Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Resumen

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Resumen

La respuesta al daño del ADN orquesta la reparación de las lesiones del ADN que se producen espontáneamente, son causadas por el estrés genotóxico, o aparecen en el contexto de las rupturas programadas de ADN en los linfocitos. La cinasa mutada (ATM), cinasa relacionada con ATM y Rad3 (ATR) y la subunidad catalítica de la Proteína Quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs) están entre las primeras que se activan tras la inducción de daño al ADN, y son Reguladores centrales de una red que controla la reparación del ADN, la apoptosis y la supervivencia celular. Como parte de una vía supresora de tumor, ATM y ATR activar p53 a través de la fosforilación, por lo tanto, la regulación de la actividad transcripcional de p53. El daño del ADN también da lugar a la formación de los llamados focos inducidos por la radiación ionizante (IRIF) que representan complejos de sensor de daño del ADN y proteínas de reparación que se acumulan en los sitios de daño del ADN, que se visualizan mediante microscopía de fluorescencia. Co-localización de las proteínas en IRIFs, sin embargo, no implica necesariamente dInteracciones directas proteína-proteína, ya que la resolución de la microscopía de fluorescencia es limitada.

El Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) es una técnica novedosa que permite la visualización directa de interacciones proteína-proteína en células y tejidos con una especificidad y sensibilidad sin precedentes. Esta técnica se basa en la proximidad espacial de los anticuerpos específicos que se unen a las proteínas de interés. Cuando las proteínas interrogadas están dentro de ~ 40 nm, una reacción de amplificación es desencadenada por oligonucleótidos que están conjugados con los anticuerpos, y el producto de amplificación se visualiza por marcaje fluorescente, produciendo una señal que corresponde a la localización subcelular de las proteínas que interactúan. Utilizando la interacción funcional establecida entre ATM y p53 como ejemplo, se demuestra aquí cómo PLA puede usarse en cultivos de células en suspensión para estudiar las interacciones directas entre proteínas que son partes integrales de la respuesta de daño del ADN.

Introducción

El daño del ADN desencadena una serie altamente regulada de eventos que implican interacciones proteína-proteína y modificaciones postraduccionales que garantizan la rápida y eficiente reparación del ADN, salvaguardando así la integridad genómica ¹ . Típicamente, la reparación del ADN se estudia en las células expuestas a la radiación ionizante mediante el control de la formación de los llamados focos inducidos por la radiación ionizante (IRIF) mediante microscopía de fluorescencia (confocal). Muchas proteínas de ADN de detección de daños y el ADN de ADN forman IRIFs, que representan complejos de proteínas que se nuclean en sitios de cromatina que sufren daño del ADN ^{2 , 3} . La localización y resolución de los IRIF a lo largo del tiempo proporciona una visión importante de la organización espaciotemporal de la reparación del ADN y puede indicar la participación de diferentes vías de reparación del ADN. La naturaleza del daño del ADN y la etapa del ciclo celular en la que se produce el daño determina qué vía de reparación del ADN está activada. Para R, en las células que participan activamente en la replicación del ADN (fase S), la recombinación homóloga (HR) es la vía dominante de reparación del ADN, mientras que en las células en la fase G1 o G2 / M del ciclo celular, Predomina la vía de reparación homóloga de unión final (NHEJ). Uno de los eventos más tempranos después del daño en el ADN es la activación de las cinasas sensibles al daño del ADN Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que es principalmente activa en las fases G1 y G2 / M del ciclo celular y regula NHEJ, Y Ataxia Telangiectasia y proteína relacionada con Rad3 (ATR), que actúa en la fase S mediante la activación de la FC. Ambos ATM y ATR son muy pleiotrópicos quinasas que phosphorylate muchas proteínas que están involucrados en la reparación del ADN, la muerte celular y la supervivencia [ ^4] . Se ha demostrado que ambas quinasas fosforilan y activan la proteína supresora de tumores p53 después de la exposición al estrés genotóxico, lo que indica que estas quinasas son mediadores aguas arriba de un eje pivotante de señalización supresora de tumores"Xref"> 5 ^{, 6} .

La formación y composición de los IRIF se evalúa típicamente determinando la co-localización de diferentes proteínas usando tinción de inmunofluorescencia de doble color y microscopía, sin embargo, no todas las proteínas que forman parte de los complejos de proteínas de reparación forman IRIFs, lo que limita la aplicabilidad de este enfoque. Por otra parte, la microscopía de inmunofluorescencia (confocal) está limitada por las propiedades de difracción de la luz, dando como resultado una resolución espacial bastante pobre de aproximadamente 200-300 nm, que excede el tamaño de la mayoría de las estructuras subcelulares, lo que esencialmente prohíbe la interrogación directa de interacciones proteína-proteína en El nivel molecular. Como tal, la co-localización de patrones de tinción de inmunofluorescencia como detectado por microscopía de fluorescencia (confocal) no es necesariamente indicativo de interacciones directas proteína-proteína. Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías de super-resolución, tales como estructuras tridimensionales(3D-SIM) ⁷ , que se utilizó con éxito para estudiar la formación de 53BP1 y BRCA1 IRIF a escala nanométrica, revelando las características de distribución espacial de estas proteínas que no pudieron ser detectadas por microscopía confocal de barrido láser ⁸ .

Varios otros métodos se pueden utilizar para detectar interacciones proteína-proteína in vivo , tales como co-immunoprecipitation, pull-down métodos y la levadura dos híbridos enfoques de selección. Sin embargo, estas técnicas son bastante engorrosas, requieren grandes cantidades de células o proteínas o implican sobreexpresión de proteínas, lo que introduce artefactos experimentales. Más recientemente, se ha desarrollado una técnica novedosa que permite la visualización y cuantificación de interacciones proteína-proteína in situ ( es decir, en células y en tejidos), que se denomina Ensayo de Ligación de Proximidad (PLA) 9,10. PrLos anticuerpos inmunes que reconocen dos proteínas de interés se detectan mediante anticuerpos secundarios que están conjugados con oligonucleótidos (denominadas sondas PLA). Si los dos anticuerpos secundarios diferentes están suficientemente cerca debido a interacciones entre las proteínas reconocidas por los anticuerpos primarios, los oligonucleótidos conjugados hibridan y pueden ligarse para formar un sustrato de ADN circular cerrado. Este sustrato circular se amplifica posteriormente mediante amplificación en círculo rodante y se visualiza con oligonucleótidos complementarios conjugados con fluorocromo. Utilizando PLA, la localización subcelular de la interacción proteína-proteína se conserva como el producto de amplificación de círculo rodante rotulado fluorescentemente sigue unido a las sondas PLA. La resolución de este ensayo es <50 nm, basada en el hallazgo de que el diámetro de un anticuerpo es de aproximadamente 7-10 nm ¹¹ . La amplificación del círculo rodante sólo puede tener lugar en caso de que dos pares de anticuerpos (primario + seconDario) interactúan físicamente dentro del perímetro que se define por su tamaño (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La etapa de amplificación de señal aumenta la sensibilidad del ensayo de PLA y permite la detección de interacciones de proteínas apenas expresadas. El PLA genera patrones puntuales de señales semejantes a focos que pueden ser cuantificados en una base por célula, por lo que se puede evaluar la variación intra e intercelular en las interacciones proteína-proteína.

La formación y composición de complejos de reparación de ADN y IRIFs se estudia principalmente en líneas celulares adherentes tales como la línea de células epiteliales de osteosarcoma de hueso humano U2OS, la línea de células de riñón embrionario humano HEK293 y la línea de células epiteliales de pigmento retiniano RPE-1, Creciente y fácil de transfectar. Los cultivos de células en suspensión, tales linfocitos linfoides y mieloides, se usan menos frecuentemente, ya que son menos susceptibles de transfección y generalmente no se adhieren a cubreobjetos, lo queEps para imágenes. La resolución del daño del ADN es sin embargo muy relevante en el contexto de malignidades linfoides y mieloides, ya que la respuesta de daño del ADN es frecuentemente afectada por aberraciones genómicas (conductor) en estos tumores, desempeñando un papel fundamental en la transformación maligna de linfoides y mieloides normales Progenitor) ^{12 , 13 , 14} .

Este protocolo describe cómo PLA se puede utilizar para evaluar y cuantificar las interacciones proteína-proteína después de la inducción del daño del ADN en cultivos celulares en suspensión. En este caso, el PLA se realiza para determinar y visualizar las interacciones entre ATM y p53 sobre el daño del ADN en células de leucemia de células B humanas que se induce a someterse a una fase G1-ciclo de detención del ciclo. De nota, el protocolo presentado aquí no se limita a estudiar ATM y p53 interacciones en G1-detenido leucemia células, pero también se puede utilizar para visualizar otros proteína interacción proteínaEn varios tipos de células y cultivos de células en suspensión.

Protocolo

1. Tratamiento de las células y la inducción de daños en el ADN

1. Cultivo de las líneas de células linfoblásticas agudas BCR-ABL + de células B BV173 o SUP-B15 en IMDM suplementadas con FCS al 20%, β-mercaptoetanol 50 μM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U / mL y estreptomicina 100 μg / 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ . Contar las células y la placa a 2 x 106 células / ml en placas de 6 pocillos, a 5 ml / pocillo.
   NOTA: Opcionalmente, pueden usarse líneas celulares de suspensión de diversos orígenes.
2. Para detener las células BCR-ABL + B-ALL en la fase G1 del ciclo celular, añadir 5 μM de metanosulfonato de imatinib (STI571) e incubar durante la noche.
   1. Opcionalmente, omita este paso cuando se estudian las interacciones proteína-proteína a lo largo del ciclo celular o en tipos de células BCR-ABL-negativas.
3. Inducir el daño del ADN añadiendo 50 ng / ml de neocarzinostatina (NCS) al cultivo, e incubar durante 2 h.
   1. Alternativamente,Inducen daño al ADN irradiando las células utilizando una fuente radiactiva [ ¹³⁷ Cs] a 0,5 Gy / min, a una dosis de 5 Gy. Después de la irradiación, deje que la célula se recupere durante 2 h a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ .
4. Opcionalmente, para evaluar la participación de la actividad de la cinasa ATM en respuesta al daño del ADN, añadir 5 μM del inhibidor de la cinasa ATM KU55933 antes de la adición de NCS o el tratamiento de irradiación.
5. Preparar 1x PBS + BSA al 10% por capas de 5 g de BSA de fracción-V sobre 50 ml de 1x PBS en un vaso de precipitados o un matraz Erlenmeyer, y dejar reposar a TA hasta que se disuelva la BSA. No agite ni agite ya que esto causará espuma extensa. Filtrar lentamente a través de un filtro de 0,22 μm y mantenerlo en hielo.
6. Se cosecha las células y se lava dos veces con 1x PBS enfriado con hielo. Contar las células y resuspender a 2 x 10 ⁶ / mL en 1x PBS + 10% BSA. Mantenga las células en hielo.

2. Cytocentrifugation, la fijación y Permeabilization

1. Prepara laSolución de paraformaldehído al 4% en 1x PBS recién. Añadir 2 g de PFA a 50 ml de 1x PBS e incubar en un baño de agua templado a 55 ° C hasta que la solución sea transparente. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a RT hasta su uso.
   NOTA: Opcionalmente, el fijador de PFA al 4% se puede almacenar congelado a -20 ° C. Después de congelar, descongelar sólo una vez para su uso. De lo contrario, la solución de PFA al 4% en PBS se puede comprar directamente.
2. Cuidadosamente pulir los portaobjetos de microscopía de 76 mm x 26 mm con tejido libre de pelusas y desengrase colocándolos en etanol al 96% en un frasco de Coplin durante 5 min. Deje que los portaobjetos de microscopia se sequen al aire durante 10 min.
3. Reúna los portaobjetos de microscopía en los embudos cytospin / citología con un área de 6 mm. Las placas de pre-capa se pipetean 50 μl de 1x PBS + BSA al 10% en cada embudo y se centrifuga durante 1 min a 500 rpm.
4. Añadir 100 μl de la suspensión celular (que equivale a 0,2 x 10 ⁶ células) a cada embudo y centrifugar durante 5 min a 500 rpm. Para cada combinación de anticuerpos, alSe requieren 4 preparaciones (experimento de doble anticuerpo, dos controles de anticuerpo único, sin control de anticuerpos).
5. Desmonte cuidadosamente los embudos y asegúrese de no tocar los puntos. Proceder a la fijación de la muestra inmediatamente.
   1. Opcionalmente, deje que los portaobjetos se sequen al aire durante al menos 30 min. Después del secado al aire, envolver los portaobjetos individualmente en papel de aluminio y almacenar a -20 ° C hasta su uso. Cuando use preparaciones congeladas, asegúrese de descongelar las diapositivas envueltas en una toalla de papel para evitar la condensación manifiesta sobre las diapositivas.
6. Dibuje un círculo (diámetro aproximado 15-20 mm) alrededor del punto usando un bloqueador de líquido de pluma PAP (punta de 5 mm).
7. Añadir 50 μl de solución de fijación de PFA al 4% a cada punto e incubar durante 30 min a TA.
8. Lavar las células 3 veces durante 5 min con 1x PBS en un frasco de Coplin a RT con agitación suave.
9. Seque las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusas y retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible utilizando un piMasaje sin tocar el punto, o inclinando la diapositiva. Añadir 50 μl de Triton-X al 0,25% en 1x PBS a cada punto e incubar durante 10 min a TA sin agitación.
10. Lavar los portaobjetos 3 veces durante 5 min en ~ 50-60 mL de Tween-20 al 0,05% en TBS (TBS-T) en un recipiente Coplin a RT con agitación suave. 10 diapositivas se pueden procesar simultáneamente de esta manera.

3. Bloqueo e incubación de anticuerpos primarios

1. Toque TBS-T y seque las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible usando una pipeta sin tocar el punto, o por inclinación de la diapositiva. Vórtice brevemente la solución de bloqueo y agregue una gota (~ 40 μL) a cada punto. Incubar durante 1 h a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada.
2. Preparar el cóctel de anticuerpos mezclando el cabra-anti-ATM a 1: 1.000 y el conejo-anti-fosfo-Ser15-p53 a 1: 100 en diluyente de anticuerpo comercial, diluyente de anticuerpo vortex antes de su uso. Para el control experimenSt, preparan diluciones de anticuerpos que contienen sólo el anticuerpo cabra-anti-ATM y solo el anticuerpo anti-fosfo-Ser15-p53 de conejo (controles de anticuerpo único).
3. Baje la solución de bloqueo, pero tenga cuidado de no dejar que las células se sequen antes de agregar las diluciones del anticuerpo. Añadir 30 μL de cada dilución de coctel de anticuerpos e incubar en una cámara humidificada durante la noche a 4 ° C.
4. Preparar el tampón de lavado A in situ y el tampón de lavado B disolviendo el contenido de una bolsa de tampón A y mezcla de tampón B en un volumen final de 1.000 ml de agua cada uno.
   1. Alternativamente, preparar el tampón de lavado A disolviendo 8,8 g de NaCl, 1,2 g de Tris-base y 0,5 ml de Tween-20 en 800 ml de agua. Ajustar el pH a 7,4 usando HCl y agregar a un volumen final de 1.000 mL.
   2. Alternativamente, preparar el Tampón de lavado B disolviendo 5,84 g de NaCl, 4,24 de Tris-base y 26,0 g de Tris-HCl en 500 ml de agua. Ajustar el pH a 7,5 usando HCl. Añadir agua hasta un volumen final de 1.000 ml.
   3. FiltrarAmbas soluciones a través de un filtro de 0,22 μm.
5. Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con 1x tampón de lavado in situ A en un recipiente Coplin a RT con agitación suave.

4. Sondas PLA, Ligación y Amplificación

1. Preparar las sondas PLA diluyendo el anti-cabra PLUS y anti-conejo MINUS tanto 1: 5 en el diluyente de anticuerpos comerciales. Apriete 1x tampón de lavado in situ A de los portaobjetos y añada 30 μL de la sonda-mezcla de PLA a cada punto. Incubar 1 h a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier combinación de anticuerpos secundarios PLUS y MINUS PLA sondas (anti-ratón, anti-conejo, anti-cabra), siempre y cuando los anticuerpos primarios aplicados se planteen en diferentes especies, y la combinación de sondas PLA siempre debe ser Contienen una sonda PLUS y una sonda MINUS.
2. Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con ~ 50-60 mL 1x tampón de lavado in situ A en un frasco de Coplin a RT con agitación suave
3. Preparar la solución de Ligación-Ligasa en hielo añadiendo 1 μl de Ligasa a 39 μL de solución de Ligación y añadir 40 μl de solución Ligación-Ligasa a cada punto. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada previamente calentada.
4. Lavar los portaobjetos 2 veces durante 5 min con ~ 50-60 mL 1x tampón de lavado in situ A en un frasco de Coplin a RT con agitación suave.
5. Preparar la mezcla de Amplificación-Polimerasa en hielo, diluyendo la solución madre de Amplificación 1: 5 en agua. A continuación, añadir 0,5 μ l de polimerasa a 39,5 μ l de 1x solución de amplificación para cada punto.
   NOTA: Los reactivos de amplificación son sensibles a la luz y deben estar protegidos contra la exposición directa a la luz. El reactivo de amplificación viene en cuatro colores diferentes (ROJO: excitación 594 nm, emisión 624 nm, FarRED: excitación 644 nm, emisión 669 nm, ORANGE: excitación 554 nm, emisión 576 nm, VERDE: excitación 501 nm, emisión 523 nm), Asegúrese de que la configuración de microscopía disponible tenga sPropiedades de excitación y filtros para la imagen de estos colores.
6. Tapar el tampón de lavado A in situ 1x y agregar 40 μl de mezcla de Amplificación-Polimerasa por mancha. Incubar durante 100 minutos a 37 ° C en una cámara humidificada precalentada.

5. Montaje e imágenes

1. Preparar 0,01 x tampón de lavado in situ B añadiendo 1 mL de 1x Tampón de lavado B a 99 mL de agua.
2. Tapar la mezcla de Amplificación-Polimerasa y lavar los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos con 1x tampón de lavado in situ B en una jarra de Coplin a RT con agitación suave.
3. Lavar las diapositivas 1 min en tampón de lavado 0,01x B.
4. Tapar el exceso de tampón de lavado 0,01x B y secar las diapositivas alrededor de las manchas con un tejido sin pelusa. Retire la mayor cantidad de líquido de la mancha como sea posible usando una pipeta sin tocar el punto, o por inclinación de la diapositiva.
5. Diluir el medio de montaje que contiene DAPI 1: 5 en medio de montaje sin DAPI para evitar la sobrecarga de los núcleos.
6. Añadir 25-30 μL de medio de montaje que contenga DAPI 1: 5 a un cubreobjetos de 24 mm x 24 mm y recoger el resbalón de la cubierta con la corredera, aplicar una ligera presión para asegurar que no haya burbujas de aire atrapadas. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y espere al menos 15 minutos antes de tomar imágenes.
7. Analizar las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia (confocal).
   1. Contar el número de señales puntuales de PLA por célula en al menos 4 campos de imagen adquiridos (objetivo 20x, contar al menos 20 células por condición o combinación de anticuerpos, basándose en un cálculo de potencia utilizando una media anticipada de 7 ± 5 señales en las células tratadas, Y 2 ± 2 señales en las células no tratadas, con una probabilidad de un error de tipo I de 0,05, y una potencia del 80%, como se informó anteriormente ¹⁵ ).
      NOTA: La mejor resolución se logra mediante la adquisición de una pila Z y la deconvolución utilizando paquetes de software ( por ejemplo , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). La señalLs debe ser fácilmente discernible dentro del perímetro nuclear, como se define por la tinción DAPI.
   2. No cuente señales que aparezcan claramente fuera de los núcleos. Típicamente, el tratamiento con NCS o irradiación γ da como resultado aproximadamente 5 - 10 señales de PLA de phosho - p53 / ATM por célula. Los controles de "solo anticuerpo" pueden dar alguna señal de fondo, pero esto no debe exceder 1-2 señales de PLA por 1 de cada 20 células.
   3. Para propósitos de publicación y presentación, capture imágenes usando un objetivo de aceite de inmersión 40X o 63X. Las diapositivas se pueden almacenar a 4 ° C y deben protegerse de la exposición a la luz.

Resultados

Se demostró que la fosforilación de p53 en el resto Ser15 era dependiente de la actividad de cinasa ATM ¹⁶ . Para demostrar y confirmar la especificidad de la técnica de PLA en preparaciones de citospin de cultivos de células en suspensión, se muestra que la inducción del daño del ADN por 2 h de tratamiento con NCS de células BCR-ABL + B-ALL detenidas en la fase G1 del ciclo celular Resultó en la interacción específica entre ATM y fosfo-Ser15-p53, como ...

Discusión

En este informe, se demuestra que PLA se puede utilizar para determinar y visualizar la interacción específica entre proteínas en cultivos de células en suspensión. Es de notar que el protocolo descrito aquí no se limita al estudio de los complejos de reparación del ADN sino que también se aplica para visualizar y cuantificar otras interacciones proteína-proteína en cultivos de células en suspensión. Se muestra que la cinasa ATM interactúa con p53 fosforilada en células BCR-ABL + B-ALL bloqueadas con G1 cu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors