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Resumen

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Resumen

Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados ​​en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.

Introducción

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) 1 , para eludir estos inconvenientes.

ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ 9 , 10] . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución 11 , 12 . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) 13 no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ 14] .

Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) 15 , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq 16 , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón.

Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ 17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura 17 , 18 , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma 19 . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador 19 . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ 20] .

Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma 1 . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado 21 , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.

Protocolo

1. Generación de cepas de levadura

  1. Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase.
    1. PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 2.3 kb.
    2. Transformar el casete de marcado amplificado en la cepa de elección utilizando la transformación estándar de acetato de litio 22 y realizar la selección.
    3. Verificar la correcta integración del casete de etiquetado con PCR de colonias.
      1. Preparar la mezcla de reacción especificada ( Tabla 4 ) para el número de colonias que se deben tamizar. Manténgase en el hielo hasta que lo necesite.
      2. Escoja una porción de cada colonia para ser tesEn la parte inferior de un tubo de PCR usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta.
      3. Cocinar las colonias escogidas a alta potencia durante 1 min.
      4. Añadir 50 μl de mezcla de PCR ( Tabla 4 ) a cada colonia de microondas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Realice PCR usando las condiciones de ciclo especificadas ( Tabla 5 ).
      5. Mezclar los 50 μL de reacción de PCR y 10 μL de colorante de carga de ADN 6X directamente en cada tubo de PCR. Ejecutar 10 μL de cada muestra en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 40 min. El tamaño del producto esperado es ~ 700 pb.
        NOTA: Si se desea, verifique la expresión apropiada de la proteína de fusión MNasa mediante Western blot. Se espera un desplazamiento de aproximadamente 20,6 kilodaltons en el peso molecular de la proteína marcada.
  2. Generar una cepa de MNasa libre mediante clonación basada en la homología del promotor del gen de interés en pGZ136 (Tabla 1) y transformación y selección como en el paso 1.1.2.
    1. AlternatiVely, ensamblar el promotor del gen de interés y 3xFLAG-MNasa-SV40 NLS en un vector de plásmido, transformar y seleccionar como en la etapa 1.1.2, y hacer crecer la cepa en la condición selectiva apropiada para el mantenimiento del plásmido.

2. ChEC

  1. En la tarde / noche del día anterior al experimento de ChEC, inocular 3 ml de levadura-peptona-dextrosa (YPD) o medio selectivo apropiado con una única colonia de la cepa que lleva el factor marcado con MNasa. Incubar esta cultura durante la noche (agitación 180 RPM, 30ºC).
  2. En la mañana del día del experimento de ChEC, diluir el cultivo durante la noche en 50 ml de medio a una densidad óptica a 600 nm (DO 600 ) de 0,2 - 0,3. Incubar este cultivo (agitación 180 RPM, 30 ° C) hasta que alcance una DO 600 de 0,5-0,7. A medida que el cultivo se aproxima a la DO 600 adecuada, se pone el bloque de calor o el baño de agua a 30ºC y se comienzan a descongelar aditivos de Tampón A ( TaBle 6).
  3. Preparar 5 mL de Tampón A más aditivos ( Tabla 6 ) por cultivo. Mantenga el tampón A a temperatura ambiente durante el procedimiento.
  4. Prepare tubos de microcentrífuga que contengan 90 μL de solución de parada ( Tabla 7 ) y 10 μL de SDS al 10% para cada punto de tiempo que se va a recoger. Para cada nuevo factor analizado, tomar las muestras a 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min y 10 min.
  5. Se decanta el cultivo en un tubo cónico de 50 ml y se centrifuga a 1.500 xg ya temperatura ambiente (RT) durante 1 min.
  6. Resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A y transferir las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s.
  7. Aspirar sobrenadante y resuspender completamente las células en 1 mL de Tampón A pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Pellet resuspendido células en una microcentrífuga a 1.500 xg y RT durante 30 s. Repita este paso una vez.
  8. Resuspender completamente las células en 570 μL de Tampón A. Añadir 30 μl de digitonina al 2%(0,1% de concentración final) para facilitar la permeabilización de las células, e invertir la mezcla.
  9. Permeabilizar las células en bloque de calor o baño de agua a 30 ° C durante 5 min.
  10. Pipetar la reacción hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células. Elimine una alícuota de 100 μl de células permeabilizadas como control negativo a un tubo de microcentrífuga que contenga solución de parada y SDS (paso 2.4) y agite brevemente para mezclar.
  11. Añadir 1,1 μ l de 1 M CaCl 2 (2 mM de concentración final) a las células permeabilizadas para activar MNase e invertir varias veces rápidamente o vórtice brevemente para mezclar. Devolver inmediatamente la reacción mezclada a 30 ° C e iniciar un temporizador.
  12. En cada punto de tiempo a recoger, pipetear la reacción arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme de las células, luego eliminar una alícuota de 100 μL de células permeabilizadas a un tubo de microcentrífuga que contiene solución de parada y SDS y vórtice brevemente para mezclar. Para cada nuevo factor analizado, tomar 0 s (sin CaCl 2 añadido), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min, y 10 min puntos de tiempo.
    NOTA: Los experimentos de ChEC con factores que escinden rápidamente el ADN a 30 ° C se pueden realizar a temperaturas más bajas para disminuir la cinética de escisión de MNasa.
  13. Una vez que todos los puntos de tiempo se han recogido, añadir 4 μ l de 20 mg / ml de proteinase K a cada muestra, vórtice brevemente para mezclar, e incubar a 55 ° C durante 30 min.
  14. Se a~naden 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamılico 25: 24: 1 a cada muestra, se agita vigorosamente para mezclar y se centrifuga a velocidad máxima y RT en una microcentrıfuga durante 5 min.
  15. Retirar cada fase acuosa (~ 150 μl) a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Vórtice vigorosamente para mezclar y precipitar en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa.
  16. El gránulo precipitó ADN a velocidad máxima y 4ºC en una microcentrífuga durante 10 min.
  17. Los sobrenadantes de decantación y los gránulos de lavado con 1 mL de etanol RT al 70%.
  18. Decantar etanol, quitando el resto invirtiendo unD golpeando suavemente los tubos sobre una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min.
  19. Mientras que los gránulos están secando, hacer una mezcla maestra para resuspender pellets secos en 29 μL de Tris, pH 8,0 + 1 μl de RNasa A 10 mg / mL cada uno. Digerir el ARN a 37 ° C durante 20 min.
  20. Mezcle 1 μL de colorante de carga de ADN 6X con 5 μl de cada muestra y corríjase sobre un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 40 min.

3. Selección del tamaño

NOTA: El objetivo de la selección de tamaños es eliminar fragmentos de ADN genómico de múltiples muestras de la muestra a secuenciar y enriquecer fragmentos de ~ 150 pb (aproximadamente el tamaño del ADN nucleosómico) o más pequeños. En los datos de secuenciación, los fragmentos <400 pb se enriquecen, con un notable pico alrededor del tamaño del ADN nucleosómico (~ 150 pb) y una distribución pico o amplia de fragmentos subnucleosómicos.

    A cada muestra, añadir 75 μL de perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) en una solución de polietilenglicol (PEG) 23 y pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar la mezcla de perlas: ADN a RT durante 5 min.
  1. Durante la incubación de perlas SPRI, se preparan tubos de microcentrífuga que contienen 96 μl de Tris 10 mM, pH 8,0 y 4 μl de NaCl 5 M para cada muestra.
  2. Coloque los tubos en un estante magnético para recoger bolas en el lado del tubo. Deje que las perlas se acumulen en el lado del tubo durante 2 min.
  3. Transferir cada sobrenadante a un tubo nuevo que contenga Tris y NaCl (paso 3.2).
  4. Añadir 200 μl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25: 24: 1 a cada muestra, agitar a vórtice y centrifugar a velocidad máxima y RT en una microcentrífuga durante 5 min.
  5. Retirar cada fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir 30 μg de glucógeno y 500 μl de etanol al 100%. Precipitar el ADN en hielo seco durante 10 minutos o hasta que la solución sea viscosa.
  6. Pellet preciA la velocidad máxima y 4 ° C en una microcentrífuga durante 10 min.
  7. Los sobrenadantes de decantación y los pellets de lavado con 1 mL de etanol al 70%.
  8. Decanta el etanol, quitando el resto invirtiendo y tocando suavemente los tubos en una toalla de papel. Hacer girar brevemente las muestras utilizando una centrífuga de mesa y utilizar una pipeta para eliminar el etanol residual, teniendo cuidado de no alterar el gránulo. Los gránulos secos al aire para a TA durante 5 min.
  9. Resuspender las pastillas secas en 25 μL de Tris, pH 8,0. Determine la concentración de la muestra utilizando un ensayo de alta sensibilidad. Para TF ChEC experimentos, 10-100 ng de ADN es rutinariamente recuperado después de la selección de tamaño.
  10. Preparar bibliotecas de secuenciación. Los protocolos de preparación de bibliotecas que no dependen de la selección de tamaños, como se describió anteriormente 24 , son deseables para permitir la secuenciación de una amplia gama de tamaños de fragmentos (25-500 pb).
  11. Bibliotecas de secuencias en modo de extremo pareado. Un mínimo de 25 bases de secuencia en cada extremo es necesario para la lectura de alta calidadcartografía. Entre 1 y 2 millones de lecturas proporciona suficiente cobertura para una muestra de ChEC.
    NOTA: El análisis de los datos de Seq de ChEC es un procedimiento complejo y está fuera del alcance de este artículo. Puede encontrar información detallada sobre el análisis de datos en las publicaciones anteriores 1 , 21 , y las secuencias de comandos personalizadas utilizadas para el análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) también se puede utilizar para el análisis de línea de comandos de datos ChEC-seq.

Resultados

En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un ...

Discusión

Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable 3 , 4 , y ChIP nativo, tale...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Moustafa Saleh y Jay Tourigny por la lectura crítica del manuscrito y Steven Hahn y Steven Henikoff por su mentoría y apoyo durante el desarrollo de ChEC-seq y su aplicación al complejo Mediator. SG es apoyado por las concesiones de NIH R01GM053451 y R01GM075114 y GEZ es apoyado por fondos de la puesta en marcha de la universidad de Indiana.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
dNTPsNEBN0447
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LOther high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymeraseNEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMake a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

Referencias

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