Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Resumen

En este sentido, se presenta un protocolo para aislar endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci a través de la disección y la filtración. Después de la amplificación, las muestras de ADN son adecuadas para la posterior secuenciación y estudio del mutualismo entre los endosimbiontes y la mosca blanca.

Resumen

Los simbiontes bacterianos forman una relación íntima con sus huéspedes y otorgan ventajas a los huéspedes en la mayoría de los casos. La información genómica es fundamental para estudiar las funciones y la evolución de los simbiontes bacterianos en su huésped. Como la mayoría de los simbiontes no pueden cultivarse in vitro , los métodos para aislar una cantidad adecuada de bacterias para la secuenciación del genoma son muy importantes. En la mosca blanca Bemisia tabaci , se ha identificado una serie de endosimbiontes y se prevé que sean importantes en el desarrollo y la reproducción de las plagas mediante múltiples enfoques. Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. El obstáculo proviene parcialmente del hecho de que los endosimbiontes en la mosca blanca, en su mayoría restringidos en bacteriocitos, son difíciles de separar de las células huésped. Aquí presentamos un protocolo paso a paso para la identificación, extracción y purificación de endosimbiontes de la mosca blanca B. tabaci principalmente por disectiY filtración. Las muestras de endosymbiont preparadas por este método, aunque todavía son una mezcla de diferentes especies endosymbiont, son adecuadas para secuenciación subsecuente del genoma y análisis de las posibles funciones de los endosimbiontes en B. tabaci . Este método también puede usarse para aislar endosimbiontes de otros insectos.

Introducción

Las bacterias que forman una relación simbiótica íntima con huéspedes relativos están muy extendidas en los artrópodos ¹ . Se ha demostrado que los endosimbiontes afectan aspectos de los huéspedes, como el metabolismo nutricional, la reproducción, las respuestas a las tensiones ambientales ^{2 , 3 , 4} , etc. , en casi todas las etapas del desarrollo ⁵ . Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. La genómica es de prioridad e importancia al estudiar las posibles funciones y funciones de las bacterias. Algunos datos fundamentales, es decir , el estado taxonómico, los genes funcionales, las vías del metabolismo, los sistemas de secreción, se puede inferir a partir de las secuencias del genoma, que arroja luces sobre el papel potencial de los simbiontes en la simbiosis. Con el desarrollo de secuenciación de alto rendimiento, un gran número de genomas bacterianos han sido secuenciados wCon diversas funciones reveladas ⁶ .

Los endosimbiontes son de vital importancia en los hemípteros, como los áfidos ⁷ , las chinches ⁸ , los psílidos ⁹ , los saltamontes marrones ¹⁰ y las cigarras ¹¹ . Por ejemplo, se ha demostrado que Buchnera en áfidos, como el simbionte obligado, está implicado en la biosíntesis de aminoácidos esenciales, junto con los genes del genoma de áfidos ¹² . Además, la regulación transcripcional de Buchnera también se revela [ ^13] . En los psílidos , Carsonella es secuenciado y clasificado como el genoma bacteriano más pequeño jamás encontrado ¹⁴ . Todas estas características de endosymbionts se basan e inferir a partir de las secuencias del genoma. Debido a que estos endosimbiontes no pueden cultivarse in vitro , se han aplicado varios métodos para aislar bacterias adecuadas para seqCión. En los áfidos, endosymbionts se extraen a través de la centrifugación y la filtración, y sometidos a más genómica y transcriptomic análisis [ ^5] . En los saltamontes marrones, los endosimbiontes se secuencian junto con el genoma del insecto ¹⁰ .

Whitefly B. tabaci es un complejo de especies que contiene más de 35 especies morfológicamente indistinguibles (especies crípticas), entre las cuales, dos especies invasoras han invadido todo el mundo y causado un daño tremendo a la producción agrícola ¹⁵ . De nota, endosimbiontes dentro de la especie B. tabaci han demostrado importancia en el desarrollo de las plagas [ ^16] . Hasta la fecha, se han identificado ocho endosimbiontes en la mosca blanca, incluyendo el simbionte obligado, Candidatus Portiera aleyrodidarum y siete simbiontes secundarios Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em> Wolbachia, Fritschea y Hemipteriphilus definidos ^{17 , 18} .

A diferencia de los hemípteros descritos anteriormente, la mosca blanca B. tabaci es un insecto extremadamente pequeño de sólo 1 mm de longitud. La mayoría de los endosimbiontes están confinados a bacteriocitos ¹⁹ (células especializadas que contienen simbiontes, que forman bacteriomas en B. tabaci ). Además, estos endosimbiontes no pueden cultivarse in vitro . La única forma de obtener endosimbiontes de B. tabaci es diseccionar la bacterioma. Sin embargo, hay dificultad en la disección. En primer lugar, el bacterioma frágil siempre se vincula con otros tejidos de la mosca blanca, que es difícil de separar. En segundo lugar, el pequeño tamaño de la mosca blanca limita el aislamiento de bacteriomas suficientes. En tercer lugar, endosymbionts cluster en la bacterioma, por lo que es extremadamente complicado para adquirir una sola especie de bacteria.

Aquí, informamos de un protocolo simple y barato para aislar whitefly endosymbionts para subsiguiente secuenciación metagenome. A través de la disección, la purificación y la amplificación, se pudo obtener ADN endosimbionto adecuado y se pudo confirmar la especie de bacteria. El protocolo descrito se puede utilizar de manera similar en otros artrópodos.

Protocolo

1. Identificación de especies blancas y de cría de moscas blancas

1. Mantener las especies de mosca blanca en el algodón Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) en jaulas bajo condiciones estándar de 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% de humedad y 14 h de luz: 10 h de régimen oscuro.
2. Recoger una mosca blanca adulta individual y homogeneizar en 30 μl de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, Tween-20 al 0,45% [p / v], gelatina al 0,2% [p / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K).
3. Incubar el homogeneizado a 65 ° C durante 1 hy luego 100 ° C durante 10 min.
   NOTA: El tiempo de incubación a 65 ° C puede aumentarse si es necesario. El tiempo de incubación a 100 ° C debe ser controlado críticamente para inactivar suficientemente la proteinasa K y evitar el daño del ADN.
4. Realice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el ADN de la mosca blanca (adquirido en la sección 1.3) basado en los cebadores mitocondriales de la citocromo oxidasa I.
   COI - F: 5'- TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT - 3 '
   COI - R: 5'- TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA - 3 '
   1. Realizar las reacciones de PCR en un volumen final de 25 μL que contiene 1 U de ADN polimerasa Taq , 2,5 μl de tampón 10x, dNTP 0,2 mM, 0,2 mM de cada cebador y 2 μl de ADN de mosca blanca.
   2. Utilice las siguientes condiciones de procedimiento de PCR: desnaturalización inicial 95ºC durante 3 min seguido de 35 ciclos de 95ºC durante 45 s (desnaturalización), 50ºC durante 45 s (recocido) y 72ºC durante 1 min (extensión) y Otros 10 minutos a 72 ° C para una mayor extensión.
5. Limpiar el producto amplificado por PCR utilizando un kit de extracción de gel de ADN con el protocolo recomendado.
6. Secuencia de las muestras de ADN purificado con un sistema de secuenciación de muestras de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
7. Analizar las secuencias utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) para identificar las especies crípticas de la mosca blanca y evitar la contaminación de otras especiesEs

2. Endosymbiont Identificación y localización

1. Realizar PCR en el ADN de la mosca blanca (adquirido en el Paso 1.3) para amplificar los genes específicos de cada endosimbionta dentro de la mosca blanca (la receta PCR se describe en la sección 1.4, y los procedimientos de PCR y los cebadores se enumeran en la Tabla 1 ).
2. Sujetar la muestra amplificada a electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con el protocolo ²⁰ previamente publicado (gel de agarosa al 1%, Tris-acetato-EDTA como tampón de funcionamiento, voltaje 5 V / cm) para identificar el gen específico de cada bacteria.
3. Recuperar y secuenciar cada banda para determinar las especies bacterianas dentro de la mosca blanca (ver secciones 1.5-1.7).
4. Realizar hibridaciones fluorescentes in situ (FISH) en la mosca blanca para identificar la ubicación de los endosimbiontes de acuerdo con el protocolo publicado anteriormente [ ^19] .
   NOTA: Si es necesario, aumente la concentración de las sondas fluorescentes.

3. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

1. Sumergir y fijar moscas blancas en tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) que contiene 2,5% [vol / vol] de glutaraldehído durante 4 h.
2. Lavar las muestras en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) tres veces, 15 min cada vez.
3. Sumerja y vuelva a fijar las muestras en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) que contenga 1% [p / v] de OsO ₄ durante 2 h.
4. Deshidratar las muestras con una serie graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100%), 15 min cada vez.
5. Transferir y sumergir las muestras en acetona al 100% durante 20 min.
6. Colocar las muestras en una mezcla de 100% de acetona y 100% de resina Spurr (1: 1) durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Transferir las muestras a una mezcla de 100% de acetona y 100% de resina Spurr (1: 3) durante 3 h a temperatura ambiente.
8. Transferir y sumergir las muestras en 100% de resina Spurr (incubadas a 70 ° C) durante más de 9 h.
9. Sección de las muestras de mosca blanca mediante el uso de un microa mi.
10. Mancha las películas ultrafinas (adquiridas en la sección 3.9) por inmersión en acetato de uranilo absoluto durante 5-10 min, seguido de inmersión en 50% de citrato de plomo alcalino durante otros 5-10 min.
    NOTA: Los volúmenes de reactivos utilizados en la sección 3.1-3.10 dependen de las muestras. Asegúrese de que las muestras estén sumergidas en los reactivos.
11. Observe las muestras bajo microscopía electrónica de transmisión (15.000X) para determinar la localización, forma y tamaño de las bacterias para su uso posterior (ver sección 4.6).

4. Diseminación y Purificación de Bacteriomas de la Mosca Blanca

1. Añadir 100 μl de 1x solución de PBS sobre una lámina de microscopio. Elija algunas ninfas de 3 o 4 ^st instar de hojas de algodón y sumerja en la solución de PBS.
2. Utilice agujas entomológicas finas bajo un estereomicroscopio y tire de los bacteriomas del cuerpo de la mosca blanca.
   1. Cortar suavemente un agujero en un lado de la ninfa, y presionar ligeramente el otroLado para dejar salir a los bacteriomas.
3. Montar un microprocesador de 20 μL (con el corte del extremo delantero para alcanzar el tamaño de bacterioma) en una pipeta de 0.5-10 μL. Extraer la bacterioma individual de la solución de PBS en el microloader.
4. Lavar el bacterioma para eliminar la contaminación de otros tejidos de mosca blanca mediante la pipeta de la bacterioma en la solución de PBS y la extracción de la bacterioma. Repetir tres veces.
5. Pipetar inmediatamente la bacterioma lavada en un tubo de centrífuga que contenga 60 μl de una solución de 1x PBS.
6. Jeringa-filtro de la bacterioma montado a través de una membrana de filtro de 5 μm (determinado por los tamaños de bacterias y el núcleo de bacteriocitos en la mosca blanca). Repita varias veces para mover el líquido mezclado a través de la membrana del filtro a fondo.
   NOTA: Para lograr un mejor resultado de amplificación y secuenciación, ensamble más de 100 bacteriomas. Humedezca primero la membrana del filtro utilizando 1x solución de PBS para disminuir la pérdida de bacteriasUnión a la membrana.

5. Amplificación de genomas de Endosymbiont

1. Ampliar el filtrado (que contiene principalmente endosimbiontes de la mosca blanca) utilizando un kit de amplificación de ADN según el protocolo recomendado con alguna modificación.
   1. Elija el protocolo recomendado de amplificación del ADN genómico de sangre o células y prepare el tampón D2 para el experimento posterior.
   2. Agregue directamente 1,5 μl de filtrado (ver sección 4.6) al tubo de centrífuga, seguido de 1,5 μl del Tampón D2 y mezcle bien.
   3. Incubar en hielo durante 10 minutos y agregar 1,5 μ l de la solución de parada.
   4. Añadir 15 μl del tampón de reacción y 1 μl de la ADN polimerasa y mezclar suavemente.
   5. Incubar la mezcla a 30 ° C durante 16 h, seguido de 3 min a 65 ° C.
2. Realice PCR directamente en el filtrado amplificado (diluya las muestras amplificadas si es necesario) usando cebadores específicos diseñados para bacPara confirmar las especies de bacterias (ver sección 2.1).
3. Llevar a cabo la PCR para confirmar si hay contaminación del genoma del huésped mediante el uso de beta-Actina de la mosca blanca y cebadores EF1 de acuerdo con el método ²¹ previamente publicado (la receta PCR se describe en la sección 1.4).

6. Endosymbiont Metagenome Sequencing

1. Sujetar el filtrado amplificado a un espectrofotómetro y un fluorómetro (según las instrucciones del fabricante) antes de la secuenciación para probar la calidad de las muestras y si las muestras cumplen los criterios de secuenciación.
2. Sujeción de la amplificado a un secuenciador del genoma de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Resultados

La especie de Asia Menor 1 de Oriente Medio (MEAM1) del complejo de B. tabaci se tomó como ejemplo aquí para descripción. El algodón para la cría de la mosca blanca y varias etapas de desarrollo de la mosca blanca se muestran en la Figura 1, incluyendo una planta de algodón, mosca blanca adulta y las ninfas ^{1ª, 2ª} y ^4ª instar de mosca blanca (la ninfa de ^3ª instar se ve similarmente a la ninfa de...

Discusión

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA polymerase	Takara	R001A	including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit	Qiagen	28704
DNA sample sequencing system	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
Transmission electron microscopy	Hitachi	H-7650 TEM
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μL microloader	Eppendorf	F2771951
Filter holder	Millipore	SX0001300
Filter membrane filter	Millipore	SMWP001300	5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Genome Sequencer	Illumina	Hiseq 2000