Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Resumen

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por flujo de aire persistente limitación y pulmón parenquimatosa la destrucción. Tiene una incidencia muy elevada en las poblaciones que envejecen. Las actuales terapias convencionales para EPOC foco principalmente en síntomas medicamentos; por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas terapias. Modelos animales calificados de EPOC podrían contribuir a caracterizar los mecanismos subyacentes y pueden ser utilizados para detección de drogas nuevas. Modelos actuales de la EPOC, como el lipopolisacárido (LPS) o la elastasa pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema inducido, generar EPOC-como lesiones en los pulmones y vías respiratorias pero no de lo contrario se asemejan a la patogenia de la EPOC humana. Un humo de cigarrillo (CS)-modelo inducido sigue siendo uno de los más populares ya que no sólo simula EPOC-como lesiones en el sistema respiratorio, pero también se basa en uno de los principales materiales peligrosos que causa EPOC en los seres humanos. Sin embargo, los aspectos desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva del modelo CS-inducida dramáticamente limitan su aplicación en la detección de drogas de nuevo. En este estudio, hemos generado con éxito un nuevo modelo de EPOC mediante la exposición de ratones con altos niveles de ozono. Este modelo demostró lo siguiente: 1) disminuido volumen expiratorio forzado 25, 50 y 75/forzado capacidad vital (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC y VEF₇₅/FVC), indicando el deterioro de la función pulmonar; 2) alvéolos del pulmón ampliada, con destrucción parenquimatosa pulmonar; 3) reduce el tiempo de fatiga y la distancia; y 4) aumenta la inflamación. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el modelo de exposición (OE) de ozono es un modelo confiable que es similar a los seres humanos debido a la sobreexposición de ozono es uno de los factores etiológicos de la EPOC. Además, sólo tomó 6-8 semanas, basados en nuestro trabajo anterior, para crear un modelo de OE, mientras que se requiere de 3 a 12 meses para inducir el modelo de humo de cigarrillo, lo que indica que el modelo de OE puede ser una buena opción para la investigación de la EPOC.

Introducción

Se ha estimado que la EPOC, incluyendo bronquitis crónica y enfisema podría ser la tercera causa de muerte en el mundo en el 2020^1,2. Se estima la potencial incidencia de EPOC en una población de más de 40 años 12.7% en los hombres y 8,3% en las mujeres dentro de los próximos 40 años³. No hay medicamentos están disponibles para revertir el deterioro progresivo en la EPOC pacientes⁴. Modelos animales confiables de la EPOC no sólo demandan la imitación del proceso patológico de la enfermedad pero también requieren un período de generación corto. Modelos actuales de la EPOC, incluyendo los LPS o un modelo de EPI-inducida, pueden inducir síntomas de enfisema^5,6. Una sola administración o un reto de la semana de LPS o PPE resultados ratones o ratas en marcada neutrofilia en el lavado broncoalveolar (BALF), aumentos de mediadores proinflamatorios (p. ej., TNF-α y IL-1β) en suero, o BALF produce pulmón espacios de aire agrandado de destrucción parenquimatosas y límites aire^5,6,7,8,9,10. Sin embargo, LPS o EPI no son causas de EPOC humana y así no imitan el proceso patológico¹¹. Un modelo CS-inducida produce una limitación del flujo de aire persistente, destrucción de parénquima pulmonar y redujo la capacidad de ejercicio funcional. Sin embargo, un protocolo tradicional de CS requiere al menos 3 meses para generar un EPOC modelo^12,13,14,15. Por lo tanto, es importante generar un nuevo modelo de animal más eficiente que cumpla los dos requisitos.

Recientemente, además del consumo de cigarrillo, contaminación del aire y la exposición ocupacional se han convertido en causas más comunes de EPOC^16,17,18. El ozono, como uno de los principales contaminantes (aunque no es el componente principal de la contaminación atmosférica), directamente puede reaccionar con el tracto respiratorio y dañar el tejido pulmonar de los niños y jóvenes adultos^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozono, así como otros estimulantes, incluyendo LPS, PPE y CS, participan en un serio de vías bioquímicas de estrés oxidativo pulmonar y daños en el ADN y están vinculadas a la iniciación y la promoción de EPOC^26,27. Otro factor es que los síntomas de algunos pacientes con EPOC se deterioran después de estar expuesto al ozono, lo que indica que el ozono puede interrumpir pulmón función^18,28,29. Por lo tanto, nos genera un nuevo modelo de EPOC al exponer repetidamente ratones a altas concentraciones de ozono durante 7 semanas; Esto dio lugar a defectos de flujo de aire y daños parenquimatosos pulmonares similares a los de anteriores investigaciones^30,31,32. Extendió el protocolo de OE a ratones hembra en este estudio y reproducir con éxito el enfisema en ratones machos en nuestros anteriores estudios^30,31,32. Porque ha disminuido la mortalidad de la EPOC en los hombres aumentó en las mujeres en muchos países³³, un modelo de EPOC en las mujeres es necesario para estudiar los mecanismos y desarrollar métodos terapéuticos para pacientes EPOC. La aplicabilidad del modelo OE para todos los géneros presta ayuda adicional a su uso como un modelo de EPOC.

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Protocolo

Nota: OE el modelo ha sido generado y utilizado en la investigación previamente divulgados ^{30 , 31 , 32}. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Jiaotong de Shanghai.

1. ratones

centro

1. casa libre de patógeno, de 7 a 9 semanas de edad hembra ratones BALB/c en jaulas individuales ventiladas en un animal bajo control temperatura (20 ° C) y humedad (40-60%). Proporcionar un ciclo oscuro 12 h en el centro y 12 h de luz. Proporcionar alimento y agua ad libitum.

2. Ozono o exposición al aire

1. generar ozono con un generador eléctrico en una caja de acrílico (e.g. plexiglás) sellado. Soplar el aire fuera de la caja con un ventilador pequeño a través de un tubo de ventilación de aire que se conecta en el interior y fuera de la caja. Monitorear la concentración de ozono en la caja usando una sonda de ozono. Espere hasta que la concentración de ozono en el cuadro de alcance 2,5 partes por millón (ppm).
   Nota: La sonda de ozono puede cambiar automáticamente el generador de ozono o apagar y puede mantener el nivel de ozono en la caja de 2,5 ppm.
2. Colocar los ratones en la caja cuando el nivel del ozono llegue a 2,5 ppm. Mantener los ratones en el cuadro de 3 h cada vez para exponer al ozono.
   Nota: El cuadro puede mantener un nivel de 2,5 ppm de ozono durante 3 h desconectando automáticamente el generador de ozono o desactivar y soplar el CO ₂ que es producido por los ratones fuera de la caja.
3. Dar dos exposiciones de ozono (cada exposición duración 3 h) por semana (una vez cada 3 días) por 7 semanas, exponer los ratones de control al aire al mismo tiempo y en el mismo periodo.

3. La tomografía computada micro

1. al final de la semana 7, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no responder a un pellizco del dedo del pie. Monitor y mantenga el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
2. Colocar los ratones anestesiados en la cámara de una tomografía micro computada (µCT).
3. Calibrar el µCT usando el protocolo estándar y el fabricante ' instrucciones. Fijar el tubo de rayos x a 50 kV y la corriente en 450 μA.
   Nota: Tanto los rayos x y el detector giran alrededor de los ratones.
4. Realizar el análisis µCT mediante la adquisición de 515 proyecciones con un tamaño de píxeles efectivos de 0,092 mm, un tiempo de exposición de 300 ms para una rebanada y una rebanada de 0,093 mm.
5. Reconstruir el pulmón con las imágenes adquiridas mediante un software. Ajustar brillo de la imagen en escala de grises fijando el mínimo y máximo de la escala de grises en unidades Hounsfield-750 y-550, respectivamente.
   Nota: El software automáticamente calcula los volúmenes de la parenquimia de pulmón y el área de baja atenuación (LAA) ^{34 , 35}.
6. Calcular el porcentaje de LAA (LAA %) dividiendo el volumen LAA por el volumen pulmonar total.

4. prueba de la cinta de correr

1. dan los ratones una adaptación de prueba a una velocidad de 10 m/min durante 10 min en una corriente cinta de la máquina. Nota: la electricidad siempre está apagado cuando el procedimiento se lleva a cabo.
2. administrar un prueba de fatiga a los ratones.
   1. Calentar los ratones a una velocidad de 10 m/min por 5 min
   2. Aumentar la velocidad a 15 m/min durante 10 minutos
   3. Aumentar la intensidad del ejercicio: aumenta la velocidad de 5 m/min, a partir de 20 m/min, cada 30 min hasta ratones no puede continuar funcionando ³⁶.
3. Registrar el total de distancia corriente y tiempo de funcionamiento como distancia de fatiga y cansancio tiempo, respectivamente.

5. medidas de función pulmonar

1. anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales para ver que el ratón no no responder a un pellizco del dedo del pie y espere hasta que los ratones han mantenido espontáneo respiración. Monitor y mantienen el ratón a una frecuencia constante de la respiración; y asegúrese de que no hay movimientos voluntarios existen durante los procedimientos de.
2. Tracheostomize los ratones cuidadosamente y colocarlos en un pletismógrafo de cuerpo conectado a un ventilador controlado por ordenador.
   Nota: La ventilación es controlada mediante una válvula situada proximalmente al tubo endotraqueal. La configuración proporciona diferentes maniobras semiautomáticas, incluyendo la maniobra de la cuasi-estática presión volumen y la maniobra de flujo rápido del volumen de la.
3. Imponer un promedio de frecuencia de 150 respiraciones/min hasta el ratón anestesiado mediante ventilación controlada por presión hasta un patrón de respiración regular la respiración y expiración completa en cada ciclo de respiración se obtiene.
4. Realizar la maniobra de presión-volumen cuasi-estático con el dispositivo mediante la presión negativa generada en el pletismógrafo.
5. Realizar la maniobra de volumen de flujo dentro de los lazos de la cuasi-estática de presión-volumen a grabar la FVC y el FEV. Inflar el pulmón + 30 cm H ₂ O e inmediatamente después conectarlo a una presión altamente negativa para hacer valer la caducidad hasta el volumen residual es el VEF en el primer 25, 50 y 75 ms de la exhalación (FEV ₂₅-30 cm H ₂ O. expediente FEV ₅₀ y ₇₅ de la FEV, respectivamente). Rechazar las maniobras subóptimas. Para cada prueba con cada ratón, realizar un mínimo de tres maniobras aceptables para obtener una media fiable para todos los parámetros numéricos.

6. Colección de BALF

1. tras anestesia terminal con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) ajustar la dosis según situaciones individuales al ver que el ratón no responde a un pellizco del dedo del pie y perder el aliento), lavado del ratones con 2 mL de PBS a través de un tubo endotraqueal de 1 mm de diámetro y luego recuperar el BALF ¹⁰.
2. Piscina las alícuotas obtenido el lavado y centrifugar a 4 ° C y 250 x g durante 10 minutos
3. Recoger el sobrenadante para su uso inmediato y almacenar el resto a-80 ° C o líquido nitrógeno.
4. Cuenta el número total de células usando un hemocitómetro.
5. Resuspender el precipitado de células en PBS y luego giro (1.400 x g, 6 min) 250 μl de células resuspendidas en diapositivas utilizando una centrífuga de spinner diapositiva.
6. Tinción de Wright se aplican a las células en el portaobjetos según el fabricante ' Protocolo s.
7. 200 células por ratón; identificar las células como los macrófagos o neutrófilos, según morfología estándar, bajo 400 aumentos; y sus números de la cuenta.

7. Muestreo de sangre cardiaca

1. recoger la sangre mediante punción cardiaca, carga en tubos de 1,5 mL y mantenerlo en hielo durante 30 minutos
2. Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 2.000 x g y 4 ° C.
3. Transferir el sobrenadante (suero) a un tubo nuevo y conservarlo a-80 ° C o líquido nitrógeno.
4. Preparar el suero de IL-1β, IL-10 y pruebas de detección de TNF-α utilizando los respectivos kits ELISA.

8. Análisis morfométrico de pulmón

1. diseccionar los pulmones y el traquear de los ratones.
   1. Posición cada eutanasia ratón sobre un tablero quirúrgico inmediatamente después del sacrificio.
   2. a diseccionar el platisma y los músculos traqueales anteriores para visualizar y acceder a los anillos traqueales.
   3. Abierta a la torácica de la cavidad. Diseccionar los pulmones y la tráquea, pero no separar el corazón de los pulmones.
2. Conectar el catéter endotraqueal a una jeringa con paraformaldehído al 4% a través de un tubo de polietileno PE90.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico. Use guantes y gafas de seguridad y utilizar la solución dentro de una campana de humos.
3. Inflar el pulmón completamente con paraformaldehído al 4% (10 gotas, ~ 200 μL) a través del catéter endotraqueal. Quitar el corazón después de la terminación de la inflación.
4. Mantener el pulmón en un tubo de 15 mL que contiene 10 mL de paraformaldehído al 4% para al menos 4 h.
5. Incrustar el pulmón en parafina. Obtener secciones de 5 μm por el bloque de parafina de seccionamiento con un micrótomo rotatorio. Durante el seccionamiento, exponer la máxima superficie de tejido pulmonar dentro del área del árbol bronquial.
6. Para el análisis morfométrico, realizar hematoxilina y eosina (H & E) manchas en las secciones de.
7. Las secciones de la imagen con un microscopio de campo brillante vertical (objetivo, 20 X, tiempo de exposición, ms 1,667).
8. Tienen dos investigadores cegados en el protocolo de tratamiento independientemente contar las secciones histológicas. Utilizar la intercepción lineal media (L _m) como un parámetro para medir la distancia de la pared septal alveolar entre. Determinar el L _m siguiendo estos pasos:
   1. Abra las imágenes de las secciones en Photoshop y dibujar una cuadrícula de la retícula en la imagen con líneas largas de cinco 550 μm.
   2. Contar el número de alvéolos a través de la línea de la red.
   3. Calcular el L _m dividiendo la longitud de la línea de la cuadrícula el número de alvéolos. Para la cuantificación, imagen de cinco secciones por ratón. Adquirir diez imágenes de cada sección (una imagen por campo) y evaluar al azar. Durante la selección del terreno, evitar los campos de las vías respiratorias y los vasos moviendo un campo adelante o en otra dirección.
      Nota: Los datos se presentan como la media ± SEM Se realizó una prueba de t no pareada para comparación entre ratones expuestos al aire y los ratones expuestos al ozono. Tres animales de cada grupo se utilizaron para calcular la diferencia significativa. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo.

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Resultados

Ejemplos de imágenes 3D µCT de cada grupo se muestran en la figura 1un. Los ratones expuestos al ozono tenían un volumen pulmonar total significativamente mayor (figura 1a y b) y LAA % (figura 1c) de los ratones de control expuestos al aire. La capacidad pulmonar y LAA % seguían elevadas después de seis semanas de la exposición de ozono

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Discusión

En este estudio, presentamos un método confiable para la generación de un nuevo modelo de EPOC. En comparación con otros modelos (es decir, LPS o modelos de EPI), este modelo de OE recapitula el proceso patológico de pacientes con EPOC. Porque el humo del cigarrillo es el principal material peligroso que causa EPOC en pacientes humanos con⁴⁰, el modelo CS sigue siendo el más popular EPOC modelo^41,42. Sin embargo, el modelo CS...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.