Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Resumen

En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

Resumen

Las proteínas de la superficie celular median una amplia gama de funciones. En muchos casos, su actividad está regulada por procesos endocíticos que modulan sus niveles en la membrana plasmática. Aquí, presentamos protocolos detallados para 2 métodos que facilitan el estudio de estos procesos, los cuales se basan en el principio de la biotinilación de las proteínas de la superficie celular. El primero está diseñado para permitir la determinación semi-cuantitativa de los niveles relativos de una proteína particular en la superficie celular. En él, los residuos de lisina de las proteínas de membrana plasmática de células se marcan primero con un resto de biotina. Una vez que las células se lisan, estas proteínas pueden ser precipitadas específicamente mediante el uso de estreptavidina inmovilizada con agarosa explotando la afinidad natural de ésta con la biotina. Las proteínas aisladas de tal manera pueden analizarse a continuación mediante un procedimiento de transferencia Western estándar. El segundo método proporciona un medio para determinar la velocidad endocítica de una partículaAr de la superficie celular durante un período de tiempo. Las proteínas de la superficie celular se modifican primero con un derivado de biotina que contiene un enlace disulfuro escindible. Las células se desplazan de nuevo a condiciones normales de cultivo, lo que provoca la captación endocítica de una proporción de proteínas biotiniladas. A continuación, los enlaces disulfuro de los grupos de biotina no internalizados se reducen usando el agente reductor impermeable a la membrana glutatión. A través de este enfoque, las proteínas endocitadas pueden aislarse y cuantificarse con un alto grado de especificidad.

Introducción

Las proteínas en la superficie celular desempeñan una variedad de funciones centrales para mantener la función celular. En numerosos casos, su actividad depende o modulada por procesos endocíticos que los secuestran temporalmente en sitios intracelulares o que los dirigen hacia vías de degradación ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Aquí, destacamos dos enfoques basados ​​en la biotinilación diseñados para permitir al usuario identificar y aislar específicamente proteínas expresadas en la membrana plasmática, y las nuevas internalizadas. A través de estos métodos, se puede cuantificar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de cualquier proteína de interés, permitiendo así una evaluación más clara de su regulación.

Determinación de la expresión relativa de la proteína de la superficie celular por biotinilación

La biotina, o vitamina B7, anteriormente conocida como vitamina H ⁶ , es una pequeña molécula soluble en agua que puede usarse para modificar químicamente grupos reactivos de amina, sulfhidrilo y carboxilo de moléculas biológicas. El cultivo actual de reactivos de biotinilación de la superficie celular consiste principalmente en ésteres de N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados y impermeables a la membrana de biotina o sus derivados, diseñados para reaccionar con las aminas presentes en las cadenas laterales de residuos de lisina de proteínas expresadas en La superficie celular cuando éstas se desprotonan en condiciones básicas, dando como resultado que este último forme un enlace amida con el resto biotina ⁷ . Las proteínas de la superficie celular modificadas de este modo pueden aislarse a continuación mediante el uso de avidina, una proteína tetramérica de 66 - 69 kDa que posee una gran afinidad por la biotina, uniéndose a ésta con una constante de disociación de aproximadamente ^10-15 , marcándola como una de las Las interacciones no covalentes más fuertes conocidas ^{8 , 9} .

En estudios previos se han utilizado varios métodos alternativos para cuantificar la expresión de proteínas en la superficie celular. El etiquetado de células no permeabilizadas usando anticuerpos marcados fluorescentemente específicos para la proteína de interés, seguido por visualización a través de microscopía de fluorescencia, por ejemplo, es un enfoque comúnmente empleado, pero depende en gran medida de la disponibilidad de anticuerpos que pueden unirse a epítopos extracelulares. Más recientemente, también se han empleado con éxito métodos que implican el uso de proteínas quiméricas que portan fluoróforos sensibles al pH que reaccionan a estar expuestos a medios ácidos. Sin embargo, tales ensayos implican usualmente la expresión exógena de estas construcciones en líneas celulares en las que la proteína de interés no se encuentra de forma nativa. Estos enfoques son, no obstante, capaces de proporcionar información valiosa sobre la localización subcelular y el itinerario exocítico de laY por lo tanto deben usarse conjuntamente con los enfoques basados ​​en la biotinilación descritos aquí si las herramientas están disponibles.

En un ensayo de biotinilación típico, las células se lavan primeramente a fondo en PBS a 4ºC. Esto elimina cualquier traza de proteínas de suero introducidas por el medio de cultivo, asegurando así que éstas no consumirán cantidades en exceso de biotina en la siguiente etapa. Más importante aún, la reducción de la temperatura hace que la endocitosis desacelere significativamente. A continuación se añade el reactivo de biotinilación. A continuación, se lavan de nuevo las células y después se incuban con un tampón de enfriamiento que contiene glicina o NH4Cl, cuyo propósito es inactivar todas las trazas restantes de biotina sin reaccionar. A continuación se lisan las células, tras lo cual se agrega estreptavidina inmovilizada con agarosa para precipitar las proteínas biotiniladas. El análisis se realiza comúnmente mediante Western Blot, lo que permite la relativa expresión de la superficie celular de diversos prOteins a ser cuantificados.

Debido a la base de este ensayo, es adecuado para su uso sólo con proteínas que poseen porciones expuestas al medio extracelular. Las proteínas transmembrana multipaso, que poseen probablemente un número de lisinas reactivas dentro de sus regiones de bucle, son las más susceptibles a este método, mientras que las proteínas de una sola pasada tienden a ser menos susceptibles a ser biotiniladas. Incluso en estos casos, existe la posibilidad de que los cambios conformacionales o las interacciones intermoleculares puedan ocluir ciertos sitios reactivos, dando como resultado un rendimiento de biotinilación inferior al esperado.

Determinación de la tasa de internalización de las proteínas de la superficie celular por biotinilación

Los principios de este ensayo son en gran parte similares a los de la biotinilación de la superficie celular, con un número de excepciones, el más importante de los cuales es el uso de reactivos de biotinilación reversibles. Los grupos de biotina (de estos) poseen disuLos enlaces fijos, dentro de sus estructuras, que son susceptibles a agentes reductores; Esto se explota para garantizar que sólo las proteínas de la superficie celular tomadas en sitios intracelulares durante el período de ensayo se dejará biotinilado. Un ensayo generalmente tiene lugar de la siguiente manera. Primero se lavan las células y se biotinilan con reactivos fríos, después se reintroduce el medio de cultivo celular a 37 ° C y las células se devuelven a la incubadora; Esto hace que las proteínas de la superficie celular marcadas se sometan a endocitosis. El agente reductor glutatión - que no puede penetrar en la membrana - se añade entonces para romper los enlaces disulfuro de los restos de biotina unidos a proteínas que permanecen en la superficie celular. Finalmente, los enlaces disulfuro rotos se hacen reaccionar con yodoacetamida, consumiendo los grupos tiol lábil e impidiendo que los enlaces se reformen. Como antes, las células se lisan a continuación, y las proteínas marcadas se precipitan usando estreptavidina-agarosa.

El disco de limitacionesUssed en la sección anterior también se aplican aquí debido a las similitudes compartidas entre los métodos. Además, vale la pena tener en cuenta que los cambios de temperatura implicados en este ensayo impiden la determinación exacta de la cantidad de proteína que se endocitosa para cada incremento de tiempo, particularmente en el caso de proteínas rápidamente internalizadas o que reciclan rápidamente. Por lo tanto, el ensayo sólo proporciona una estimación semicuantitativa de las tasas endocíticas. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total puede usarse para rastrear la absorción de cada vesícula cargada y proporcionar una medición más precisa de la cinética de la endocitosis. Por lo tanto, puede proporcionar un complemento muy útil para este ensayo, suponiendo que una construcción quimérica etiquetada con fluorescencia de la proteína de interés está disponible [ ^11] .

Protocolo

1. Determinación de la expresión relativa de proteína de superficie celular en astrocitos por biotinilación

NOTA: Aquí se ilustra la aplicación de esta técnica de biotinilación al estudio de los efectos de la molécula de matriz extracelular laminina en la localización de la superficie celular del canal permeable al agua aquaporin-4 (AQP4). Los materiales especializados requeridos para este ensayo incluyen sulfo-NHS-LC-biotina y resina de estreptavidina-agarosa (ver Tabla de Materiales ).

1. Utilizando el método descrito en Noel et al. ¹² , preparar cultivos de astrocitos corticales aproximadamente 2 semanas antes del ensayo y cultivarlos en matraces de cultivo ventilados de 75 cm2. Cuando los astrocitos son confluentes del 80 al 90%, separarlos de la superficie del cultivo usando tripsina al 0,05%, y luego pasarlos 1: 3.
2. A las 48 h antes del ensayo, cuando las células están de nuevo 80 - 90% confluentes, los astrocitos de paso 1: 3 (que representan el cEn formato de cultivo) sobre placas de cultivo celular de 60 mm de manera que sean> 70% confluentes el día en que se lleve a cabo el experimento. Asegúrese de que las células estén distribuidas uniformemente entre los platos.
3. A las 16 h antes del ensayo, pipetear laminina en medio de cultivo hasta una concentración final de 24 nM, e incubar a 37 ° C.
4. Inmediatamente antes del ensayo, se prepara lo siguiente y se coloca en hielo o se refrigera: CM-PBS (100 mg / L de MgCl $ _₂ $ 6H $ _₂ $ O y 100 mg / L de CaCl $ _₂ $ en 1X PBS, pH 7,4), tampón de biotina (50 mM de NH $ _₄ $ Cl en CM-PBS), tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM y NaCl 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, 1X inhibidor de proteasa), tampón de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS al 6%, glicerol al 30%, DTT 300 mM y azul al 0,01% de bromofenol) Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X - 100, 1X inhibidor de la proteasa cóctel).
5. Movimiento rápido del ojoOve platos que contienen los cultivos de astrocitos de la incubadora, y descartar el medio.
6. Lavar las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado, y colocar los platos sobre hielo triturado.
7. Pipetee 2 mL de tampón de biotina en cada pocillo y incline suavemente los platos hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para asegurar una cobertura completa. Dejar en el hielo durante 30 min.
8. Eliminar el tampón de biotina utilizando un aspirador, y reemplazar con 4 ml de tampón de enfriamiento rápido. Dejar en el hielo durante 10 min.
9. Aspirar el tampón de temple, y reemplazar con un volumen equivalente del mismo. De nuevo, dejar en el hielo durante 10 min.
10. Deseche el tampón de enfriamiento rápido y lave las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado.
11. Raspe las células en 1 mL de CM-PBS enfriado utilizando un elevador de células, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.
12. Pellet células por centrifugación a 100 xg durante 3 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μl de tampón de lisis.
13. Dejar las muestras en hielo durante 30 min, agitar cada 5 min o plAs en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C.
14. Centrifugar el lisado a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar cualquier material insoluble en detergente. Transferir el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
    1. Ahorre 50 μl de este lisado y agregue tampón de carga. Luego desnaturalizarla calentando a 95 ° C en un baño seco; Ésta es la fracción de "entrada", que contiene tanto proteínas de superficie celular biotiniladas, como proteínas citosólicas no biotiniladas.
15. Alargue la abertura de una punta de pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material de su extremo usando un par de tijeras afiladas. Utilizando esta punta de pipeta, transfiera 75 μL de perlas de estreptavidina-agarosa (normalmente almacenadas a 4 ° C) al lisado, e incube a 4 ° C durante 3 h en agitador / balancín.
    1. Como la estreptavidina-agarosa se vende frecuentemente como una suspensión que contiene 50% de perlas en volumen, suspendida en una solución antimicrobiana, tritura la suspensión para asegurar que las perlasSe suspenden uniformemente y luego pipetean 150 μl de la suspensión en cada muestra.
16. Estimular las bolas de estreptavidina-agarosa por centrifugación a 1500 xg durante 30 s a 4 ° C.
    1. Guardar 50 μl del sobrenadante (añadir el tampón de carga y desnaturalizarlo a 95 ° C en un baño de agua o un bloque de calefacción); Esto representa la fracción "intracelular", y está compuesto principalmente por proteínas citosólicas no biotiniladas.
17. Resuspender las perlas en forma de gránulo en 1 ml de tampón de lavado y rozar durante 3 min a 4 ° C. Perlas de gránulos (como en la etapa 1.16), y desechar el sobrenadante. Repita este proceso 4x para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas.
18. Se aglomeran las perlas por centrifugación (1500 xg durante 30 s a 4 ° C) y se desecha el tampón de lavado superpuesto. Añadir 50 μl de tampón de carga 1X (diluido usando tampón de lisis). Liberar biotina y estreptavidina de perlas desnaturalizando esto a 95 ° C; Esta fracciónUld sólo contienen proteínas de la superficie celular biotinilada (fracción "superficie celular").
    1. Separar la entrada, la superficie celular, y las fracciones intracelulares por SDS-PAGE ¹³ , y analizar por Western Blotting [ ^14] .
       NOTA: Mientras usamos un gel de degradado prefabricado de 4 - 20% en nuestros experimentos, un gel de separación de 12-14% con una capa de apilamiento al 4% (cada uno conteniendo SDS al 0,1%) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También debe utilizarse un patrón de peso molecular del intervalo de tamaños apropiado. Obsérvese que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas.

2. Determinación de la tasa de internalización de proteínas de la superficie celular en astrocitos por biotinilación

NOTA: En lo que sigue, se describe un experimento de biotinilación de pulsación-persecución típico usado en este caso para rastrear la endocitosis de AQP4 en astrocitos. EstaSe basa en el método utilizado por Madrid et al. ¹⁵ . Los materiales especializados requeridos incluyen sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarosa, glutatión reducido y yodoacetamida (véase la Tabla de Materiales ).

1. Preparar cultivos de astrocitos corticales de ratón en placas de 60 mm utilizando los métodos descritos en la sección anterior. Asegúrese de que las células son aproximadamente el 70% confluentes en el día del ensayo, y que cada plato contiene un número equivalente de células.
2. Inmediatamente antes del ensayo, se prepara lo siguiente y se coloca sobre hielo o se refrigera: CM-PBS (100 mg / L de MgCl $ _₂ $ 6H $ _₂ $ O y 100 mg / L de CaCl $ _₂ $ en 1X PBS, pH 7,4), tampón de biotina ), Tampón reductor (glutation reducida 50 mM, NaCl 75 mM y NaOH 75 mM), tampón de enfriamiento rápido (yodoacetamida 50 mM, BSA al 1%, en CM - PBS), Tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM y EDTA 5 mM, triton X-100 al 1%, 1X), tampón de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS al 6%, glicerol al 30%, DTT 300 mM y azul al 0,01% de bromofenol) y tampón de lavado (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X inhibidor de proteasa cóctel).
3. Preparar el medio de cultivo celular fresco (DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), penicilina / estreptomicina al 1% y L-glutamina al 1%) y colocarlo en un baño de agua a 37ºC.
4. Eliminar los cultivos de astrocitos de la incubadora, y aspirar el medio con un aspirador.
5. Lavar las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado, y colocar los platos sobre hielo triturado.
6. Pipetee 3 mL de tampón de biotina en cada plato, incline los platos hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces para asegurar que el tampón esté bien distribuido y deje esto en hielo durante 30 min.
7. Aspirar el tampón de biotina, y reemplazarlo con 5 mL de medio caliente. Incubar un plato de cultivo a 37 ° C durante 15 min, y un segundo plato a la misma temperatura durante 30 min. Deja otro plato a 46; C como la muestra de 0 min.
8. Al final del período de incubación, se desecha el medio y se lavan las células tres veces con 4 ml de CM-PBS enfriado. Pipetear 6 ml de tampón reductor sobre las células, y dejar en hielo durante 15 min.
9. Eliminar el tampón reductor y luego reemplazar con 6 ml de tampón reductor fresco. Colóquelo en hielo durante 15 minutos más.
10. Eliminar la solución reductora y reemplazar con 6 ml de tampón de enfriamiento rápido. Dejar en hielo durante 15 min.
11. Repita el paso de enfriamiento una vez más.
12. Deseche el tampón de enfriamiento rápido y lave las células tres veces con 4 ml de PBS enfriado.
13. Raspe las células en 1 mL de PBS enfriado utilizando un elevador de células, y transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga.
14. Pellet células por centrifugación a 100 xg durante 3 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en 500 μ l de buffer de lisis.
15. Dejar esto en hielo durante 30 min y agitar cada 5 min. Alternativamente, coloque las muestras en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C durante esta duración.
16. Centrifugar laA 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar los materiales insolubles en detergente, y luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Ahorre 50 μl de este lisado, agregue tampón de carga y desnaturación a 95 ° C en un baño seco; Ésta es la fracción de "entrada", que contiene tanto proteínas endocitadas biotiniladas, como proteínas no biotiniladas.
17. Utilizando una punta de pipeta cortada, añada 150 μL de la suspensión de estreptavidina-agarosa al lisado e incube a 4 ° C durante 3 h en agitador / balancín. Vea 1.15 para más detalles sobre este paso.
18. Estimular las bolas de estreptavidina-agarosa por centrifugación a 1.500 xg durante 30 s a 4 ° C.
19. Resuspender las perlas en 1 ml de tampón de lavado y rozar durante 3 min a 4 ° C. Perlas de gránulos (según el paso 2.18), y desechar el sobrenadante. Repita este proceso 4x para minimizar la unión no específica de proteínas citosólicas no biotiniladas.
20. Perlas de pelet mediante centrifugación a 1.500 xg durante 30 s, a 4 ° C, y descarte oveRlying buffer de lavado. Añadir 50 mu l de tampón de carga 1X (diluido usando tampón de lisis). Liberar biotina y estreptavidina de perlas desnaturalizando a 95 ° C; Esta fracción debe contener sólo proteínas de la superficie celular internalizadas (fracción "endocytosed").
21. Separar la entrada, la superficie de la célula, y las fracciones no unidas por SDS-PAGE ¹³ , y analizar por western blotting [ ^14] .
    NOTA: Mientras usamos un gel de degradado prefabricado de 4 - 20% en nuestros experimentos, un gel de separación de 12-14% con una capa de apilamiento al 4% (cada uno conteniendo SDS al 0,1%) debería ser suficiente para las proteínas de interés en este estudio. También debe utilizarse un patrón de peso molecular del intervalo de tamaños apropiado. Obsérvese que a veces puede haber un cambio ascendente observable en las masas moleculares aparentes de las proteínas biotiniladas.

Resultados

El uso de la biotinilación de la superficie celular para evaluar la expresión de la membrana plasmática de AQP4 en astrocitos
Los cultivos de astrocitos tratados con laminina y las células control no tratadas se sometieron a biotinilación de superficie celular utilizando los métodos descritos. Las proteínas biotiniladas se precipitaron con estreptavidina conjugada con agarosa, y luego se separaron por SDS-PAGE. Las fracciones de la superficie celular fueron...

Discusión

Modificaciones:
Como estos métodos fueron diseñados para su uso con células adherentes, hemos especificado el uso de PBS que contiene 100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H ₂ O y

100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para las etapas de lavado y como la base de ciertos tampones para asegurar que las células permanecen unidas a la superficie de cultivo y que las uniones célula-célula no se interrumpen. Sin embargo, los protocolos también se pueden aplicar a tipos de célul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
Bromophenol blue	Bio-Rad	#1610404
cOmplete protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21331
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamide	Bio-Rad	#163-2109
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma-Aldrich	L2020	Thaw on ice.
L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)	Leica Biosystems	B-DG-CE
Penicillin/streptomycin	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G6529
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
Streptavidin agarose resin	Thermo Fisher Scientific	#20347
Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody	Alomone	AQP-004
Tris base (Trizma base)	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500