está influenciado por muchos transportadores de iones y así control de pH es una herramienta útil para evaluar la actividad de transportista. Moderno codificado genéticamente pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH en las células intactas a escala celular y subcelular. Este protocolo describe la cuantificación en tiempo real del pH celular Reglamento en túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster por ex vivo vivo-proyección de imagen de pHerry, un pseudo-radiométrica GEpHI con un pKun adecuadas para el seguimiento de los cambios de pH en el citosol. Mosca adulta extraída MTs se componen de secciones morfológicamente y funcionalmente distintas de epitelios capa unicelular y pueden servir como un modelo accesible y genéticamente manejable para la investigación del transporte epitelial. GEpHIs ofrece varias ventajas sobre los convencionales tintes fluorescentes sensibles a pH y electrodos ion-selectivos. GEpHIs puede etiquetar poblaciones celulares distintas siempre elementos promotor apropiado están disponibles. Este etiquetado es particularmente útil en ex vivo, en vivoy en situ preparados, que son inherentemente heterogéneos. GEpHIs también permiten la cuantificación de pHi en tejidos intactos en el tiempo sin necesidad de externalización de tratamiento o tejido tinte repetidas. El principal inconveniente de GEpHIs actual es la tendencia a agregar en inclusiones citosólicas en respuesta al daño tisular y construir sobre expresión. Estas deficiencias, sus soluciones y las ventajas inherentes de GEpHIs se demuestran en el presente Protocolo mediante la evaluación del transporte de protones (H+) basolateral en células principales y radiadas funcionalmente distintas de mosca extraído MTs. Las técnicas y análisis descritos son fácilmente adaptables a una amplia variedad de vertebrados e invertebrados preparados y la sofisticación del análisis puede ampliarse desde laboratorios a intrincados determinación del flujo de iones a través de transportadores específicos de enseñanza.
El objetivo de este protocolo es describir cuantificación de pH intracelular (pHi) utilizando un genéticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) y demostrar cómo este método puede utilizarse para evaluar transporte basolateral H+ un insecto modelo (D. melanogaster) estructura renal, los túbulos de Malpighi (TM). MTs sirven como los órganos excretores de la mosca de la fruta y son funcionalmente similares a la nefrona mamífera en varios aspectos clave1. MTs se arreglan como 2 pares de túbulos (anteriores y posteriores) en el tórax y el abdomen de la mosca. El sola célula epitelial tubo de cada MT está compuesto por metabólicamente activas principales células con distinta apicales (luminal) y basolateral (hemocoel) polaridad así como células radiadas intercaladas. Anteriores MTs se componen de 3 morfológico, funcional, y con distintos segmentos, en particular la inicial dilatada segmento, segmento de transición y secretor principal segmento, que une el uréter2. En la escala celular transporte trans epitelial ion en el lumen se logra por una membrana plasmática apical V-ATPasa3 y un intercambiador+ de álcali-metal/H así como un basolateral Na+-K+-4de la ATPasa, hacia adentro-rectificador K+ canales5, Na+-conducido Cl−/HCO3− intercambiador (NDAE1)6y Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mientras que células radiadas median Cl– y agua transporte8,9. Este sistema fisiológico complejo pero accesible ofrece excelentes oportunidades para la investigación de mecanismos de transporte iónico endógeno cuando se combinan con los diversos conjuntos de herramientas genéticas y de comportamiento de Drosophila.
La justificación de este protocolo fue describir un sistema genéticamente maleable para el estudio de transporte iónico epitelial con potencial para la integración de la célula de a conducta y exportación de herramientas para otros sistemas modelo. Expresión de pHerry10, un GEpHI derivada de una fusión de verde pH-sensible Super eclíptica pHluorin11,12 (SEpH) y rojo mCherry insensible pH13, MTs permite la cuantificación del transporte de H+ en MT las células a través de la alta K+/nigericin calibración técnica14. Medida que muchos transportadores de iones equivalentes de H+ , cuantificación de pH intracelular sirve como una representación funcional de movimiento de iones a través de una variedad de transportadores. El sistema de modelo de Drosophila MT también ofrece potentes herramientas genéticas en tejidos específicos del transgén15 y RNA de interferencia (ARNi)16 expresión, puede combinarse con la proyección de imagen de celular y todo órgano ensayos17 , 18 , 19 de la función del túbulo para crear un sólido conjunto de herramientas con integración vertical de las moléculas al comportamiento. Esto contrasta con muchos otros protocolos para evaluar biología epitelial, como históricamente tales medidas han confiado en el intrincado y difícil electrodos ion-selectivos micro disección, sofisticado20,21, y caro pH-sensible tintes22 con requisitos de carga restrictiva y pobre especificidad celular en tejidos heterogéneos. GEpHIs se han utilizado para medir el pH en una gran variedad de tipos de célula23extensivamente. Trabajo temprano explota la inherente sensibilidad al pH de la proteína fluorescente verde (GFP) para controlar el pH en células epiteliales cultivadas24 pero las dos últimas décadas han visto utilizado en neuronas25, glia26, hongos27 GEpHIs , y28de las células de la planta. La combinación de las posibilidades de orientación celular de construcciones genéticas a través de la expresión de GAL4/UAS sistema15 y la accesibilidad fisiológica de la Drosophila MT hacen de esta una preparación ideal para las investigaciones de pHi regulación y transporte iónico epitelial.
regulación de pH ha sido estudiado durante décadas y es vital para la vida. La preparación de MT ofrece un modelo robusto para enseñar fisiología de la regulación de pH pero también realizar sofisticadas investigaciones de pHi regulación ex vivo e in vivo. Este protocolo describe la cuantificación del movimiento de la H+ a través de la membrana basolateral de las células epiteliales de la Drosophila MT con NH4Cl ácido de pulso carga técnica21, pero como el indicador de pH es genéticamente codificada, estos métodos y su marco teórico se pueden aplicar a cualquier preparación favorable a la transgénesis y las imágenes en vivo.
Todos los pasos de este protocolo cumplen con las directrices de uso de animales de la Mayo Clinic (Rochester, MN).
1. cría de la mosca
2. preparación de portaobjetos de poli-l-lisina.
3. preparación de plato y varillas de vidrio de disección
Figura 1: Fabricación de varillas de vidrio para el manejo de los túbulos de Malpighi.
A - E. Proceso de calentamiento y tirando de una varilla de vidrio para producir una forma cónica y del ángulo conveniente para manejar mts. flechas denotan dirección y magnitud de la fuerza a aplicar. F. fotografía de un instrumento de vidrio fabricado adecuadamente. Barra de escala = 10 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. preparación de soluciones y sistema de perfusión
Nota: Sistemas de perfusión difieren según el fabricante. Este protocolo se basa en un depósito abierto 8 canales de gravedad con un regulador de velocidad de flujo de entrada y una salida basada en el vacío, pero el método de montaje MTs como se describe aquí pueden ser adaptados para trabajar con cualquier sistema de perfusión.
Figura 2: Sistema de perfusión y configuración de la imagen.
Componentes necesarios para la evaluación fisiológica de la función de transporte basolateral de MT a través de simultánea en vivo cambio de fluorescencia proyección de imagen y rápida solución. Líneas de gas se muestra son opcionales y permiten la expansión de experimentos para la evaluación del transporte HCO3– . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema del flujo de perfusión aparatos de NH4Cl pulso experimentos.
Flechas representan la trayectoria del flujo y válvula de conmutación puntos. La solución pasa de depósito a muestra por flujo de gravedad y se extrae de la cámara de muestra al matraz de residuos por la succión del vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. disección de los túbulos de Malpighi Anterior adulto Drosophila .
6. validación de la proyección del túbulo salud y Protocolo de
Nota: Este protocolo se realiza en un microscopio epifluorescente invertida de gran campo con GFP (SEpH) y filtro RFP (mCherry) (470/40 nm excitación (ex), emisión de longpass de 515 nm (em), 500 nm nm dicroico y 546/10 ex, 590 em de longpass nm, 565 nm dicroico), 10 X / 0.45 de aire objetivo, una cámara monocromática para captura de imágenes en vivo y proyección de imagen de software. El protocolo puede ser adaptado para cualquier posición vertical o microscopio invertido con filtro automático de conmutación entre GFP y RFP óptica e imagen software de adquisición, aunque variarán parámetros binning, intensidad de la luz y tiempos de exposición óptima. En todos los análisis, la intensidad de fluorescencia debe analizarse como intensidad de pixel media en la región de interés (ROI), después de la sustracción de fondo en cada canal mediante un ROI con no contiene ninguna fluorescencia junto a la señal de retorno de la inversión.
7. completa calibración de pHerry en túbulos de Malpighi Ex Vivo.
8. cuantificación de ácido Basolateral extrusión de epitelios de túbulos de Malpighi Ex Vivo .
Tejidos sanos y correcta identificación de los MTs anteriores son vitales para el éxito de este protocolo. Durante la disección, debe tenerse cuidado que no toque el MTs y a manija única por el uréter como agarre el MTs directamente conducirá a la rotura (Figura 4A– B). Cuando se barren MTs plana sobre la diapositiva, los túbulos se deben tocar lo menos posible y exceso movimiento evitado ya que esto puede dañar la...
El éxito de cuantificación de pH en Drosophila MTs depende totalmente de la salud de MTs extraídos y la calidad del montaje y la disección (Figura A – C). Así, la manipulación cuidadosa del tejido como descrito es indispensable. Diapositivas recién revestidos en PLL substancialmente ayuda MT de montaje ya que tienden a ser mucho más pegamento que las diapositivas que han sido expuestos previamente a solución. Montaje cuidadoso también ay...
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue financiado por los NIH DK092408 y DK100227 a MFR. AJR fue apoyado por DK007013 T32. Los autores desean agradecer al Dr. Julian A.T. Dow el CapaR-GAL4 y c724-GAL4 poblaciones de Drosophila . También agradecemos a Jacob B. Anderson por ayuda mantener cruces mosca experimentales.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
Nigericin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | N7143 | CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C. |
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors | Bioscience Tools | PS-8S | Any comparable perfusion system can be used. |
Flow Regulator | Warner Instruments | 64-0221 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
#5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" | Fisher Scientific | 14-171-129 | Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system. |
Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
Plastic Flow Control Clamp | Fisher Scientific | 05-869 | Available from multiple vendors, sterility not required |
Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | H3375 | Available from multiple vendors. |
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 69892 | Available from multiple vendors. |
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | T5130 | Available from multiple vendors. |
10X/0.45 Air Objective | Zeiss | 000000-1063-139 | Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging. |
Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 10 | |
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 32 | |
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 2 | |
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera | Zeiss | Axiocam 506 mono | Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging. |
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic | Chroma | CZ909 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic | Chroma | CZ915 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
Inverted Epifluoescent Microscope | Zeiss | Axio Observer Z.1 | Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives. |
Statistical Analysis Software | Microcal | Origin 6.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Analysis Software | National Institutes of Health | ImageJ 1.50i | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Acquisition Software | Zeiss | Zen 1.1.2.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
NMDG; N-Methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | Available from multiple vendors. |
200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
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