Drosophila condicionamiento del corte como una medida de aprendizaje y memoria

Resumen

Este protocolo describe un aprendizaje de Drosophila y un ensayo de memoria llamado condicionamiento del cortejo. Este ensayo clásico se basa en una reducción de la conducta de cortejo masculino después del rechazo sexual por una mujer prematura no receptiva. Esta forma natural de plasticidad conductual se puede usar para probar el aprendizaje, la memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo.

Resumen

Muchos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes al aprendizaje y la memoria se han dilucidado mediante el uso de ensayos de comportamiento simples en organismos modelo como la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster . Drosophila es útil para comprender la neurobiología básica subyacente déficits cognitivos resultantes de las mutaciones en los genes asociados con los trastornos cognitivos humanos, tales como la discapacidad intelectual (ID) y el autismo. Este trabajo describe una metodología para probar el aprendizaje y la memoria usando un paradigma clásico en Drosophila conocido como condicionamiento del cortejo. El macho vuela a mujeres de la corte usando un patrón distintivo de comportamientos fácilmente reconocibles. Las hembras prematuras no son receptivas al apareamiento y rechazan los intentos de cópula del macho. En respuesta a este rechazo, las moscas machos reducen su comportamiento de cortejo. Esta reducción aprendida en el comportamiento del cortejo se mide con el tiempo, sirviendo como un indicador del aprendizaje y de la memoria. El número básicoEl resultado de este ensayo es el índice de cortejo (CI), que se define como el porcentaje de tiempo que un hombre pasa a cortejar durante un intervalo de 10 min. El índice de aprendizaje (LI) es la reducción relativa del CI en las moscas que han sido expuestas a una mujer prematura en comparación con las moscas ingenuas sin ningún encuentro social previo. Para la comparación estadística de LIs entre genotipos, se utiliza una prueba de aleatorización con bootstrap. Para ilustrar cómo se puede usar el ensayo para tratar el papel de un gen relacionado con el aprendizaje y la memoria, se caracterizó el derribo pan-neuronal de la Dihidroxiacetona fosfato aciltransferasa ( Dhap-at ). El ortólogo humano de Dhap-at , la glicero-fosfato O-aciltransferasa ( GNPT ), está involucrado en la condrosis punctata tipo 2, un síndrome autosómico-recesivo caracterizado por una ID severa. Usando el ensayo de acondicionamiento del cortejo, se determinó que Dhap-at es requerido para la memoria a largo plazo, pero no paramemoria de corto plazo. Este resultado sirve como base para una investigación adicional de los mecanismos moleculares subyacentes.

Introducción

Los mecanismos moleculares subyacentes al aprendizaje y la memoria se conservan en muchas especies. El trabajo pionero de selección de líneas mutantes de Drosophila melanogaster para defectos en el aprendizaje olfativo y la memoria ha proporcionado ideas moleculares clave en los procesos subyacentes de aprendizaje y la memoria ¹ . Estos estudios identificaron algunos de los primeros genes implicados en el aprendizaje y la memoria, tales como el rutabaga ² , amnesiac ³ , y dunce ⁴ , lo que revela un papel crítico para la señalización de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) ⁵ .

Las pantallas genéticas tempranas para los mutantes de memoria se condujeron principalmente usando condicionamiento olfativo. Sin embargo, varios métodos para medir otras formas de aprendizaje y memoria han surgido con el tiempo. Uno de los paradigmas de aprendizaje y memoria más ampliamente utilizados, y el ensayo descrito aquí, se conoce como c, Que fue descrito por primera vez por Siegel y Hall ⁶ y posteriormente fue refinado por varios otros grupos de investigación ^{7 , 8 , 9} . El condicionamiento de la corteza depende de la presencia de una feromona específica, acetato de cis- vinceno (cVA), en el abdomen femenino, que es depositado por el macho durante la cópula. La detección de cVA en el abdomen femenino naturalmente reduce el comportamiento de cortejo, y cuando se acopla con el acto de rechazo por la hembra, el efecto de la cVA en la reducción del cortejo masculino se mejora dramáticamente. La respuesta de moscas machos en este ensayo puede ser fácilmente cuantificada observando su comportamiento distinto de cortejo, que se caracteriza por orientarse hacia y después de la hembra, tocando, extendiendo y vibrando el ala, lamiendo e intentando la cópula ¹⁰ ( Figura 1A ). Las moscas macho aprenden a distinguir H entre las hembras acopladas virgen y non-receptive ¹¹ , y después del rechazo sexual, exhiben comportamiento reducido del cortejo hacia las hembras non-receptive por hasta 9 días ⁸ . Este comportamiento natural se puede utilizar para dilucidar los mecanismos subyacentes de aprendizaje, memoria a corto plazo (STM), y la memoria a largo plazo (LTM) [ ^{8 , 9 , 12]} . Aprendizaje se define como la reducción inmediata en el comportamiento de cortejo que se produce durante el período de entrenamiento y se refiere a menudo como memoria de recuerdo inmediato, medido 0 - 30 min después de la exposición a una mujer apareada ^{6 , 8} . El STM se mide entre 30 min y 1 h después del entrenamiento, mientras que el LTM se mide con más frecuencia 24 h después del entrenamiento ⁸ ( Figura 1B ). El STM puede ser inducido usando un período de entrenamiento de 1 h, pero sólo dura 2-3 horasS = "xref"> 6 ^{, 8} . En la mayoría de los paradigmas de aprendizaje, el LTM sólo puede ser inducido por sesiones espaciadas de entrenamiento repetido. Mcbride et al . (1999) ⁸ mostraron que tres sesiones de entrenamiento espaciadas de 1 h fueron suficientes para inducir una memoria de cortejo de hasta 9 días, en contraste con las 2-3 h inducidas por una sola sesión de entrenamiento de 1 hora. McBride et al . ⁸ también demostraron que una sola sesión de entrenamiento de 5 horas produjo una respuesta de LTM similar por hasta 9 días. Las moscas no corren constantemente durante este período de 5 horas, produciendo de hecho su propio entrenamiento espaciado para inducir a LTM en una sola sesión de entrenamiento. Esto es muy importante desde una perspectiva práctica, aumentando enormemente la facilidad con la que este ensayo se puede utilizar para investigar LTM. Los protocolos actuales usan predominantemente una sola sesión de entrenamiento de 7 h para LTM ^{11 , 12} . Varios estudios han investigado diferentesMutantes que tienen defectos específicos en diferentes aspectos del aprendizaje del cortejo. Por ejemplo, la ablación del cuerpo de hongo afecta STM y LTM, pero no el aprendizaje ⁸ . Las mutaciones en el gen amnésico , que se definió por primera vez como un regulador específico de la memoria utilizando condicionamiento olfativo ³ , afectan a STM pero no aprenden ⁶ . La alteración del regulador de la traducción orb2 (subunidad oo18 de unión a ARN (orbe) CPEB2) y la señalización de ecdysone tienen un efecto exclusivo LTM ^{9 , 13} . Así, el condicionamiento del cortejo es un paradigma útil para disecar los mecanismos subyacentes a las diferentes etapas del aprendizaje y la memoria.

Este trabajo demuestra una configuración experimental optimizada que permite la prueba de relativamente alto rendimiento del condicionamiento del cortejo. Además, describe un guión de análisis estadístico y discute los factores críticos del ensayo. Es shPropio aquí que el gen Drosophila Dihydroxyacetone fosfato aciltransferasa ( Dhap-at ) Se requiere en las neuronas para LTM, pero no para STM. El ortólogo humano de este gen, la gliceronafosfato O-aciltransferasa ( GNPAT ), se ha mutado en la condrosis punctata tipo ^{14 14} rhizomelic, un trastorno autosómico-recesivo caracterizado por discapacidad intelectual severa, convulsiones y varias otras características clínicas ¹⁵ . En este contexto, el condicionamiento del cortejo puede ser utilizado para validar funcionalmente el papel de los genes de la enfermedad humana en el aprendizaje y la memoria, proporcionando una base para los estudios mecánicos.

Protocolo

NOTA: En el protocolo descrito a continuación, se describe una réplica de la recopilación, el entrenamiento y las pruebas. Para probar la reproducibilidad de los resultados, estos pasos deben repetirse en paralelo, en varios días, y con grupos separados de moscas ( Tabla 1) . El protocolo se basa en un ciclo de vida de 10 días desde el huevo hasta el adulto, lo que es normal cuando se crían moscas en condiciones constantes de 25 ° C, 70% de humedad y un ciclo de luz / oscuridad de 12 h. Todos los aspectos de este protocolo suponen que las condiciones se mantienen constantes durante todo el ensayo. Los tiempos se indican como horas antes de que las luces se enciendan (BLO) o después de que las luces se enciendan (ALO) en la incubadora, ya que ésta se puede ajustar convenientemente según la hora preferida del investigador. Utilizar sólo gas CO ₂ para la recolección inicial de moscas machos ingenuas y para la recolección de hembras prematadas. Este protocolo para el condicionamiento del cortejo se compone de los siguientes pasos:

1. miEstablecimiento de cultivos prematuros de hembras
2. Establecimiento de culturas para la recolección de sujetos de sexo masculino
3. Preparación de bloques de viviendas
4. Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras prematuros normalizadas
5. Colección de sujetos de prueba masculinos
6. Formación
7. Pruebas
8. Análisis y estadísticas de datos de vídeo

1. Establecimiento de culturas de recolección femenina prematura

1. Preparar la alimentación eléctrica ¹⁶ . Hervir agar de 0,8% (p / v), levadura al 8% (p / v), extracto de levadura al 2% (p / v), peptona al 2% (p / v), sacarosa al 3% (p / v) P / v) de glucosa, MgSO _ { ₄ } al 0,05% (p / v) y CaCl _ { ₂ } al 0,05% (p / v) en agua durante 15 min. Dejar enfriar la solución a 70 ° C antes de añadir 0,05% (p / v) de metilparabeno (PRECAUCIÓN: tóxico) y 0,5% (v / v) de ácido propiónico (PRECAUCIÓN: tóxico). Mezclar bien agitando mientras se enfría aún más hasta 50 ° C para obtener una solución homogénea.
2. Antes de la comidaSe ablanda a temperatura ambiente, agregue ~ 50 mL de alimento a cada vial de plástico de 175 mL. Deje que la comida se enfríe más. Cierre el vial con un tapón.
   NOTA: Powerfood es una mezcla especializada de alimentos formulada específicamente para la producción de un gran número de moscas, presumiblemente por inducir la puesta de huevos. Powerfood no se utiliza para producir moscas machos que se utilizarán para el análisis del comportamiento (paso 2) debido a que la dieta atípica y el apiñamiento potencial podrían influir en el desarrollo.
3. En el día -11 ( Tabla 1 ), se inician 5-20 cultivos de tipo salvaje con aproximadamente 60-100 moscas (una mezcla de machos y hembras) en viales de alimentación; Estos serán utilizados en el paso 4 para producir hembras prematuro estandarizadas [ ^17] . Añada un papel de filtro a cada vial para aumentar el área sobre la cual las larvas pueden pupar; Esto aumentará el número de moscas que pueden eclose.
4. Repita los pasos 1.1-1.3 periódicamente a lo largo del experimento para obtener suficientes moscas recién eclosantes como entrada para el"Establecimiento de viales de apareamiento para la producción de hembras prematadas estandarizadas" (paso 4).

2. Establecimiento de culturas para la recolección de sujetos de prueba masculinos

1. Preparar el alimento normal ¹⁶ , preparado con agar al 0,5% (p / v), 2,75% (p / v) de levadura, 5,2% (p / v) de harina de maíz, 11% (p / v) de azúcar, 0,05% ) Metilparabeno y 0,5% (v / v) de ácido propiónico en agua, como se describe en los pasos 1.1 y 1.2. Cierre los frascos de plástico de 175 ml con un tapón de vial mosca.
2. En el día -10 ( Tabla 1 ), coloque alrededor de 10-20 machos con aproximadamente 30-75 hembras virginales ( Tabla de Materiales / Equipo ) en cada vial de 175 mL que contenga alimento normal. Añadir un papel de filtro para aumentar la superficie de la pupación y para maximizar la productividad.
3. Establecer tres a seis viales de 175 mL por genotipo para obtener el número requerido de sujetos sujetos a prueba.
   NOTA: Es posible que se necesiten más viales, dependiendo de la productividad del gen deseadoTipo

3. Preparación de los bloques de alojamiento ( Figura 2A )

1. Derrita aproximadamente 50 ml de alimento de potencia por bloque de alojamiento en un microondas, o prepáralo fresco.
2. Agregue 500 μl de alimento de potencia a cada pocillo de un bloque de fondo plano de 96 pozos usando una pipeta multidispensadora.
3. Deje que los alimentos se solidifiquen a temperatura ambiente.
4. Cubra los bloques con una película adhesiva de PCR y utilice una aguja para hacer al menos 4 agujeros por pozo para proporcionar aire fresco a las moscas.
5. Para poder abrir cada pocillo, use una cuchilla de afeitar para cortar la película adhesiva longitudinalmente entre cada fila. Deje la película intacta en un extremo del bloque.
6. Los bloques se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 2 días.
   NOTA: Deje que los bloques vuelvan a equilibrarse a temperatura ambiente antes de su uso.

4. Establecimiento de frascos de apareamiento para la producción de hembras prematuras normalizadas

1. El día -1, retire yDescartar todas las moscas salvajes adultas de cultivos de hembras femeninas prematuros a las 2-5 h BLO.
2. Recoja moscas usando el aspirador ( Figura 2B ) de estos frascos en intervalos de 2 a 3 h ( por ejemplo, a 30 min, 2,5 h, y 5 h de ALO) y colóquelas en un nuevo vial de alimentación suplementado con una pequeña cantidad de levadura Pasta y papel de filtro.
3. Para evitar la aglomeración y para promover una atmósfera de acoplamiento óptima, no transfiera más de 150-200 moscas a cada nuevo vial. Asegurar el apareamiento de todas las hembras proporcionando por lo menos 25% de machos. Asegúrese de que haya suficientes hembras en los viales de apareamiento para acomodar el tamaño del experimento.
   NOTA: Como este es un paso crucial en el protocolo, asegúrese de que sólo las moscas recién cerradas y las viejas moscas, larvas o pupas no se transfieran al nuevo vial de apareamiento.
4. Incubar estos "frascos de apareamiento" durante cuatro días para dar tiempo suficiente para que todas las hembras se hayan apareado.

5. ColDe sujetos de prueba masculinos

1. En el día 1 ( Tabla 1 ) a las 2-3 h BLO, utilice CO ₂ para eliminar todas las moscas adultas de los viales de recogida masculina (etapa 2), Pero dejar que más moscas eclose durante las próximas horas.
2. En las próximas 5-6 h, retire las moscas recién cerradas cada 20-30 min usando CO ₂ y coloque cada macho en un pozo individual del bloque de alojamiento (paso 3) usando el aspirador ( Figura 2B ).
3. Volver a sellar el pozo con la película de PCR adhesiva.
   NOTA: Este es un paso crucial en el protocolo. Los machos deben ser recogidos con frecuencia. Los machos recolectados deben ser aislados en el bloque de vivienda cerca de la hora de la eclosión, cuando demuestren pigmentación pálida y la presencia del meconio en el abdomen translúcido.
   NOTA: El uso suave del aspirador permite la transferencia de moscas; Sin embargo, el uso inapropiado hará hincapié en las moscas, causando variación en el ensayo (véase la discusión).
4. Objetivo de coSe pueden detectar hasta 48 machos por genotipo. Esto proporciona un pequeño exceso al número máximo de machos necesario para el análisis de condiciones tanto ingenuas como entrenadas, permitiendo una cierta pérdida durante los pasos de transferencia posteriores.

6. Entrenamiento

1. Retire las moscas del vial de acoplamiento (paso 4.2) usando CO ₂ y separe las hembras prematura de los machos.
2. Usando el aspirador, añada una sola hembra anestesiada prematura a cada pocillo en una fila de un nuevo bloque de alojamiento.
3. Usando el aspirador y sin anestesia, transfiera un macho ingenuo individual del bloque de alojamiento establecido en el paso 5.2 al pozo que contiene una hembra prematura. Después de que el macho se coloca en el pocillo, volver a sellar inmediatamente con la película adhesiva; No permita que el macho escape.
   NOTA: Transfiera las moscas macho del aspirador al bloque de la vivienda aprovechando su comportamiento natural de "geotaxis negativa" (véase la discusión).
4. Repita los pasos6.2-6.3 hasta que se establezcan pares macho-hembra suficientes. Idealmente, establecer 24 parejas, dos filas completas de un bloque de vivienda, por genotipo. Deje a los machos ingenuos restantes en el bloque de alojamiento original establecido en el paso 5.2.
5. Deje los pares macho-hembra inalterados durante el período de entrenamiento ( Tabla 2 , Figura 1B ).
   NOTA: Durante este tiempo, el macho corte y será rechazado por la mujer prematura. Para el aprendizaje y STM, el período de formación es de 1 h y para LTM, el período de formación es de 7-9 h.
6. Termine el entrenamiento ( Tabla 2 , Figura 1B ) usando un aspirador para separar suavemente el macho de la hembra prematura; No use anestesia. Coloque el macho separado en un nuevo bloque de vivienda.
7. Utilice el aspirador para transferir a todos los machos ingenuos suavemente y sin anestesia desde el bloque de alojamiento establecido en el paso 5.2 a un nuevo bloque de alojamiento.
   NOTA: Este paso es opcional para STM y leaPero es muy importante para LTM porque las moscas se alojan durante 24 h adicionales para probar LTM.
8. Para STM y LTM, permita que los machos descansen durante 1 h y ~ 24 h, respectivamente ( Tabla 2 , Figura 1B ) antes de la prueba (paso 7).
9. Para el aprendizaje, pruebe inmediatamente a los machos entrenados e ingenuos (paso 7).

7. Pruebas

1. Recoja las moscas de los viales de apareamiento (paso 4.2) utilizando CO ₂ y separe las hembras prematura de los machos.
2. Deje que las hembras se recuperen de la anestesia durante al menos 1 h en un vial que contiene alimentos normales.
3. Monte las grabadoras de vídeo de antemano ( Figura 2C ), para tener todo el equipo listo antes de que comience la prueba.
4. Comience la prueba de acuerdo a los diferentes plazos para el aprendizaje, STM y LTM ( Tabla 2 , Figura 1B ). Realice las pruebas inmediatamente después del entrenamientoPara el aprendizaje, 1 h después de la formación para STM, y 24 h después de la formación para LTM.
5. Utilizando el aspirador, transfiera suavemente un macho individual del bloque de alojamiento en reposo o del bloque de alojamiento de entrenamiento si se está probando (paso 6.7, entrenado, paso 6.8, ingenuo) a la mitad de un campo de cortejo con el divisor cerrado ( Figura 2D (Véase el archivo S1 para un plan de construcción).
   NOTA: El uso de la conducta natural de "geotaxis negativa" debe ser suficiente para transferir las moscas macho del aspirador al campo de cortejo (Discusión).
6. Rápidamente pero suavemente mover el agujero de entrada a la siguiente arena y repita el paso 7.5 hasta que todos los 18 arenas contienen un macho.
7. Usando el aspirador y sin CO ₂ , añada una hembra prematura (recogida en el paso 7.2) a la otra mitad de los 18 arenas.
8. Cuidadosamente coloque la cámara de cortejo debajo de la cámara, con la apertura de los pozos hacia abajo ( Figura 2C ).
9. Quite el divisor de las arenas para permitir la interacción directa entre los machos y las hembras prematadas.
10. Empiece inmediatamente a registrar el comportamiento durante al menos 10 min.
    NOTA: Cuando se utiliza una configuración de dos cámaras, la grabación paralela de dos placas de corte puede hacerse en marcos de tiempo superpuestos para maximizar la eficiencia.
11. Vaciar las arenas de cortejo usando una aspiradora de mano y permitir que la cámara de cortejo para ventilar antes de su reutilización.
12. Repita el paso 7.4-7.11 hasta que se hayan completado las pruebas de todos los genotipos y condiciones ( es decir, ingenuo y entrenado).

8. Análisis y estadísticas de datos de vídeo

1. Calcular el índice de cortejo (IC), definido como el porcentaje de tiempo que el varón corteja durante los primeros 10 min del período de prueba, para cada mosca masculina individual.
   NOTA: Esto se puede hacer manualmente observando el comportamiento estereotipado de cortejo ( Figura 1A ) o por uCantar software de computadora para la cuantificación automatizada del comportamiento del cortejo (discusión).
   NOTA: Se recomienda analizar 40-60 varones por condición durante el transcurso de tres días con el fin de lograr suficiente poder estadístico y para juzgar la consistencia de los datos CI.
2. Calcular el índice de aprendizaje (LI), definido como el porcentaje de reducción en el CI medio de los hombres entrenados en comparación con los machos ingenuos (LI = (CI _naive - CI _entrenado ) / CI _naïve ). Evaluar la LI para cada día de prueba y compararlo con el LI acumulativo calculado de todos los días de prueba combinados.
3. Haga un archivo de datos de tabulación separado de dos columnas con "Genotype" y "CI" como encabezados.
   NOTA: Estos encabezamientos distinguen entre mayúsculas y minúsculas. El nombre del genotipo de cada CI debe consistir en una descripción del genotipo seguida de un subrayado y la condición de entrenamiento ( por ejemplo, genotype_N y genotype_LTM, etc., donde N = ingenuo y LTM = largo plazomemoria; Vea el archivo suplementario S2 para un ejemplo). Esta anotación es esencial, ya que la función analearn identificará moscas entrenadas e ingenuas basadas en los caracteres presentes después del primer guión bajo en la columna "Genotipo".
4. Utilice el script analearn R (archivo suplementario S3) para realizar una prueba de aleatorización para juzgar la significación estadística de las diferencias entre los valores de LI de diferentes genotipos.
   1. Fuente de la secuencia de comandos (Supplemental File S3) en R ¹⁸ , que define una función llamada "analearn".
      NOTA: La definición de la función es: analearn <- function (nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie la función introduciendo "analearn ()" en la línea de comandos R y seleccionando el archivo de datos a analizar (producido en el paso 8.3) a través de la ventana emergente.
   3. Elija la mutación de referencia, queEs el genotipo de control, introduciendo el número correspondiente y pulsando enter.
      NOTA: Después de seleccionar el genotipo de referencia, la secuencia de comandos tarda varios segundos en realizar 10.000 réplicas de inicio.
   4. Obsérvese la tabla de resultados (tabla 3), que contiene el genotipo, la condición de aprendizaje ( es decir, el aprendizaje, STM o LTM), la media de CI naïve, la media CI entrenada, LI, la diferencia entre la LI del control en comparación con la condición experimental (LI di), el límite inferior (LL) y el límite superior (UL) del intervalo de confianza del 95% del LI di, y el valor p indica la probabilidad de que no haya diferencia significativa.
      NOTA: analearn almacenará un archivo de texto de salida en el directorio donde se encuentra el archivo de datos. Sin embargo, la tabla de salida también aparece en la consola de R-Studio. El nombre predeterminado se construye basado en el nombre del archivo de datos proporcionado.
   5. Hay varios argumentos en la función analógica que se pueden usar para alterar elAjustes de fallo de la función para ajustar los parámetros del arranque.
      NOTA: "nboot" define el número de réplicas de inicio y se establece en 10.000 por defecto. Este valor se puede cambiar en cualquier número entero mayor que cero. La Tabla 5 incluye varios argumentos que pueden usarse para alterar los ajustes predeterminados de la función. Sin embargo, no se recomienda utilizar datos que se producen con un número bajo de réplicas de arranque.

Resultados

El ensayo de acondicionamiento del cortejo puede usarse para medir el aprendizaje y la memoria en Drosophila . Con el fin de demostrar esto, los resultados presentados aquí analizar STM y LTM en moscas de control en comparación con las moscas con la neurona específica knockdown de Dhap-at. Los machos de control expresan una secuencia de horquilla de interferencia de ARN dirigida a un gen específico de Caenorhabditis elegans , proteína putativa de dedo de zinc C02F5.12 ¹⁹ . Esta cepa de control asegura un número igual de elementos de secuencia de activación aguas arriba (UAS) entre el knockdown y el control en el mismo fondo genético, y la horquilla de control RNAi explica cualquier efecto no específico del sistema RNAi. Los machos de control (genotipo: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) muestran una reducción significativa en la CI en los entrenados versus naïve para ambos STM ( Figura 3A , p = 1,2 x 10 ^{- 4} , Mann-WhitneY U - test) y LTM ( Figura 3B , p = 1,2 x 10 ^ {- 4}, U - test de Mann - Whitney). Este resultado refleja la capacidad normal de aprendizaje y memoria en estas moscas. También se observa una reducción significativa de IC en las moscas entrenadas versus naïve para el STM ( Figura 3A , p = 1 ) , y en las moscas derribadas Dhap-at (genotipo: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / 1,2 x 10 ^ {- 4}, ensayo U de Mann - Whitney). Sin embargo, no muestran una reducción significativa en la CI después de la formación LTM ( Figura 3B , p = 0,33, Mann-Whitney U-test). La U-test de Mann-Whitney se utilizó para comparar la CI media de las moscas naïve y entrenado debido a la distribución no paramétrica de los datos de CI para algunas condiciones ( Figura 3A y 3B ). Las diferencias observadas a través del análisis de IC se reflejan en la LI para cada genotipo, que mide el porcentaje de reducciónOn en CI en naïve frente a las moscas entrenadas ( Figura 3C ]. No hay diferencia significativa en LI entre los controles y Dhap-en knockdown moscas de STM ( p = 0,115, 10.000 réplicas de arranque, Figura 3C , Tabla 3 ], mientras que el LI de LTM es significativamente menor en Dhap-a knockdown moscas ( p = 0,0034, 10.000 replicas de arranque, Figura 3C , Tabla 3 ). Para la comparación de LI entre genotipos, una prueba de aleatorización ²⁰ adaptada de un método recomendado por primera vez por Kamyshev et al. ⁷ . Dado que la LI es un valor único derivado de datos de población ( es decir, media CI-naïve y media CI-entrenados), los métodos estadísticos estándar que se basan en distribuciones derivadas experimentalmente no se aplican. La prueba de aleatorización es libre de distribución y utiliza bootstrapping ( es decir, sampli al azarNg con reemplazo) para generar conjuntos de datos hipotéticos que se derivan de los datos reales. El script analearn (File S3) genera un conjunto de hipotéticos LIs para cada genotipo y calcula la diferencia entre el control y el genotipo de prueba (LIdiff). Este proceso se repite 10.000 veces y los valores resultantes se utilizan para determinar el intervalo de confianza del 95% de LIdiff ( Tabla 3 ). Estos datos se utilizan para generar un valor p que indica la probabilidad de que la LI de los dos genotipos sea diferente. Los resultados mostrados aquí demuestran que Dhap-at se requiere en las neuronas para LTM, pero no para STM.

Con el fin de controlar la variabilidad diaria, ICs y LIs se comparan entre los días de repetición ( Tabla 4 ]. Aunque se observa cierta fluctuación en LI de un día a otro, los resultados son generalmente reproducibles. Es importante tener en cuenta que los datos de CI pueden variar mucho dependiendo de la str de controlY las condiciones ambientales de las pruebas. Los datos de CI que se muestran aquí son típicos para este genotipo de control, pero otros genotipos pueden presentar una CI media y media más alta o más baja.

Figura 1: Determinación del índice de cortejo y panorama experimental. ( A ) Imágenes que muestran un comportamiento estereotipado de cortejo masculino hacia una mosca hembra. Se muestran las diferentes etapas del comportamiento de cortejo: orientación (I), seguimiento (II), vibración (extensión) y vibración (III), lamiendo (IV) e intento de cópula (V). ( B ) Vista general esquemática de los tiempos de entrenamiento y prueba en relación con el ciclo de luz de la incubadora, marcado en horas. Los tiempos de entrenamiento se indican con barras, los períodos de reposo para STM y LTM se indican con una línea discontinua y el punto de inicio de la prueba se indica como una flecha. Tenga en cuenta que elEl tiempo de prueba para LTM es el día después de la capacitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Equipo utilizado para el ensayo de condicionamiento de corte de Drosophila. ( A ) El bloque de alojamiento es un bloque de fondo plano con 500 μl de alimentación por pozo. Se sella con una película adhesiva qPCR con al menos 4 orificios por pocillo que se crearon usando una aguja de jeringa con un diámetro de 0,8 mm. Las filas individuales se cortan longitudinalmente en tiras usando una cuchilla de afeitar para permitir la apertura y el cierre. ( B ) El aspirador es necesario para la transferencia suave de moscas macho y hembra sin el uso de anestesia. La inserción muestra la punta del aspirador, cerrada con un pedazo de algodón a keEp las moscas dentro de la punta. ( C ) Configuración de un sistema de dos cámaras para el registro simultáneo de dos cámaras de cortejo. ( D ) Una cámara de corteza con 18 arenas. Los agujeros deslizantes de entrada se utilizan para colocar las moscas en las arenas. Los divisores blancos pueden ser abiertos simultáneamente para iniciar la interacción entre los machos y las hembras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de STM y LTM en control y Dhap-en Knockdown moscas. ( AB ) Boxplots que muestran la distribución de los valores de CI para las moscas ingenuas (N) y entrenadas (T) de los genotipos testigo (gris) y Dhap-en knockdown (blanco) probados para STM (A) y LTM (B). ( C ) CorrespoNding LI valores para el control y Dhap-at knockdown moscas probado para STM y LTM. Las diferencias en LI entre el control y knockdown genotipos se compararon mediante una prueba de aleatorización (10.000 réplicas de bootstrap). Las barras de error indican el error estándar de la media derivada de los valores de LI calculados en diferentes días de prueba. Los genotipos son: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE - 260B / + ; Y elav-Gal4 / + (Control) Y w ^ {+}, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE - 260B / +; Y elav-Gal4 / + ( Dhap-at- ARNi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	General	Recoger	Tren	Prueba
Día -11	Iniciar cultivos de recolección de hembras prematadas (paso 1.3)
Día -10	Iniciar cultivos para la recolección de sujetos de prueba masculinos (paso 2.2)
día 1		reps. 1
dia 2		reps. 2
día 3		reps. 3
día 4		reps. 4	reps. 1
Día 5			reps. 2	reps. 1
Día 6			reps. 3	reps. 2
Día 7			reps. 4	reps. 3
Día 8				reps. 4
Día 9	Análisis y estadísticas de datos de vídeo (paso 8)
Rep = repetir

Tabla 1 : Ejemplo de línea de tiempo para probar LTM sobre tres repeticiones en días individuales.

	Aprendizaje	STM	LTM
Tiempo de entrenamiento	1 h.	1 h.	8 h.
Tiempo de descanso	0 h.	1 h.	~ 24 h.
empezar a entrenar	0marido. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
Detener el entrenamiento	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
Comenzar la prueba	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (día siguiente)
ALO = después de encender las luces, BLO = antes de encender las luces, STM = memoria de corto plazo, LTM = memoria a largo plazo

Tabla 2 : Duración de la Capacitación, Tiempos de Capacitación y Tiempos de Prueba para el Aprendizaje, STM y LTM.

Genotipo	Aprendizaje condición	CI ingenuo	CI entrenado	LI	LI diferencia	Límite inferior (95% de intervalo de con fi ciencia)	Limite superior (95% de intervalo de con fi ciencia)	P valor
Controlar	STM	0,467	0.116	0,752	N / A	N / A	N / A	N / A
Dhap-at-RNAi	STM	0,699	0,257	0,633	0.119	-0,030	0,265	0.116
Controlar	LTM	0,590	0,384	0,348	N / A	N / A	N / A	N / A
Dhap-at-RNAi	LTM	0,697	0,650	0,068	0,280	0.103	0,446	0,003

Tabla 3: Datos estadísticos producidos a partir de la secuencia analógica.
Datos estadísticos producidos a partir de la secuencia analógica. El archivo de salida del R-script bootstrap que contiene el genotipo, la condición de aprendizaje ( es decir, el aprendizaje, STM o LTM), media CI naïve, media CI entrenado, LI, diferencia entre LI del control en comparación con la condición experimental (LI dif) , El límite inferior (LL) y el límite superior (UL) del intervalo de confianza del 95% de LI di, y el valor p indica la probabilidad de que no haya diferencia significativa.

		Controlar			Dhap-at-RNAi
		CI media ingenua	CI medio entrenado	LI	CI media ingenua	CI medio entrenado	LI
STM	Día 1	0,300	0,125	0,584	0,679	0,239	0,648
	Dia 2	0,634	0.107	0,831	0,720	0,276	0,617
	Todos los días	0,467	0.116	0,752	0,699	0,257	0,633
LTM	Día 1	0,590	0,441	0,252	0,630	0,646	-0,027
	Dia 2	0,640	0,363	0,432	0,709	0,710	-0,002
	Día 3	0,547	0,349	0,363	0,738	0.598	0,190
	Todos los días	0,590	0,384	0,348	0,697	0,650	0,068

Tabla 4 : Valores de CI y LI obtenidos en días de ensayo separados.

"Naivelevel" determina el texto que identificará los valores naïve para cada genotipo. El valor predeterminado es "N", pero puede cambiarse a cualquier otro texto alfanumérico.

"Refmutation" se establece en "NA" (no aplicable) de forma predeterminada, pero puede cambiarse al nombre del control o del genotipo para realizar comparaciones estadísticas. Esto hará que los sCript para seleccionar automáticamente el genotipo de control.

"Datname" se refiere al nombre del archivo de datos y se puede especificar en este argumento en lugar de la selección de archivo predeterminada.

"Encabezado" se puede utilizar para indicar si el archivo de datos contiene encabezados de columna o no. El valor predeterminado es "TRUE", pero se puede utilizar un archivo sin encabezados cuando este argumento cambia a "FALSE".

"Seed" inicializa el generador de números aleatorios, que se establece de forma predeterminada en "NA" y asegura un número aleatorio cada vez que se utiliza el script. Por diseño, un análisis de arranque dará resultados ligeramente diferentes cada vez que se ejecuta, incluso cuando se utiliza el mismo archivo de datos. Cuando la semilla se especifica por cualquier número entero mayor que cero, se obtiene el mismo conjunto de muestras de arranque aleatorio.

"escribir Put "se puede establecer en" TRUE "o" FALSE "para determinar si se generará un archivo de salida. El defecto es cierto."

Tabla 5: Argumentos utilizados en la función analógica que pueden alterar los ajustes predeterminados de la función para ajustar los parámetros del arranque

Archivo suplementario S1: Plan de construcción de una cámara de cortejo. El archivo se puede abrir con cualquier aplicación que permita extensiones .stp (archivos CAD) . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario S2 : Ejemplo de un archivo de entrada para el Script Analearn .S2.zip "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario S3 : El Analearn.R Acript. El archivo se puede abrir con R-studio ¹⁸ . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El ensayo del condicionamiento del cortejo es un paradigma clásico para el análisis del aprendizaje y de la memoria en Drosophila . El protocolo presentado aquí sigue la metodología general descrita anteriormente ^{6 , 7 , 8 , 9} pero incluye aspectos únicos tales como directrices prácticas, equipo especializado y un guión de análisis de datos ^{9 , 12} para pruebas de asignación al azar. Utilizando este protocolo, es posible analizar un gran número de moscas en paralelo utilizando bloques de fondo plano de 96 pozos ( Figura 2A ) para recolectar y entrenar a machos. Los bloques se sellan con la película adhesiva de la PCR, que hace las moscas fácilmente accesibles cuando está requerido. Además, las cámaras de cortejo únicas descritas aquí permiten el emparejamiento simultáneo de 18 pares de hombres y mujeres en un espacio casi bidimensional que iS óptimo para el análisis de vídeo. Las cámaras de cortejo diseñadas a medida son fáciles de usar y se proporciona un plan de construcción ( File S1 , Figura 2D ). Este protocolo, desde el establecimiento de los cultivos utilizados para recoger los sujetos de prueba hasta la adquisición de datos de video, toma aproximadamente 20 días ( Tabla 1 ). Se requiere tiempo adicional para el análisis de datos de vídeo. En nuestra experiencia, el ensayo STM es extremadamente robusto. El ensayo LTM también es bastante robusto, pero es más sensible a las variables ambientales de confusión y por lo tanto puede ser más difícil de dominar.

El comportamiento animal puede ser bastante variable. Por lo tanto, los pasos críticos en el protocolo deben ser realizados con cuidado para reducir esta varianza. En primer lugar, el uso suave del aspirador ( Figura 2B ) reducirá el estrés que puede ser impuesto por manipulación brusca o soplando demasiado fuertemente. Un método sugerido para transferirVuela fuera del aspirador es usando geotaxis negativo. Como moscas tienden a caminar hacia arriba, uno puede simplemente señalar la punta del aspirador para arriba; Justo antes de que la mosca alcance la punta, un golpe suave es suficiente para dejar salir la mosca. Además, para permitir que los machos en las cámaras de cortejo antes de las pruebas, un golpe a menudo no es necesario.

Otro paso importante es la recolección y generación de sujetos de prueba masculinos. Todos los varones deben ser recolectados cuando son muy jóvenes y socialmente ingenuos. Esto puede lograrse mediante la recogida frecuente durante los períodos pico de eclosión (paso 5.2). Si los hombres no se recolectan en este estrecho margen de tiempo, pueden tener interacciones sociales tempranas, lo que puede resultar en un aprendizaje deficiente o una alta variabilidad en CI. Otro factor de los sujetos de prueba masculinos que deben ser evaluados es el antecedente genético. Los diferentes antecedentes genéticos exhibirán diferentes niveles de cortejo ingenuo y también pueden diferir en actividad general o capacidad locomotora. Cuando compaLos genótipos múltiples de anillo, se debe tener cuidado con respecto a los antecedentes genéticos con el fin de evitar estos factores de confusión que pueden influir en las puntuaciones LI. Además, la distribución de los datos de CI debe evaluarse cuidadosamente. Los datos de CI pueden ser tanto paramétricos como no paramétricos, dependiendo del genotipo u otros factores ambientales. En algunos casos, si la distribución de IC se desvía dramáticamente de una distribución normal, puede ser mejor usar la IC mediana que la media para el cálculo de LIs. Sin embargo, en nuestra experiencia, el uso de la CI media o media no hace ninguna diferencia en la interpretación estadística de los datos, y el uso de la CI media es la práctica común en la literatura.

Para el condicionamiento acertado del cortejo, el rechazo activo de los intentos masculinos del cortejo por las hembras prematadas es crucial durante el período de entrenamiento. Es importante asegurarse de que las hembras prematadas usadas en este ensayo han sido acopladas eficientemente y sonNo permitiendo así la cópula. Esta prematura se establece en los viales de apareamiento preparados en la etapa 4, donde las moscas macho y hembras se alojan juntas durante 4 días ( Tabla 1 ). Posteriormente, el apareamiento puede ser monitoreado mediante el examen regular de videos de prueba y observando pares de hombres y mujeres durante el entrenamiento. Si el apareamiento ocurre, hay varias medidas que se pueden tomar durante la preparación de las hembras prematadas. En primer lugar, las hembras prematadas deben ser criadas en condiciones óptimas de cría. Los viales se pueden complementar con pasta de levadura y un papel de filtro plegado para aumentar las posibles superficies de apareamiento. La incubación de moscas en las condiciones descritas aquí ha producido robustas hembras prematadas en el pasado, pero esto puede variar en diferentes laboratorios y con el uso de diferentes cepas genéticas. Por lo tanto, puede ser necesario optimizar la generación de hembras prematadas variando el tiempo y las condiciones de incubación.

La cuantificación del comportamiento del cortejo esOtro paso crítico en este protocolo. Esto puede hacerse de forma manual o automática utilizando programas de software especializados ⁹ . La cuantificación automatizada es rápida y, en principio, imparcial. Varios programas han sido publicados ^{21 , 22 , 23} ; Sin embargo, no son fáciles de usar, a menudo requieren formatos de video especializados y habilidades computacionales avanzadas. La cuantificación manual es fácil y precisa, pero es muy intensiva en mano de obra y está sujeta a la variabilidad y sesgo individual. Es importante enfatizar que este protocolo no aborda los requisitos para el formato de video que son potencialmente requeridos para la cuantificación automatizada de ICs. Para la cuantificación manual, utilice cualquier dispositivo simple de grabación de video que tenga el potencial de producir un video de calidad suficiente para observar con precisión el comportamiento del cortejo. Para la cuantificación automatizada, es probable que hayaDependiendo del software utilizado, y los usuarios deben investigar esto detenidamente si se desea una cuantificación automatizada.

En combinación con las extensas herramientas disponibles para la manipulación genética de las moscas, el ensayo de condicionamiento del cortejo proporciona una lectura robusta que puede usarse para disecar los mecanismos moleculares y las redes neuronales involucradas en el aprendizaje y la memoria.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-