Dispersión de los nanomateriales en medios acuosos: hacia la optimización del Protocolo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la dispersión de los nanomateriales en medio acuoso con la caracterización en tiempo real para identificar las condiciones óptimas de la sonicación, intensidad y duración para mayor estabilidad y uniformidad de nanopartículas dispersiones sin afectar la integridad de la muestra.

Resumen

El proceso de la sonicación se utiliza comúnmente para la aglomeración y dispersión nanomateriales en medios acuosos y base, necesarios para mejorar la homogeneidad y la estabilidad de la suspensión. En este estudio, se lleva a cabo un enfoque paso a paso sistemático para identificar las condiciones óptimas de sonicación para lograr una dispersión estable. Este enfoque ha sido adoptado y demostrado ser convenientes para los varios nanomateriales (óxido de cerio, nanotubos de carbono y óxido de zinc) dispersadas en agua desionizada (DI). Sin embargo, con cualquier cambio en el tipo de nanomaterial o medio dispersante, necesita ser optimización del protocolo básico de ajustar varios factores tales como tiempo de sonicación, potencia y sonicador tipo, así como aumento de la temperatura durante el proceso. El enfoque registra el proceso de dispersión en detalle. Esto es necesario para identificar los puntos del tiempo, así como otras condiciones indicadas durante el proceso de sonicación, en el que puede haber cambios no deseados, como daños en la superficie de la partícula afectando propiedades de superficie. Nuestro objetivo es ofrecer un enfoque armonizado que puede controlar la calidad de la dispersión final, producida. Tal pauta es instrumental para garantizar la repetibilidad de calidad de dispersión en la comunidad de Nanociencia, particularmente en el campo de la Nanotoxicología.

Introducción

Sonicación es el proceso de generación de cavitación, que consiste en la creación, crecimiento y colapso de burbujas (a menudo llamadas puntos calientes) formadas en el líquido debido a la irradiación de alta intensidad de ultrasonido¹. En un entorno de laboratorio, el método de sonicación se lleva a cabo utilizando un sonicador. Existen sonicators diferentes, todos tiene la función general de la aglomeración de las partículas, que se dispersan en un medio líquido como partículas individuales (o primarias). Mediante la aplicación de sonicación, homogeneidad de la muestra puede mejorar, alcanzar potencialmente una mucho más estrecha distribución dimensional de partícula. Un aspecto importante a considerar en el proceso de dispersión es la estabilidad de la dispersión final. Aquí, la estabilidad de la suspensión se define como donde no colocaron las partículas o sedimentos hacia abajo en estado disperso y el diámetro hidrodinámico medio medidas no varían en más de un 10% entre las cinco medidas repetidas durante eso tiempo (alrededor de 10 min)^2,3. Hay varias maneras de medir la estabilidad de la dispersión. Esto incluye la estimación de potencial zeta (ZP) a través de la medición de la movilidad electroforética de las partículas. Otra es medir la absorción característica de nanopartículas en el espectro UV del⁴.

En el campo de la Nanotoxicología, la capacidad de tener control sobre calidad de la dispersión es muy importante, como el paso de la dispersión determina propiedades fisicoquímicas principales, tales como tamaño de granulometría, forma, agregación/aglomeración, superficie carga, etc. este a su vez en última instancia afectará a la interacción de partículas con los medios de prueba y el resultado de varios experimentos in vitro e in vivo , con el fin de deducir los peligros potenciales de los nanomateriales.

Sonicación se realiza comúnmente mediante un tipo de sonda (directo) o un baño de ultrasonidos, o punta de prueba ultrasónica con un tweeter de vial (sonicación indirecta). Todo tipo de sonicación está disponible en una gama de intensidad y de la salida de potencia, a veces adaptado con un diferente tipo de material o procesos específicos y es adecuado para los volúmenes de líquido que van desde 2 hasta 250 mL. Aunque la sonda de ultrasonidos se sabe para llevar a cabo mejor que la sonicación de baño debido a la alta intensidad localizada⁵, sonicación de baño se prefiere a menudo sobre el tipo de sonda para la preparación de suspensiones de pruebas toxicológicas debido a la posible riesgo de contaminación a través de la punta, erosión de la punta de titanio de punta después de uso prolongado y sonda inmersión profundidad discrepancias. Asimismo, una sonda ultrasónica con un tweeter de vial es ventajosa sobre la sonda directa debido a los riesgos de contaminación antes mencionadas así como la amabilidad de operación del equipo. Se sonicó varios frascos al mismo tiempo y en la misma intensidad. Esto no sólo ahorra tiempo sino que asegura que las muestras reciban el mismo trato, que hace que los resultados entre las muestras más confiables y comparables. En la investigación de la seguridad de los nanomateriales, siempre es evitar la contaminación. Sin embargo, el sonicador de sonda no encaja este requisito y no ha sido probado. Sonda sonicators son conocidos por causar algunos efectos secundarios inevitables como la contaminación de la muestra debido a la erosión de la punta así como reducción la salida de la energía conduce a alteraciones de las condiciones de dispersión, por lo tanto comprometer datos reproducibilidad^{6, 7 , 8}. por otra parte, las muestras se ejecutan generalmente en recipientes descubiertos llevando a la pérdida de líquido por evaporación así como deposición de polvo. Para evitar estas alteraciones no deseadas, estudios recientes recomiendan alternativas sonicators indirectos basados en su suministro de energía eficaz, así como suspensión pureza garantía⁶.

Sonicación optimizado no puede tener un efecto perjudicial en los resultados. Potencialmente, puede alterar las principales propiedades físicas y químicas de los nanomateriales como tamaño, tamaño, morfología y distribución carga superficial^2,9. Literatura ha reportado tales deficiencias para controlar el proceso de la sonicación y el impacto sobre los parámetros de la partícula tales como nano-TiO₂^5,10,11, nano ZnO⁶y nano-cobre¹² . Además, estudios anteriores han demostrado que el proceso de la sonicación no sólo altera las características de la partícula sino también gobierna los resultados de pruebas toxicológicas^12,13.

Para tener control sobre el proceso de dispersión, es importante monitorear y entender cómo los diferentes factores tales como tipo de sonicador, instrumento potencia y duración, volúmenes, etc., puede afectar la calidad de dispersión. Por lo tanto, es necesario contar con un procedimiento sistemático para analizar las características fisicoquímicas de las partículas en la dispersión en diferentes momentos del proceso de sonicación. Aunque estas consideraciones se han tenido en cuenta por algunos investigadores, trabajo en esta área es limitada. Bihari et al han estudiado la estabilidad de la dispersión de dispersiones de diferentes nanomateriales utilizando energías ultrasonido diferentes con distintos estabilizadores de dispersión¹⁴. Una revisión reciente por Hartmannn et al. destacó que aunque se ha trabajado para entender los diferentes factores que afectan a nanomateriales dispersión calidad p. ej., tipo de sonicador utilizado, tiempo de sonicación, etc., hay todavía no procedimiento de sonicación bien definida y universalmente aceptada que actualmente soporta nanotoxicological^7,de investigaciones y pruebas de¹⁵.

Varias técnicas analíticas de caracterización se utilizan para controlar la calidad de dispersión. Estos incluyen el uso de: dispersión dinámica de luz (DLS), disco de centrifugación, dispersión de luz electroforético (ELS), Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-vis) y microscopia electrónica de transmisión (TEM), que miden el tamaño de granulometría, potencial zeta, la estabilidad de la dispersión y características de la morfología, respectivamente. DLS es de uso frecuente para determinar el diámetro hidrodinámico (Z-promedio) de las partículas y el índice de polidispersidad (PdI) de la dispersión de los nanomateriales. En el caso de distribución multimodal tamaño por DLS, Z-promedio obtenido no podrá acordar con la intensidad de la distribución de tamaño de cargada de intensidad. Así, puede citarse la media de la distribución ponderada por la intensidad. PdI refleja la amplitud de la distribución de tamaño con una escala que va de 0 - 1, siendo una muestra de la generación 0 y 1 siendo un muy polidispersas muestra de¹⁶. Disco centrifugación es una técnica de separación utilizada para determinar la distribución de tamaño de partícula mediante Sedimentación centrífuga en un medio líquido. El sedimento de partículas en un ópticamente transparente y girando el disco y la cantidad de luz dispersada por las partículas cuando alcanzan el borde del disco se graba y se convierte en distribución de tamaño de partícula usando la ley de Stokes. Para resolver la distribución de partículas multimodal, técnicas como centrífuga de disco son más convenientes ya que tienen un elemento de separación mecanismo integrado en el instrumento. Potencial zeta (ζ -potencial) de partículas se define como el potencial eléctrico en su corte o plano de deslizamiento, que es un límite teórico dentro de la doble capa eléctrica que separa el líquido (a granel) que muestra el comportamiento viscoso normal de la Capa de Stern, una capa que es predominantemente compuesta de iones de contador y considera a mover con la partícula. El potencial zeta se relaciona directamente con la carga superficial de las partículas y por lo tanto la interacción electrostática (es decir, atracción/repulsión) entre las partículas. Este parámetro, por tanto, se considera un indicador primario de la estabilidad de la dispersión de nanomateriales. Por Convención, el potencial zeta valor por debajo de -25 mV y por encima de 25 mV se considera estable^17,18. La concentración y el tipo de iones, así como el pH de la solución, afectan fuertemente el potencial zeta¹⁹. ELS se utiliza para medir la movilidad electroforética de las partículas en dispersión y esta movilidad se convierte en zeta potencial mediante la ecuación de Henry y los modelos Smoluchowski y Hückel. Espectroscopía UV-vis es una técnica utilizada para cuantificar la luz que es absorbida y dispersada por la muestra a una longitud de onda particular. A menudo se utiliza para monitorear la estabilidad de la dispersión mediante la medición de la absorción característica de los nanomateriales en la región UV. Por último, TEM a menudo se utiliza para visualizar y analizar el tamaño, distribución de tamaño, aglomeración y forma de las nanopartículas^5,14,15,20.

Presentamos un estudio comparativo de seis dispersiones de diferentes nanomateriales constituidas baño de ultrasonidos y una sonda ultrasónica con un tweeter de vial. La concentración de partículas, temperatura, tipo sonicador y configuración utilizada en el estudio se especifica en el protocolo, por lo que se infiere la configuración experimental para sondas similares y baños por ultrasonidos. Se utilizan los siguientes nanomateriales: plata (Ag), óxido del cerio (CeO₂), óxido de zinc (ZnO, NM110 hidrofílico e hidrofóbico NM111) y nanomateriales basados en carbono como los nanotubos de carbono (A32 y A106, véase Tabla de materiales).

Evaluación de la calidad de la dispersión en diferentes momentos a lo largo del proceso de sonicación se realiza mediante diversas técnicas de caracterización, es decir DLS para tamaño/distribución granulométrica, disco de centrifugación para la distribución de tamaño, ELS de potencial zeta Espectroscopía UV-vis para la estabilidad y temperatura para la forma de la partícula y homogeneidad. Se evalúa una serie de diferentes nanomateriales desde óxidos metálicos a base de carbono. Para la comparación, suspensión acuosa comercial de nanopartículas de plata (Ag NPs) estabilizado con citrato tapado se utiliza en paralelo, para deducir la estabilidad a largo plazo esperada de suspensión disponible en el mercado relevante. Obviamente, este modelo Ag NPs no está directamente relacionado con cualquiera de los procedimientos de dispersión pero actúa únicamente para indicar la necesidad de volver a someter a ultrasonidos o volver a estabilizar las suspensiones después de algún tiempo de almacenamiento de información como cambios tales como la aglomeración van a ocurrir durante almacenamiento de información. La suspensión se mantiene en la nevera durante dos meses. Durante este período, la dispersión se caracteriza por identificar potencial aglomeración de las partículas. Los resultados iniciales muestran una suspensión inestable (como se explica en la sección de resultados ). Posteriormente, esta dispersión mayor se somete a tratamientos diferentes sonicación, similares a los otros nanomateriales utilizados en el estudio. El propósito del estudio es confirmar que la podemos la aglomeración de la suspensión mediante el mismo protocolo de sonicación. El modelo Ag NPs así puede ser asociado como el punto de referencia para estudios a largo plazo que representa la dispersión de partículas en forma optimizada.

Los protocolos de dispersión presentados aquí comparten similitudes con los publicados en la literatura anterior e incorpora algunas de las recomendaciones de algunos realizadas por últimos trabajadores^{7,21,22,23 ,24,25}. En este estudio, se utiliza un enfoque sistemático y paso a paso para controlar la calidad de la dispersión en el protocolo de dispersión. Este enfoque compromete en tiempo real caracterización de las dispersiones de nanomateriales, con el fin de identificar condiciones de óptima dispersión experimental (figura 1).

Figura 1. Diagrama de flujo que representa el esquema y secuencia paso a paso el protocolo de dispersión de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Nota: Todos los productos químicos se utilizan como recibido sin posterior purificación. Utilice agua ultrapura durante todo el estudio con una resistividad de 18 MΩ·cm. Todas las dispersiones preparadas generalmente se almacenan a 5 ° C en la oscuridad para cualquier caracterización adicional o estudios de estabilidad futura, pero esto puede variar dependiendo de la composición del material y otras propiedades asociadas como disolución. Por ejemplo, Ag NPs son generalmente estables durante algún tiempo si se conservan entre 2-5 ° C lejos de la luz del sol; sin embargo, cambios dinámicos van a ocurrir dentro de las suspensiones y dispersiones se re-aglomerados sin embargo se saben que el sedimento hacia abajo con el tiempo. Analizar estos materiales utilizando DLS, UV-vis y TEM para verificación de calidad antes de^4,5,13,14de análisis biológico. Una concentración de 0,02 mg/mL se utiliza para el análisis a continuación. La concentración de la muestra es adecuada para el análisis usando DLS, UV-vis, disco centrífuga, cálculos de potencial zeta y el análisis TEM.

1. calibración de la energía entregada por Sonicators

Nota: La potencia acústica efectiva entregada la suspensión sonicación es un parámetro importante para obtener dispersiones reproducibles. Esto es diferente a la entrada eléctrica o potencia de salida del generador indicado por el fabricante ya que este es el real poder que entrega la suspensión durante la sonicación²⁶. Entre los muchos métodos para el cálculo de la potencia entregada, el método más comúnmente utilizado es calorimetría²⁶. Esto es conocido por ser una manera simple y eficiente para la medición directa de potencia eficaz entregada a una suspensión de⁷. En este método, el aumento de la temperatura en el líquido en un sonicador determinada configuración se registra en el tiempo y la potencia eficaz entregada se calcula mediante la siguiente ecuación:

donde P es la potencia acústica entregada (W), T es la temperatura (K), t corresponde al tiempo (s), C_P es el calor específico del líquido (4.18 J/g· K para el agua), y M es la masa del líquido (g).

1. Calibración de la energía entregada por sonda ultrasónica con un tweeter de vial
   Nota: El método es una adaptación de Taurozzi et al. ⁷ y los siguientes pasos son recomendados.
   1. Coloque un frasco de plástico vacíelo en la microbalanza y Tarar la balanza.
   2. Llenar el frasco con 1,5 mL de agua desionizada (resistividad 18 MΩ·cm) y registrar la masa del líquido con la balanza.
   3. Colocar el frasco en uno de los agujeros de seis frasco en la parte de alta intensidad del tweeter vial y sumerja una sonda de temperatura conectada a un medidor de temperatura digital con la abrazadera. Asegúrese de que la sonda no toque las paredes del frasco y es de aproximadamente 2 cm por debajo de la superficie del líquido.
   4. El ajuste de tweeter de frasco a 24 kHz y 10 W (ajuste de amplitud al 50%) y operar en el modo continuo.
      Nota: Otros ajustes de amplitud probados aquí son 70%, 90% y 100%.
   5. Registrar el aumento de la temperatura del agua durante los 5 minutos iniciales con un intervalo de 30 s y asegurar que el vial o la puesta en marcha no cambio de posición.
   6. Crear una gráfico de tiempo temperatura en un software de hoja de cálculo y obtener el mejor ajuste lineal para la curva de regresión de mínimos cuadrados.
   7. Obtener la pendiente de la gráfica (que es el aumento de la temperatura con el tiempo) y calcular la potencia entregada utilizando la ecuación 1. Repite el experimento tres veces y obtener el valor medio.
   8. Repita el procedimiento de pasos 1.1.1 - 1.1.4 para los ajustes de amplitud de 70%, 90% y 100%. El valor de potencia obtenido mediante este procedimiento se reporta durante el procedimiento de dispersión.
2. Calibración de la energía entregada por un baño de ultrasonidos
   1. Coloque un frasco de plástico vacíelo en la microbalanza y Tarar la balanza.
   2. Llenar el frasco con 1,5 mL de agua desionizada (resistividad 18 MΩ·cm) y registrar la masa del líquido con la balanza.
   3. Coloque el frasco en el baño ultrasónico que la mitad sumergida en agua y asegúrelos con una abrazadera. Sumerja una sonda de temperatura conectada a un medidor de temperatura digital con la abrazadera. Asegúrese de que la sonda no toque las paredes del frasco y es de aproximadamente 2 cm por debajo de la superficie del líquido.
   4. Configurar el baño de ultrasonidos a 40 KHz y 80 W y operar en el modo continuo.
   5. Registrar el aumento de la temperatura del agua durante los 5 minutos iniciales con un intervalo de 30 s y asegurar que el vial o la puesta en marcha no cambio de posición.
   6. Crear una gráfico de tiempo temperatura en excel y obtener el mejor ajuste lineal para la curva de regresión de mínimos cuadrados.
   7. Obtener la pendiente de la gráfica en un software de hoja de cálculo (que es el aumento de la temperatura con el tiempo) y calcular la potencia entregada utilizando la ecuación 1. Repite el experimento tres veces y obtener el valor medio. El valor de potencia obtenido mediante este procedimiento se divulga durante el procedimiento de dispersión.

2. procedimiento dispersión en medio acuoso utilizando una sonda ultrasónica equipada con un Tweeter de Vial

1. Pesar 2 mg de cada uno de los nanopolvos requerida usando una espátula limpia en tres frascos de vidrio limpios. Etiquetarlos como viales de 1, 2 y 3.
2. Pipetear 1 ml de agua desionizada y añada a lo largo de las paredes de cada frasco. Hacer una pasta espesa con la ayuda de una varilla de vidrio limpia delgada, luego agregar el resto del agua para hacer una concentración final de 0,2 mg/mL. En el caso de una muestra de hidrofóbica, realizar la humectación previa usando 1 mL de 0,5% vol/vol etanol y añadir agua desionizada para la concentración final requerida.
3. Sellar cada cubeta con su tapa y agitar bien en el movimiento circular horizontal a nanopolvos de removeany pegarse a las paredes del frasco.
4. Coloque los tres frascos en la punta de prueba ultrasónica con un tweeter de frasco y aplicar el primer tratamiento de sonicación de 2 min en 1.1 W en modo pulsado (1 s de s/1, que significa 1 en y 1 s apagado). Esto le dará un aumento de la temperatura de unos 4 ° C en la dispersión.
5. Salida vial 1 y pipeta una cantidad conveniente de parte alícuota de la parte superior del frasco, diluir con agua desionizada a una concentración de 0,02 mg/mL. Caracterizan la dispersión diluida por tamaño, granulometría, forma, aglomeración y potencial zeta utilizando una variedad de técnicas de conexión como DLS, TEM, UV-vis y ELS (discutidos en la sección 4). Registrar y documentar las mediciones con precisión.
6. Pausa de 10 minutos de paso 2.4 para permitir una refrigeración de la muestra y para evitar cualquier aumento de la temperatura precipitado en el sistema. Aplique un segundo tratamiento de sonicación en viales de 2 y 3 de 4 minutos con los mismos ajustes de amplitud y modo pulsado. Sacar el frasco 2, repita el paso 2.5 y las lecturas del documento después de 6 min de sonicación.
7. Pausa de 10 minutos, aplicar un tercer tratamiento de sonicación para frasco 3 para otros 4 minutos y luego seguir paso 2.5. Registrar y documentar las mediciones a 10 min de sonicación (discutido en la sección 4).
   Nota: Gafas, guantes y batas de laboratorio deben ser usados al manejar suspensiones de nanopartículas. El sonicador debe ubicarse en recinto acústico durante experimentos más, y orejeras de protección deben ser usados cuando se trabaja cerca a la fuente de ultrasonido.

3. procedimiento dispersión en medio acuoso utilizando un baño de ultrasonidos

1. Pesar 2 mg de cada uno de los nanopolvos requerida usando una espátula limpia en cuatro frascos de vidrio limpios y etiquetarlos como viales 4, 5, 6 y 7.
2. Pipetear a unas gotas de agua DI y añadir a lo largo de las paredes de cada frasco y hacer una pasta espesa con la ayuda de la varilla de vidrio limpia delgada. Luego agregar el resto del agua para hacer una concentración final de 0,2 mg/mL en cada frasco.
   Nota: En caso de una muestra de hidrofóbica, la humectación previa se realiza usando 1 mL de 0,5% vol/vol etanol y luego se añade agua desionizada para la concentración final requerida.
3. Sellar cada cubeta con su tapa y agitar bien en el movimiento circular horizontal para eliminar cualquier nanopolvos pegarse a las paredes del frasco.
4. Coloque los cuatro frascos en baño de ultrasonidos con los frascos que la mitad sumergida en agua y aplicar el primer tratamiento de sonicación en 80 W durante 15 min a temperatura ambiente. Esto le daría un aumento de la temperatura de aproximadamente 3 ° C en la dispersión.
5. Frasco 4 Retire el baño ultrasónico pipetear una cantidad conveniente de parte alícuota de la parte superior del frasco, diluir con agua desionizada a una concentración de 0,02 mg/mL y caracterizar la muestra por tamaño, granulometría, forma, aglomeración y zeta potencial usando una variedad de técnicas de conexión como DLS, TEM, UV-vis y ELS (discutidos en la sección 4). Registrar y documentar las mediciones.
6. Cambiar el agua en el baño ultrasónico y aplique un segundo tratamiento de sonicación para frascos de 5, 6 y 7 para otros 15 minutos con los mismos ajustes (80 W). Quitar vial 5, siga el paso 3.5 para la caracterización y documentar las lecturas a los 30 min de sonicación.
7. Cambiar el agua en el baño de ultrasonidos (para evitar cualquier nueva subida de la temperatura) y aplicar un tercer tratamiento de sonicación de otros 30 minutos para frascos de 6 y 7 con los mismos ajustes con una pequeña pausa de cambio de agua nuevamente en 15 minutos quitar frasco 6 y siga el paso 3.5. Registrar y documentar las medidas a 1 h de sonicación.
8. Cambiar el agua en el baño cada 15 minutos y solicitar un cuarto tratamiento de sonicación para frasco 7 otra hora manteniendo la constante de configuración. Sacar vial 7, siga el paso 3.5 para la caracterización completa y registrar las mediciones en 2 h de sonicación.

4. Caracterización de las muestras dispersas en diferentes puntos del tiempo

1. Caracterización de tamaño usando DLS ²⁷
   1. Abra el software DLS. Crear un archivo de medición de tamaño que puede ser individualizado para un nanomaterial específico (incluyendo uno para un estándar) utilizando el valor de índice de refracción del manual de Malvern. Además, otros datos según lo requerido por el software, como los valores de absorción y de viscosidad, de entrada y también el tipo de dispersante.
   2. Entrar en las condiciones del experimento para la muestra, tales como tiempo de equilibrado de 2 min, temperatura de 20 ° C, cubeta tipo como cubeta desechable de bajo volumen y experimentar el funcionamiento en modo automático. Archivo de prensa | Guardar (guardar con el nombre deseado).
   3. Presione "archivo | Abrir nueva medición"y ejecutar una prueba de verificación de DLS mediante gotas de látex estándar con un diámetro nominal de 100 nm para calificar el funcionamiento del instrumento
      1. Use una cubeta desechable de bajo volumen. Inyectar 1 mL de muestra con jeringa o pipetas para evitar burbujas de aire.
         Nota: Limpiar las cubetas con etanol y agua desionizada antes de su uso.
      2. Insertar la cubeta en la máquina. Haga clic en el botón "Inicio" en el panel de medición de archivos. Tenga en cuenta que esto se equilibre la muestra por 2 min y tomar mediciones a 20 ° C.
         Nota: Si las muestras se han almacenado previamente en la nevera, que puedan llegar a temperatura ambiente antes de usar.
      3. Recoger al menos cinco mediciones en modo automático y tomar la media de las mediciones para informar el tamaño seleccionando todas las mediciones y clic en "promedio" del panel superior. Exportar los datos a excel para su posterior análisis.
      4. Informe del diámetro hidrodinámico como el promedio de Z, con la anchura de la PdI que representa la desviación estándar de la media de Z en el caso de una distribución monomodal del²⁸. En el caso de una discrepancia significativa entre la media de Z y la media de la distribución de tamaño de intensidad ponderada, que es indicativa de polidispersidad o aglomeración, la media del resultado de distribución del intensidad ponderada tamaño cotiza con un Comentario en el estado de la muestra.
      5. Repita el paso 4.1.3 para nuevas medidas.
         Nota: DLS no es una técnica adecuada para el análisis de las muestras no son ideales. Con esto nos referimos a las muestras que son partículas no-esféricas de alta polidispersidad, extensa aglomeración, sedimentación, etc. que medidas repetidas pueden resultar en lecturas imprecisas debido a partículas de sedimentación/colocar. En tales casos, se recomiendan otras técnicas de conexión tales como centrifugación de disco, que puede utilizarse para evaluar la dispersión de una manera cualitativa.
2. Distribución de tamaño de disco de centrifugación
   1. Abra el software CPS. Seleccione "definición de procedimiento", en el nombre de SOP de muestra en la parte superior y rellenar los parámetros de la muestra como diámetro mínimo y máximo, densidad de partículas, índice de refracción, absorción y factor de esfericidad no²⁹.
      1. Por ejemplo, nanopartículas de ZnO, ingrese 0.1 micrones y 1,0 micras en las fichas de diámetro mínimo y máximo, respectivamente, escriba 5,61 g/mL en la densidad de la partícula, 2.1 en la sección de índice de refracción, 0.001 en la absorción de partículas y 1 en la no esfericidad sección.
   2. Llene la calibración estándar detalles basados en el estándar de PVC de máxima diámetro 0.377 μm con una densidad de partícula de 1,385 g/mL. También rellena los parámetros flúidos (sacarosa, densidad del fluido de 1,04 g/mL e índice de refracción líquido de 1.35) y nombre y guarde el procedimiento.
   3. Eligió el procedimiento seleccionado (SOP guardada en el paso 4.2.1) e inyecte el primer nivel de gradiente, 1.6 mL de sacarosa (24%) en el agujero del disco y oprima 'start'.
      Nota: El papel de la sacarosa aquí es establecer un gradiente de densidad en el disco mientras gira a una velocidad constante. Esto calcula automáticamente la velocidad del disco dependiendo del rango de tamaño.
   4. Espere hasta que el software alcance automáticamente calculado RPM (revoluciones por minuto). Estabilizar la sedimentación mediante la inyección de un gradiente de sacarosa (8% de baja densidad y alta densidad de 24%, ver tabla 1), 1,6 mL volumen total cada hora a partir de mayor densidad y terminando con la solución de densidad más baja.
      Nota: Aquí marcamos la solución de sacarosa 8% como baja y 24% solución de sucrosa como alta. Son mezcladas en volúmenes (volumen total 1.6 mL cada vez) e inyectados en el disco uno por uno hasta que se forma un gradiente.
      1. A continuación, inyecte 1,0 mL de líquido de la tapa de dodecano que ayuda a mantener el gradiente dentro del disco durante un mínimo de 6 h. permitir la centrifugadora del disco se equilibren para 1 h.
   5. Seleccione "Analyzer operar" introducir el ID de muestra y presione start. Inyectar 0,2 mL de estándar con una jeringa de 1 mL en el disco y pulse la barra espaciadora al mismo tiempo. Luego inyectar 0,2 mL de la muestra y presionar la barra espaciadora al mismo tiempo. Espere a que la medición terminar y luego haga clic en la siguiente muestra.
   6. Utilice el software de sistema de control de disco centrífuga para adquirir y procesar los datos. Para ello, haga clic en "recuperar la distribución" y haga clic en el nombre de la muestra; Esto abre la gráfica de la distribución de tamaño de la muestra. Exportar los datos a un gestor de hoja de cálculo.
3. Estudio de estabilidad de la dispersión usando espectroscopía UV-vis
   Nota: Espectroscopía UV-vis se utiliza a menudo para entender la estabilidad de la suspensión y la agregación observando cuidadosamente los cambios en la intensidad máxima, asimetría espectral, forma espectral así como cambio de la longitud de onda en el espectro de absorción⁴. Los pasos detallados son los siguientes.
   1. Abra el software de espectrofotómetro UV-vis y haga clic en "Análisis de espectro"³⁰.
   2. Use una cubeta de cuarzo estándar (celda de cuarzo de microrectangular de semi 100 mm, 190-2.700 nanómetro). Inyectar 2-3 mL de muestra con una pipeta.
      1. Antes del uso, lave las cubetas con el ácido nítrico 50% durante 10 minutos y luego lavar tres veces con agua purificada. Luego enjuague con acetona, quitar exceso y secar al aire.
   3. Preselección del rango de ajuste de instrumento a 700 nm de longitud de onda de 200 nm desde la ficha de longitud de onda haciendo clic en "Instrumento" en la parte superior del panel software y haga clic en 'seleccionar longitud de onda'.
   4. Haga clic en "base". Fondo restar cada espectro usando un correspondiente 'espacio en blanco' , es decir, una cubeta llena con sólo medio, que en este caso es agua de dispersión.
      Nota: En caso de muestras hidrofóbicas, una proporción similar de etanol: agua se utiliza como el medio de dispersión.
   5. Reunir al menos tres espectros individuales sobre cada muestra haciendo clic en "instrumento | La propiedad"y '3' en el número de espectros. Tomar valores promedio para el análisis. Guardar los datos y exportar los datos para su posterior análisis.
4. Medidas de potencial zeta utilizando ELS
   1. Abra el software DLS. Crear un zeta potencial medida archivo que puede ser individualizado para un nanomaterial específico utilizando el valor de índice de refracción del manual de Malvern. Otra información que puede ser enchufado en el software p. ej., absorción, viscosidad y tipo de dispersante que se encuentra en la ficha de configuración de muestra haga clic en la entrada "archivo | Guardar"y guardar con el nombre deseado.
   2. Haga clic en "archivo | Abrir nueva medición"y verificar el funcionamiento del instrumento utilizando una referencia estándar DTS 1235 (estándar potencial zeta). Este es un poliestireno látex estándar en buffer acuoso a pH 9 y cuenta con un potencial zeta de-42 ± 4.2 Mt.
   3. Preparar la muestra en una jeringa de 1 mL. Uso una celda capilar doblada desechable provisto de un electrodo a cada lado para las medidas de potencial zeta. Inyecte cuidadosamente la muestra dentro de la célula capilar a través de uno de los puertos de la comprobación de la célula capilar que no hay burbujas.
      1. Una vez que la muestra comienza a emerger desde el otro extremo, inserte los tapones y eliminar cualquier líquido que puede haber derramado sobre los electrodos. Limpiar las cubetas con agua DI y etanol.
   4. Insertar la celda capilar doblada en la máquina. Equilibre durante 2 min y adquirir las mediciones a 200 ° C, salvo que se especifique. Si muestras de dispersión se han guardado previamente en el refrigerador, permita que las muestras de dispersión llegar a temperatura ambiente antes de usar.
   5. Recoger al menos cinco mediciones en modo automático y declarar el valor de potencial zeta promedio. Exportar los datos, analizar^17,18 (típicamente, zeta potencial valor por debajo de -25 mV y por encima de 25 mV se considera estable) e interpretar en línea o sin conexión.
5. Caracterización morfológica mediante TEM
   1. Utilizar las películas de carbón perforadas rejillas (300 mesh) para la preparación de la muestra. Poner una gota de la muestra de la dispersión (aproximadamente 0,1 mL, 0.02 mg/mL) en una rejilla limpia.
   2. Seque la muestra al aire en condiciones ambientales manteniendo las rejillas cubiertas para evitar la contaminación del aire.
   3. Lave las rejillas con agua ultra puro para eliminar cualquier efecto de secado y conforme a la proyección de imagen de TEM.
      Nota: La adición de la gota de dispersión en la red aumenta la concentración de partículas en la superficie de la rejilla lo que conduce a fuerzas de atracción entre partículas. No puede conducir a los artefactos. Un pequeño enjuague con agua ultra pura elimina este riesgo y es útil para un secado uniforme de las rejillas³¹.
   4. Adquirir las imágenes en un formato de dm3 y posteriormente examinarlos sin conexión utilizando el software de TEM.
      Nota: Las imágenes pueden utilizarse para deducir información complementaria alrededor de tamaño de partícula, estructura y forma. Los archivos se convierten en tiff, en que la cuantificación de propiedades tales como tamaño y forma puede llevarse a cabo.

Resultados

Los datos calorimétricas mostrando el aumento de la temperatura con el tiempo en ambos tipos de sonicación se muestran en la figura 2. La potencia acústica efectiva entregada a la dispersión en una sonda ultrasónica equipada con un tweeter de vial (fuente de alimentación 200 W) se calcula que será de 0.55 ± 0.05 W con amplitud del 50%, 0,75 ± 0,04 W en amplitud de 70%, 1,09 ± 0.05 W con 90% amplitud y 1.15 ± 0.05 W en amplit 50% Ude, mientras que para el baño de ultrasonidos (fuente de alimentación 80 W), se calcula que 0.093 ± 0,04 W en posición 100%. El hallazgo es similar al trabajo anteriormente publicado, que demuestra que la potencia de salida de las sonicators es mucho menor que el entregado a las suspensiones bajo tratamiento^32,33,34.

Figura 2. Datos calorimétricas que muestran aumento de la temperatura con el tiempo durante la sonicación usando (A) una sonda ultrasónica equipado con un tweeter de vial y (B) un baño de ultrasonidos. La potencia acústica efectiva entregada a la dispersión en una sonda ultrasónica equipada con un tweeter de vial (fuente de alimentación 200 W) se calcula que será de 0.55 ± 0.05 W con amplitud del 50%, 0,75 ± 0,04 W en amplitud de 70%, 1,09 ± 0.05 W con 90% amplitud y 1.15 ± 0.05 W en amplit 50% Ude, mientras que para el baño de ultrasonidos (fuente de alimentación 80 W), se calcula que 0.093 ± 0,04 W en posición 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados asociados a las diversas dispersiones de nanomateriales producidas por diferentes protocolos se resumen en la tabla 2. Los resultados muestran la variabilidad en la calidad de la dispersión (medida por DLS, ELS y TEM) asociada con dispersiones de diferentes nanomateriales producidos utilizando sonicación diferentes condiciones. Como era de esperar, variabilidad de los datos depende de varios factores como tipo de nanomaterial, sonicación período de tiempo, y una sonda o un baño de ultrasonidos se ha utilizado en el protocolo. En figura 5 y figura 6se muestran los resultados DLS y el espectro UV-vis obtenido para cada nanomaterial se muestra en la figura 3 y figura 4 .

El propósito del cuadro 2 es no sólo mostrar el grado de variabilidad de datos sino también para permitir la identificación de un protocolo de dispersión optimizado para una dispersión de nanomateriales dado. Si tales dispersiones habían sido utilizados como parte de un método de prueba de nanotoxicological, entonces lo ideal es tener una dispersión estable (preferiblemente una magnitud de al menos ± 30 mV), una pequeña PdI indicando más estrecha distribución de tamaño de partícula (preferiblemente con PdI de 0.2 o menos) y un pequeña media DLS tamaño de partícula, para indicar la desintegración de grandes aglomeraciones. Aquí, medio de Z se define como la intensidad basado en el tamaño promedio de las nanopartículas y PdI es una medida de la anchura de la general tamaño distribución (descrito en la Introducción).

NM	Código de ejemplo	Tiempo de sonicación	Tamaño por DLS (nm)	Índice de polidispersidad (PdI)	Potencial zeta (mV)
Óxido de cerio	CeO2_powder	0	396±130	0.763±0.100	17.2±0.4
	CeO2_B_15min	15 min	128±4	0.231±0.015	39.2±1.0
	CeO2_B_30min	30 min	117±5	0.210±0.008	38.1±0.5
	CeO2_B_1h	1 h	95±3	0.209±0.012	46.5±0.5
	CeO2_B_2h	2 h	92±2	0.203±0.007	46.5±1.4
	CeO2_P_2min	2 min	126±7	0.218±0.005	28.8±0.7
	CeO2_P_6min	6 min	131±2	0.209±0.014	40.5±0.7
	CeO2_P_10min	10 min	122±1	0.184±0.014	44.4±1.3
Óxido de zinc (hidrofílico)	ZnO_NM110 polvo	0	1410±120	0.786±0.150	17.1±0.5
	ZnO_NM110_B	15 min	239±2	0.130±0.024	25.4±1.0
	_15min
	ZnO_NM110_B	30 min	251±2	0.166±0.020	21.6±0.3
	_30min
	ZnO_NM110_B	1 h	310±8	0.162±0.025	21.0±0.2
	_1hr
	ZnO_NM110_B	2 h	274±3	0.243±0.014	25.2±0.7
	_2hr
	ZnO_NM110_P	2 min	377±20	0.267±0.025	21.7±0.4
	_2min
	ZnO_NM110_P	6 min	885±70	0.276±0.023	8.6±0.6
	_6min
	ZnO_NM110_P	10 min	1074±88	0.673±0.058	11.2±1.4
	_10min
Óxido de zinc (hidrofóbico)	ZnO_NM111_	0	758±86	0.823±0.006	-14.6±0.7
	polvo
	ZnO_NM111_	15 min	384±95	0.399±0.074	-17.5±1.0
	B_15min
	ZnO_NM111_	30 min	282±35	0.361±0.009	-22.4±0.5
	B_30min
	ZnO_NM111_	1 h	296±18	0.379±0.031	-22.8±0.5
	B_1hr
	ZnO_NM111_	2 h	280±54	0.366±0.031	-23.7±1.0
	B_2hr
	ZnO_NM111_	2 min	227±9	0.402±0.032	19.8±0.8
	P_2min
	ZnO_NM111_	6 min	340±58	0.477±0.026	-21.1±0.2
	P_6min
	ZnO_NM111_	10 min	370±72	0.626±0.065	-21.8±0.8
	P_10min
CNT	A32_powder	2 min	306±5	0.279±0.029	-23.7±0.5
	A32_B_15min	15 min	250±3	0.200±0.007	-18.0±0.4
	A32_B_30min	30 min	255±2	0.282±0.036	-20.2±1.1
	A32_B_1hr	1 h	230±3	0.226±0.021	-21.7±0.5
	A32_B_2hr	2 h	267±3	0.337±0.019	-20.6±0.6
	A32_P_2min	2 min	255±4	0.217±0.011	-22.5±0.4
	A32_P_6min	6 min	245±9	0.328±0.029	-23.6±0.8
	A32_P_10min	10 min	254±4	0.313±0.029	-23.6±0.5
CNT	A106_powder	2 min	580±18	0.305±0.070	-35.9±1.0
	A106_B_15min	15 min	573±18	0.404±0.016	-29.5±1.0
	A106_B_30min	30 min	479±11	0.363±0.013	-28.8±1.4
	A106_B_1hr	1 h	566±22	0.461±0.054	-25.0±0.7
	A106_B_2hr	2 h	477±10	0.311±0.027	-26.8±0.5
	A106_P_2min	2 min	300±58	0.473±0.053	-29.8±1.0
	A106_P_6min	6 min	390±10	0.359±0.022	-40.7±0.5
	A106_P_10min	10 min	300±85	0.511±0.134	-24.5±0.7
Plata	Ag_cit	0	72±50	0.462±0.258	-38.7±1.3
	Ag_B_15min	15 min	25±1	0.489±0.008	-39.8±2.2
	Ag_B_30min	30 min	25±1	0.532±0.036	-30.7±2.8
	Ag_B_1hr	1 h	25±1	0.542±0.028	-39.2±1.7
	Ag_B_2hr	2 h	28±5	0.387±0.015	-35.8±1.8
	Ag_P_2min	2 min	29±1	0.300±0.025	-42.0±2.9
	Ag_P_6min	6 min	26±2	0.263±0.017	-40.4±1.5
	Ag_P_10min	10 min	25±2	0.251±0.011	-47.3±1.4

Tabla 2. Resumen de los resultados de dispersión de NM en el agua. 'P' en los códigos de muestra indica dispersión lleva a cabo mediante una sonda ultrasónica con un tweeter de frasco y 'B' en el código de ejemplo indica dispersión lleva a cabo utilizando un baño de ultrasonidos. Todas las mediciones se tomaron a 0,02 mg/mL. Sonicación en tiempo 0 significa un sonicada suspensión , es decir, sólo firma de agitación y mezcla sin ninguna otra ayuda. Nanotubos que son completamente insolubles y no dispersable en agua desionizada en agitación física fueron sonicados para una inicial 2 min en el sonicador de baño y también.

Figura 3. Espectros UV-vis de (A) Gerente General₂(B) ZnO NM110 y (C) ZnO NM111 dispersión en agua. Espectroscopia UV-vis se utiliza para entender la estabilidad de la suspensión y la agregación observando cuidadosamente los cambios en la intensidad de pico, asimetría espectral, espectral de la forma como el cambio de longitud de onda de los espectros de absorción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Espectros UV-vis de dispersión (A) CNTs A106, A32 CNTs (B) y (C) Ag_citrate en el agua. Espectroscopía UV-vis se utiliza para entender la estabilidad de la suspensión y la agregación observando cuidadosamente los cambios en la intensidad de pico, asimetría espectral, espectral de la forma como el cambio de longitud de onda de los espectros de absorción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Tamaño de distribución de intensidad obtenida con DLS para (A) Gerente General₂(B) ZnO NM110 y (C) ZnO NM111 dispersión en agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Tamaño de distribución de intensidad obtenida con DLS (A) CNTs A106, A32 CNTs (B) y (C) Ag_citrate la dispersión en agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de suspensión de nanomateriales de₂ Director General, el uso de sonicación resultó en una disminución general del tamaño de las partículas y los valores de la PDI. Sin cualquier sonicación, los resultados muestran una distribución multimodal de intensidad con un promedio de Z (± 396 130 nm) y un alto valor de PdI del 0.763 ± 0.100 (tabla 2). Además, la dispersión muestra un valor potencial zeta de 17,2 ± 0,4 mV. Cabe señalar que una PdI de ≥0.5 es indicativo de una suspensión muy polidispersas. Por lo tanto, la muestra fue sometida a centrifugación de disco, y los datos de distribución de tamaño obtenidos también confirmaron una muestra no uniforme y no homogénea (Figura 7a). Análisis de la morfología y el tamaño de la muestra por TEM confirman aún más que las partículas en la dispersión son de hecho muy polidispersas (figura 8). A dispersar el polvo usando un baño ultrasónico durante 15 minutos, resultados mostraron mejora en la calidad global de la dispersión. En particular, la estabilidad (según lo observado por su correspondiente valor potencial zeta) y monodispersity general habían mejorado. Aumentar el tiempo de sonicación a 2 h resultó en mucho mayor estabilidad y estrecha distribución de tamaño de partícula (tabla 2). Es claro que hay gradual mejora en la calidad de dispersión si se utiliza más tiempo de sonicación de baño, por la disminución gradual del diámetro hidrodinámico y PdI. Si el procedimiento de dispersión se realiza usando una sonda ultrasónica en su lugar, se obtuvieron resultados similares. En general, un estado más estable y homogéneo de aglomeración se ha logrado mediante la sonda, según lo confirmado por datos DLS y TEM. Curiosamente, baño ultrasónico demostrado para ser una opción mejor que el uso de una sonda, como un tamaño medio de partícula mucho más pequeño y un tanto zeta potencial valor superior puede lograrse utilizando un baño en lugar de una sonda. Se observa que en ambos procedimientos de sonicación, las microfotografías TEM confirmaron la presencia de diferentes partículas primarias para incluir: esferas, cubos y poliedros.

Figura 7. Tamaño de distribución obtenida con centrifugación de disco para (A) (B) ZnO NM110_powder dispersión en agua a 0 min y CeO₂_powder Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Imágenes TEM del CeO₂ demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y estabilidad. La barra de escala es de 100 nm para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de ZnO, en las dispersiones se utilizan dos tipos de ZnO , ZnO nanomateriales diferentes de perfiles de superficie, (NM110) hidrofílico e hidrofóbico (NM111). Los resultados indican resultados similares entre los dos tipos de ZnO. Ambos demuestran que con no sonicación, la calidad de dispersión indica una granulometría media y alta polidispersidad. NM110 tiene un promedio de Z de 1.410 nm ± 120 y PdI de 0.786 ± 0.150 nm; NM111 tiene un promedio de Z de 758 ± 86 nm y PdI de 0.823 ± 0.006. Tamaño datos de distribución obtenidos para NM110 disco centrifugación también confirman muestra polidispersidad y homogeneidad (figura 7b). El tamaño y la polidispersidad de la sonicación NM110 parecen disminuir con tratamiento de 15 minutos en baño de ultrasonidos y llegar a una meseta de reducción óptima en 30 min tiempo de sonicación. Un tiempo de sonicación muestra un aumento general en los datos de tamaño de partícula, potencialmente debido a la partícula re-aglomeración después de ser aglomerado inicialmente. Por otro lado, NM110 muestra una dispersión homogénea y estable después de 2 min de tratamiento de punta de prueba ultrasónica. Sin embargo, ciclos más prolongados de 6 min y 10 min también muestran un aumento en el tamaño de partícula y valores de la PdI, que indica la aglomeración de las partículas. TEM (figura 9 y figura 10) y UV-vis (figura 3b–c) resultados más confirman el estado de tal calidad de dispersión. Curiosamente, resultados muy similares se observan en el caso de NM111 cuando trata con una sonda ultrasónica. Una vez más, el enfoque sistemático indica que la dispersión mejor se logró en el minuto 2, posible nueva aglomeración puede estar asociada con casos correspondientes de 6 min y 10 min. Cuando un baño de ultrasonidos se utilizó en su lugar, el tamaño de partícula de dispersión alcanza una meseta después de 30 min de sonicación; se observa después de que no aumenten o disminuyan en tamaño o polidispersidad valores. También, micrografías TEM obtenidas para el NM111 hidrofóbico indican la presencia de varios artefactos y otros efectos de sequía en la cuadrícula TEM (figura 10). Esto muestra que la humectación con etanol u otros solventes orgánicos puede ayudar a la preparación de dispersiones acuosas pero hubo retos sobre inmovilización muestras hidrofóbicas nanomaterial en las rejillas de carbón. En general, si se identifica un protocolo de dispersión óptima y esto se rige por el valor PDI más pequeño correspondiente, entonces corresponde a ZnO_NM110_B1 h y ZnO_Nm111_B30 min NM110 hidrofílico y hidrofóbico NM 111 casos, respectivamente.

Figura 9. Imágenes TEM de la ZnO NM110 demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y la estabilidad. La barra de escala es de 100 nm para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10. Imágenes TEM de la ZnO NM111 demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y la estabilidad. La barra de escala es 0.1 μm para min ZnO_NM111_B_15, h ZnO_NM111_B_1 y ZnO_NM111_P_2 min y 0,2 μm para el resto de las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de los nanotubos de carbono (CNTs), los resultados muestran que estos nanomateriales no son fácilmente dispersables en agua, en particular que el protocolo de dispersión implica el uso de físico vigoroso o agitación agitación. Esto es cierto para ambos nanotubos de carbono multipared (ello) utilizados en este estudio. Micrografías TEM en el caso de dispersiones A106 y A32 llevó a cabo en 2 minutos y 15 minutos del ciclo de la sonicación se muestran en la figura 11 y figura 12, respectivamente. Al aumentar el tiempo de sonicación, resultados indican rotura de CNTs, a menudo resulta en modificaciones de la longitud. Tales modificaciones de longitud eran evidentes en el caso de sonda y sonicación ultrasónica. Los resultados muestran que el A106 y A32 CNTs pueden ser suficientemente dispersos después de un tratamiento de 2 minutos si se utiliza una sonda ultrasónica. Aquí suficiente dispersión significa que el umbral de tiempo de sonicación crítica donde todos los paquetes de nanotubos (CNT) de carbono están abiertos y tubos individuales están separadas³⁵. Al aumentar el tiempo de sonicación a 6 min o 10 min, los resultados indican una modificación de la distribución de la longitud y mucho mayor polidispersidad. Por último, la intensidad distribuida de datos de tamaño de DLS (Figura 6a–b) y los espectros de absorción a través de UV-vis (figura 4a–b) también confirman que dispersiones de CNT son muy sensibles al tiempo de sonicación y Si ha utilizado una sonda o un baño. A106 y A32 CNTs muestran un pico de absorbancia entre 253 y 310 nm, que es típico de ello³⁶. Intensidad de pico es conocido por ser un buen indicador de la máxima dispersión posible en una dispersión impulsado por sonicación de ello. El espectro de UV de A106 y A32 indica ciclo de 2 min y 15 min de sonicación para ser óptimo para la suspensión. A sonicación prolongada, el pico se amplía con menor intensidad máxima así como la destrucción de la muestra indicado por el cambio en el espectro de absorbancia y asimetría espectral (formación de hombros de pico).

Figura 11. Imágenes TEM de la CNTs A106 demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y la estabilidad. La barra de escala es de 200 nm para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12. Imágenes TEM de la A32 CNTs demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y la estabilidad. La barra de escala es de 200 nm para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por último, para tener cierto grado de comparación, los datos se comparan con una suspensión comercialmente disponible de citrato estabilizado Ag NPs (nominal diámetro de 10 nm, 0.02 mg/mL). Datos de caracterización muestran que la dispersión es muy aglomerada y muy polidispersas. Datos de la DLS muestran una distribución multimodal con un diámetro hidrodinámico de 72 ± 50 nm y un PdI alto 0.46 ± 0.26 (figura 6 c). Análisis morfológico por met (figura 13) y el pico de resonancia de plasmones de superficie (SPR) amplia (absorción a 418 nm en la región visible) por UV-vis (figura 4C) más confirmar una muestra muy polidispersas. Curiosamente, el tratamiento de baño de ultrasonidos mejora la estabilidad de la dispersión y la PdI, pero solamente si una sonicación suficientemente largo período de tiempo se usa; es necesario un tiempo de sonicación de 2 h en tamaño de partícula DLS de 28 ± 5 nm y PdI 0.387 ± 0.015 (tabla 1). Sin embargo, si una sonda ultrasónica se utiliza en lugar de ello, la homogeneidad de la muestra y la estabilidad mejoran notablemente en apenas 2 minutos tiempo de sonicación, resultando así en tamaño de partícula DLS de 29 ± 1 nm, PdI de 0,300 ± 0.025 y ZP-42 ± 3 mV. Esta mejora en la calidad de dispersión también es evidente hasta un ajuste de tiempo de sonicación de 10 minutos, en que un tamaño de partícula DLS de 25 ± 2 nm ± PdI 0,251 0.011 y ZP-47.3 mV ± 1.4 se observa. Aquí, a 10 min de sonicación con tweeter de frasco, la PdI disminuye y aumenta de la ZP. Las micrografías TEM correspondientes en dichos puntos de tiempo respectivo también confirman muestra mayor homogeneidad después se aplican los protocolos de sonicación adecuado. Hay una rápida mejora en la homogeneidad de la muestra y la Dispersidad de las partículas en imágenes TEM. En 2 minutos muestra algunos aglomeración en comparación con las partículas individuales sonicada durante 10 min con el tweeter de vial.

Figura 13. Imágenes TEM de la NPs Ag comercial demostrando el impacto de la sonicación de la muestra homogeniety y la estabilidad. La barra de escala es de 200 nm para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Alta (mL)	Baja (mL)
1.4	0.2
1.2	0.4
1	0.6
0,8	0,8
0.6	1
0.4	1.2
0.2	1.4
0	1.6

Tabla 1. Gradiente de densidad de sacarosa para el volumen total de 1.6 mL de mezcla. Aquí marcamos la solución de sacarosa al 8% como bajo y 24% solución de sucrosa como alta. Son mezclados en los siguientes volúmenes (volumen total 1.6 mL cada vez) e inyectados en el cono de dis uno por uno hasta que se forma un gradiente.

Discusión

El objetivo del estudio es desarrollar una estrategia que permita la identificación de condiciones óptimas de sonicación para dispersiones de un número seleccionado de los nanomateriales en el agua. Intenta aquí documentar cuidadosamente los pasos de protocolo y parámetros durante la sonicación para satisfacer los vacíos identificados previamente en comentarios, así como seguir las recomendaciones formuladas en los últimos¹⁵. Caracterización de las dispersiones después de cada ciclo de sonicación y verificando la uniformidad y la estabilidad de la muestra se identifican las condiciones de dispersión óptima. Se evalúa el impacto de los procedimientos de la sonicación y estado de estabilidad basadas en las alteraciones características en claves propiedades fisicoquímicas de los nanomateriales, como determinado por distintas técnicas analíticas: DLS, ELS, UV-vis y TEM. El protocolo actual es una metodología adaptada para la dispersión de los nanomateriales de la literatura pasada y otros investigación proyectos^{21,22,37,38,39} con algunos modificaciones y refinamientos abordar las brechas claves, pasos y su aplicabilidad a nanomateriales más amplia de superficie similar perfil⁷. Sin embargo, se requieren con respecto a su tiempo de sonicación, resistencia y tipo para su aplicación a otros nanomateriales ajustes cuidadosos. También, se requiere trabajo adicional para establecer una correlación entre procedimiento de sonicación y actividad biológica de los nanomateriales. Seis diferentes tipos de dispersiones de nanomateriales son evaluados y comparados, sobre todo por su estabilidad, con un baño de ultrasonidos y una sonda ultrasónica equipada con un tweeter de vial en puntos de tiempo. Para mantener la pureza de la suspensión y las modificaciones no deseadas causadas debido a la contaminación, se evita aquí la sonda de sonicación. En el tweeter del frasco, los frascos pueden permanecer cerrados. Esto elimina cualquier contaminación cruzada de las muestras.

Calibración de sonicators es un factor clave ya que una gama de sonicators están disponibles con potencias, amplitud y frecuencias diferentes. Para determinar la energía acústica efectiva entregada la suspensión, calibración de sonicators se lleva a cabo usando calorimetría. La potencia acústica entregada para ajuste de amplitud de 70% para el tweeter del frasco, así como para la creación de baño 100% se calcula que < 1 W (0.75 ± 0,04 W y 0.093 ± 0,04 W, respectivamente). Sin embargo, las potencias indicaron por los fabricantes para tweeter vial y sonicador de baño 200 W y 80 W, respectivamente. Esto indica que a pesar de la fuente de alta potencia, la mayor parte de la energía se pierde durante la generación de burbujas cavitacionales y sólo una pequeña fracción realmente se entrega a la dispersión en el tratamiento²⁶. Estudios recientes han puesto de relieve la importancia del control de medición cavitacional en comparación con la energía de entrada del sonicador para un mejor control de la dispersión durante la sonicación⁸. La metodología parece prometedor para la dispersión controlada de nanomateriales altamente delicado como CNTs y se recomienda para futuros estudios.

Cada técnica utilizada en el estudio se basa en diferentes principios con limitaciones a todos. DLS no es una técnica ideal para suspensiones no esféricas muy polidispersas sistemas como. En esas condiciones, DCS se recomienda debido a la alta resolución, exactitud y precisión⁴⁰. DCS puede separar completamente los picos de la distribución de tamaño muy estrecha que difieren en tan poco como 3%. TEM proporciona imágenes visuales directas de las nanopartículas y es una gran herramienta para la determinación de la agregación, dispersión, tamaño y forma de las partículas, pero la técnica requiere muestras de secado que puede dar lugar a artefactos⁴¹. Esto se puede eliminar por lavado las rejillas con agua ultrapura como se explica en el paso 4.5.3.

Entre otras, la metodología pone de relieve algunos pasos críticos tales como el tipo de frascos utilizados en el protocolo, profundidad y posición de los frascos en baño ultrasónico como el tweeter de vial. Control de la temperatura del sistema durante la agitación es un parámetro importante. Se recomiendan cambios de agua frecuentes en el baño de ultrasonidos y modo pulsado ejecute en el caso de los tweeter de vial para evitar cualquier acumulación de calor durante la sonicación, evitando así cualquier alteración de la muestra. El paso previo humedecimiento para muestras hidrofóbicas como el óxido de Zinc ayuda en la dispersión de partículas, pero esto puede inducir algunos cambios no deseados. El tiempo de sonicación y energía deben ser alta lo suficiente para la aglomeración de las partículas pero no demasiado que rompe las partículas. Los resultados indican que la rotura de aglomerados es depende del tipo de partícula.

Nuestros resultados destacan la importancia de tener un protocolo de dispersión detallado, como indican que propiedades físico-químicas fundamentales potencialmente pueden ser alterados durante el proceso de sonicación, reguladas por factores como el tipo del sonicador, duración de la sonicación salida de tiempo y energía. Los resultados han mostrado que muestra integridad es potencialmente comprometida a mayor agitación de intensidad. Los resultados muestran que CNTs son muy sensibles a la agitación, así roturas son altamente probables que ocurra cuando se cambiaron la duración de la sonicación y fuerza. Cerca de ajustes óptimos para la dispersión de los CNTs son entre 2-15 min en el baño de ultrasonidos y sólo 2 minutos de uso de la sonda ultrasónica. Sin embargo, los ultrasonidos todavía puedan haber causado algunos nanotubos mantecas, que no pueden cuantificarse con precisión aquí. DLS no es una técnica ideal para la caracterización de los CNTs pero todavía puede proporcionar diámetro hidrodinámico de nanotubos y estos datos podrían ser informativos de las diferencias en las distribuciones de longitud de los CNTs entre varias muestras^{16, 42,43}. Últimos estudios demuestran que el protocolo de dispersión de los CNTs puede ser mejorado grandemente por la adición de tensioactivos como las moléculas del surfactante son absorbidas en el nanotubo monocapa, así proporcionando una barrera a la rotura por sonicación^{35, 44}. sin embargo, esto no puede ser comparado directamente el presente Protocolo no tensioactivos están involucrados en este caso. Es importante tener en cuenta que es muy importante, asegurando la distribución de tamaño de longitud en el caso de CNTs, como la relación de aspecto se correlaciona a menudo con cierta respuesta toxicológica. Por el contrario, CeO₂ dio resultados diferentes en comparación con los CNTs, en cual sonicación prolongada veces usando el baño ultrasónico o sonda, conducen a la formación de partículas primarias. La diferencia en resultados entre CNT y CeO2 casos destaca la importancia para adaptar dispersión protocolos p. ej., optimizar tiempo de sonicación y potencia de salida, de acuerdo al material de partida , es decir, el tipo de nanomaterial polvos. Cada tipo de muestra de polvo de nanomateriales es diferente, habrá diferentes grado de aglomeración en el polvo sí mismo. En algunos casos, el proceso de la aglomeración ha resultado con éxito en la aglomeración de hasta nivel de partículas primarias, como es evidente por la aparición de otras partículas formadas en las imágenes TEM, que no era visible antes del paso de sonicación. La sonicación prolongado resultó en la ruptura continua de aglomerados de óxido de cerio en ángulos distintos, lo que conduce a las partículas múltiples facetas.

En el caso de comercial compró muestra acuosa de dispersiones de NPs de Ag, nuestros resultados también enfatizan la necesidad de evaluación de la uniformidad y estabilidad a largo plazo. Hay una necesidad de garantizar que se han caracterizado suficientemente dispersiones antes de usarlo, especialmente en casos de almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, los nanomateriales tienen una vida útil muy corta. Edad con el tiempo y pueden comportarse de forma diferente después de almacenamiento a largo plazo en comparación con una dispersión recién preparada.

Los resultados aquí destacan la necesidad de una estrategia armonizada identificar un protocolo optimizado para diferentes nanomateriales. La estrategia propuesta presentada es realizar diferentes variaciones en el método de sonicación y asegurarse de que las dispersiones en diferentes puntos temporales se caracterizan suficientemente utilizando métodos analíticos complementarios. La importancia del uso de un enfoque de métodos múltiples para caracterizar y controlar la calidad de la dispersión a través del tiempo y diferentes condiciones experimentales se ha destacado por últimos trabajadores⁴⁵. Aunque se presentan varios métodos de sonicación para atender a la dispersión de nanomateriales específicas en el estudio, potencialmente pueden ser utilizados como base para dispersar otros nanomateriales metálicos y metal óxido (de similares características superficiales) en agua. Sin embargo, tener cualquier cambio en cualquier nanomaterial medio tipo o líquido requiere la necesidad de optimizar el protocolo básico, que puede hacerse por el cuidadoso ajuste de varios factores por ejemplo, tiempo de sonicación, resistencia y tipo sonicador. Cualquier protocolo es elegido e identificado como óptimo, allí es siempre una necesidad de tener un informe detallado sobre el esquema y secuencia paso a paso del procedimiento de dispersión de sonicación. Esto es importante para mejorar la interpretación y la comparabilidad. Una de las aplicaciones de este protocolo es facilitar la comparabilidad de datos entre laboratorios hacia un enfoque armonizado y estandarizado para futuros estudios. Los parámetros de control y metodología actuales pueden ser utilizados para otros medios de dispersión además de agua y las comparaciones pueden establecerse sobre una base caso por caso.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cerium oxide nanopowder	Sigma-Aldrich	544841	<25 nm particle size (BET)
Zinc oxide	European Commission's Joint Research Centre (JRC)	NM110	hydrophylic
Zinc oxide	European Commission's Joint Research Centre (JRC)	NM111	hydrophobic
Multi walled carbon nanotubes	NanoMile project (Large Collaborative Project under the European Commission's 7th Framework Programme)	A32 (MWCNT1)	3.0±1.8 µm long, O/C ratio of 4.5%
Multi walledcarbon nanotubes	NanoMile project	A106 (MWCNT2)	3.3±2.4 µm long, O/C ratio of 7%
Silver dispersion	Sigma-Aldrich	730785	10 nm particle size (TEM), 0.02 mg/mL
Zetasizer nano	Malvern Instruments		Particle size and zeta-potential measurements
Disc Centrifuge	CPS instruments Inc.	Model DC 24000	Particle size distribution by centrifugal sedimentation
Transmission electron microscope	JEOL USA	Jeol 1200EX TEM	Bright field images, particle size, shape, agglomeration
Ultrasonic probe fitted with a vial tweeter	Hielscher	UIS250V	Sonicator
Ultrasonic bath	Branson	Model 1510	Sonicator
Eppendorf vials	Eppendorf	2236411-1	1.5ml capacity
UV-vis spectrophotometer	Jenson flight deck	Model 6800	SPR peaks, suspension stability
Disposable folded capillary cell	Malvern Instruments	DTS 1070	for the measurement of elecr
Zeta- potential standard	Malvern Instruments	DTS 1235
Quartz cuvette	Jasco	1103-0042	Rectangular quartz cell 10 x 100 Spectrosil Quartz with lid 190 -2700 nm