Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

Resumen

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Resumen

Las células muestran morfologías diferentes y complejas relaciones anatómicas. ¿Cómo las células interactúan con sus vecinos? ¿Las interacciones difieren entre los tipos de la célula o incluso dentro de un tipo determinado? ¿Qué tipo de reglas espaciales siguen? Las respuestas a tales preguntas fundamentales en vivo se han visto obstaculizadas hasta ahora por la falta de herramientas para el etiquetado de celda única de alta resolución. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para apuntar las células con una técnica de FlpOut (MCFO MultiColor). Este método se basa en tres diferente etiquetados Reporteros (HA, bandera y V5) bajo control de la UAS que se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor induce la expresión de un calor inducida por choque Flp recombinase, que elimina al azar los cassettes FRT-parada-FRT en celdas individuales: expresión ocurre solamente en células que expresan también un conductor de GAL4. Esto conduce a una matriz de células diferentemente coloreadas de un tipo celular dado que permite la visualización de la morfología de la célula individual en alta resolución. Por ejemplo, la técnica MCFO puede combinarse con controladores específicos de GAL4 gliales para visualizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila .

Introducción

Glia, la población de células no neuronales del sistema nervioso (NS), se ha creído durante mucho tiempo para proporcionar un marco estático para las neuronas y por lo tanto no fueron estudiados en detalle. Sin embargo, en los seres humanos, glía constituyen la gran mayoría de las células en el NS (~ 90%) y caída en varias categorías diferentes, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células de Schwann. En Drosophila, glía constituyen cerca del 10% de las células en el NS. Curiosamente, sus morfologías y funciones son notablemente similares a las que se encuentran en vertebrados^1,2. Sus morfologías incluyen barrera blood - brain (BBB) formación de epitelios, envolvente y astrositos-como las células.

El sistema de nervioso central de Drosophila (CNS) consta de las siguientes estructuras principales: regiones de la corteza que contienen los cuerpos celulares neuronales; neuropils que albergan conexiones sinápticas; tractos de axones pequeños y grandes que conectan diferentes neuropiles; nervios periféricos que conectan músculos y órganos sensoriales con el SNC (figura 1). Glia se encuentran asociados a todas estas estructuras anatómicas: glía (CG) de la corteza en las regiones corticales, astrositos-como glia (ALG) y glía envolvente (GE) en las regiones de neuropilos, glia envolvente también están asociados con tractos axón central y periférico nervios (EGN) y por último, dos de hoja-como glia, glia perineurial (PG) y subperineurial (SPG), que juntos forman una capa contigua que cubre el entero NS (figura 2).

Estudios anteriores han demostrado que glía desempeñan un papel importante en el desarrollo del NS; monitorear el número de células neuronales reaccionando a la circulación sistémica péptidos similares a la insulina, proporcionan apoyo trófico para las neuronas, como la lanzadera de lactato astrositos-neurona y eliminar las neuronas moribundas por fagocitosis^{3,4 , 5 , 6}. en el NS maduro, glia mantener el BBB, tomar neurotransmisores y mantener la homeostasis iónica, actúan como las principales células inmunes en el NS, puesto que los macrófagos no incumple el BBB y modulan la actividad sináptica así como el comportamiento de los animales^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Si los diferentes subtipos gliales realizan funciones especializadas, sigue siendo una incógnita importante. Sin embargo, un análisis sistemático del genoma de glia, especialmente en el adulto, se ha visto obstaculizado por la falta de adecuadas herramientas genéticas para su manipulación. Aquí, se presenta un método que permite la caracterización eficiente y fácil de las formas de la célula para el estudio de las interacciones célula-célula compleja. Esta técnica se ha aplicado para caracterizar la morfología de los diferentes subtipos gliales en el cerebro adulto de Drosophila , pero, según el driver específico de GAL4 utilizado, podría adaptarse para estudiar las neuronas^12,13 , cualquier tipo de entrelazar las células y en principio cualquier tejido en cualquier fase del desarrollo.

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Protocolo

1. preparación de moscas para los experimentos de FlpOut MultiColor (MCFO)

Nota: técnica MCFO el se refiere a una versión modificada de la supresión de casete parada mediada por Flp llamada (FlpOut). Moscas transgénicas de MCFO llevan un promotor de choque térmico (hsp)-Flp recombinase y diferentes reporteros en UAS de control. Cada reportero consiste en un esqueleto común de myristoylated (myr) super carpeta verde fluorescente en una proteína (sfGFP), que 10 copias de una etiqueta del epítopo (e.g., HA, bandera o V5) se han insertado. Las proteínas no fluorescente resultantes se nombran " monstruo espagueti Pfg " (smGFPs) ¹⁴ y pueden ser detectadas utilizando anticuerpos específicos contra las etiquetas de epítopos diferentes.

1. Cruz vuela con el casete MCFO y hsp-Flp (hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) a las correspondientes líneas gliales de conductor en GAL4 (véase tabla de materiales) .
   1. El hsp ya está activo a 25 ° C y pocas células pueden sufrir recombinación hacia un etiquetado inespecíficas, establece cruces a 18 ° C para evitar la filtración del sistema. Esperar alrededor de 20 días a 18 ° C para obtener la generación F1. Tras el calor del choque (ver paso 2), mantener moscas a 25 ° C ( figura 3).

2. Choque de calor

Nota: dependiendo del sitio de inserción, puede variar la eficacia de la hsp-Flp; por lo tanto, el tiempo de descarga de calor óptimo tiene que ser optimizado. De este protocolo, se ha utilizado un stock mosca MCFO que el hsp-Flp fue insertado en el cromosoma X (véase Tabla de materiales).

1. Transferencia de la progenie de la Cruz en el paso 1.1 (moscas de generación F1, 3-4 días de edad) en nuevos frascos de alimento y calor les choque a 37 ° C en un baño de agua.
   Nota: Las moscas jóvenes (1-2 días) son muy sensibles al choque térmico. Esperar 1 o 2 días más antes de realizar el choque térmico para reducir la tasa de mortalidad causada por el tratamiento. Algunos de la generación F1 vuela como control, sin choque térmico uso.
2. Durante el choque del calor, mantener moscas en frascos normales con alimentos para disminuir la tasa de mortalidad inducida por el estrés. Poner hembras y machos en viales independientes.
3. No se olvide de sumergir el frasco entero en el agua para un choque de calor homogéneo. Utilizar un choque de 5-8 min como punto de partida conveniente para el etiquetado dispersos de células de la glia con muchas líneas de controlador GAL4; la duración de choque debe optimizarse para cada conductor y el experimento (tiempos de choque de calor menor o mayor pueden ser necesarios).
4. Después del choque del calor, poner los frascos horizontalmente sobre la mesa durante unos minutos para permitir que las moscas para recuperarse del choque del calor.
   Nota: No es necesario cambiar los frascos de.
5. Mantener las moscas a 25 ° C y diseccionarlos (ver paso 3 y 4) 2 o más días después del choque del calor para la expresión óptima del reportero.

3. Preparación de disección y soluciones

1. el día de la disección, preparar solución fresca de fijación en tubos PCR de 200 μL mezclando 180 μl de medio de cultivo celular de S2 con 20 μl del 20% paraformaldehido (PFA) para obtener una solución 2% de la PFA. Mantener la solución fijadora en el hielo antes y durante la disección.
   PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
   Nota: Mezclar 160 μl de medio de cultivo celular de S2 con 40 μl del 20% paraformaldehido (PFA) en un tubo PCR de 200 μL para preparar una solución PFA 4% en lugar de una solución al 2%.
2. Utilizar un tubo de PCR por genotipo con un máximo de 8-10 cerebros por el tubo para obtener resultados óptimos tinción.
3. Preparar el cerebro adulto, solución de lavado: albúmina de suero bovino de 0.5%, 0.5% Tritón X-100 en PBS.
   Nota: Dependiendo de la tinción, una solución que contiene 1% Tritón X-100 puede ser necesaria. Una mayor concentración de Triton X-100 aumenta la penetración de los anticuerpos en el tejido y es necesario a las regiones de manchas que se encuentran dentro del tejido (por ejemplo, regiones sinápticas en el cerebro adulto de Drosophila).
4. Prepare la solución de bloqueo: suero de cabra normal 3%, 3% burro normal suero y 0.5% Tritón X-100 en PBS.
5. El cerebro adulto de lavado solución y la solución de bloqueo puede almacenarse a 4 ° C durante algunas semanas.
6. Poner la placa de cristal de pozos de depresión profunda en el hielo y rellenar cada uno con las siguientes soluciones: uno con etanol al 70%, uno con PBS y otro con medio de cultivo celular S2.

4. Disección de cerebro adulto

1. colocar un 3 cm plato de disección en el escenario de un estereomicroscopio y llenar con medio de cultivo de células de S2 frío. Llevar a cabo todas las disecciones en este medio para que el tejido permanezca saludable durante el procedimiento de disección.
   Nota: Utilice un plato disección con varios milímetros de silicona negra que proporciona un contraste de fondo buena (en las imágenes) y preservar el fórceps durante la disección.
2. Anestesiar las moscas del genotipo deseado con CO ₂.
3. Con pinzas, coge la mosca por las alas y lavar en etanol frío al 70% durante 30 s, luego con PBS frío adicional 30 s.
4. Transferencia de la mosca en la profunda depresión bien relleno con medio de cultivo celular S2.
5. Repetir el mismo procedimiento para todas las moscas del mismo genotipo y mantenerlas en frío medio de cultivo celular de S2 hasta la disección, que preserve el tejido.
   Nota: Anestesiar sólo el número de moscas que puede ser disecado en un período de tiempo de unos 30 minutos largos tiempos de incubación en medio de cultivo celular de S2 puede dañar el tejido.
6. Agarrar la mosca con fórceps y, bajo un estereomicroscopio, sumerja la mosca en medio de cultivo celular S2.
7. Separar la cabeza del resto del cuerpo. Deseche el cuerpo y mantener la cabeza sumergida en el medio de cultivo celular de S2. Es muy importante sostener la cabeza con unas pinzas para toda la duración de la disección. Si la cabeza empieza a flotar, va a ser difícil recuperarlo sin dañar el tejido.
8. Comenzar la disección sacando un ojo, mientras sostiene la cabeza con pinzas al menos una en todo momento. Asegúrese de que la punta de las pinzas es justo debajo de la retina para evitar dañar el tejido por debajo. Saca el otro ojo y empezar a quitar la cutícula hasta el cerebro aparece.
9. Eliminar todo tejido traqueal y cutícula alrededor del cerebro aparezca limpiado el tejido. Asegúrese de eliminar todo el tejido traqueal alrededor del cerebro para óptimos resultados de tinción; los tejidos están ahora listos para ser fijados y teñidos.
10. Mantener todos los cerebros disecados en frío S2 celular medio de cultivo antes de transferirlos a la solución PFA para el paso de la fijación del tiempo.

5. Cerebro adulto la coloración

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Transferir el cerebro aislado con una pipeta P10 en la solución de la PFA a temperatura ambiente (RT). Para evitar el daño de tejido, nunca utilice pinzas para transferir el cerebro después de la disección. Realizar todos los pasos en tubos PCR de 200 μL en un nutator.

Para todos los pasos, antes de tirar la vieja solución con una pipeta de P200, permiten el cerebro colocar en la parte inferior del tubo. Intente extraer el sobrenadante sin aspirar el tejido. Proteger el tejido contra la exposición a la luz.

Fijar el cerebro en 200 μL de 2% PFA en medio de cultivo celular de S2 durante 1 hora o en el 4% PFA durante 30 minutos. Mantener tiempos de fijación idéntico entre muestras para aumentar la reproductibilidad.

Después de 3 (o más) lavados de 15 minutos cada uno en 200 μL de solución, de lavado de cerebro adulto bloquear los tejidos con 200 μL de solución de bloqueo durante 30 minutos. Tiempo de incubación en el bloqueo de solución es posible.

Incubar el cerebro durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios diluidos en cerebro adulto solución de lavado en un volumen total de 200 μl.
Nota: Los tiempos de incubación pueden variar dependiendo del tipo de anticuerpo usado. Incubaciones más largas pueden ser necesarias.

1. Para el etiquetado de los tres marcadores MCFO, incubar los cerebros con anti-HA (1: 500), anti-FLAG (método DYKDDDDK) (1: 100) y anticuerpos primarios anti-V5.
2. Primaria directamente conjugados con anticuerpos podrían ser utilizados en lugar de la normal combinación primaria + secundaria (por ej., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). En este caso, tratar directamente conjugados con anticuerpos como anticuerpos secundarios.
   Nota: Para cada genotipo, mantenga algunos cerebros como controles para verificar la especificidad de la tinción. Olvidese de la incubación del anticuerpo primario y vaya directamente al paso siguiente.

Lavar los tejidos 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución (paso 3.3) de lavado de cerebro adulto e incubar con secundarios conjugados fluoróforo-primaria directamente anticuerpos conjugados con diluido en cerebro adulto solución de lavado durante la noche en 4 ° C o 4 h a temperatura ambiente, en un volumen total de 200 μL
Nota: ejemplos de anticuerpos adecuados: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) y DyLight 647 (1: 100)-conjugado anticuerpos.

Lavar el cerebro 3 veces durante 1 h en 200 μL de solución, seguida de un lavado final en 200 μL de PBS durante la noche a 4 ° C o por 1-2 h a temperatura ambiente de lavado de cerebro adulto; el paso de lavado final en PBS elimina cualquier rastro de Triton X-100 y es necesario para óptimos resultados de tinción. Montar los cerebros en el medio de montaje con un agente anti-fade en cubreobjetos de cristal.

6. Montaje de cerebros para la proyección de imagen

1. Trim una proyección de imagen de espaciador para el tamaño apropiado con unas tijeras. Para microscopía de alta resolución, emparedado de la muestra y proyección de imagen de espaciador entre dos cubreobjetos de cristal.
   Nota: Los espaciadores de la proyección de imagen son delgada (0,12 mm de espesor) separadores adhesivos que pelan y adhieren al portaobjetos cubreobjetos o microscopio, permitiendo el montaje de especímenes sin compresión.
2. Uso de fórceps, retire la lámina protectora adhesiva de una superficie y aplique el espaciador, el lado adhesivo hacia abajo, en la superficie de un vidrio cubreobjetos (22 mm x 60 mm). Aplicar 10 μl de medio de montaje para un cubreobjetos de vidrio nueva.
3. Con P10 una pipeta, transferir los cerebros del tubo 200 μL al cubreobjetos, junto a la gota de medio de montaje. Junto con los tejidos, transferir algunos PBS para mantener el cerebro en la solución.
4. Pipeta con un P10, mueva los cerebros del PBS a la gota de medio de montaje tratando de limitar la cantidad de PBS. Transferencia de las muestras en medio de montaje sobre el cubreobjetos con el espaciador de la proyección de imagen. Use suficiente medios de montaje para cubrir la muestra.
5. Quitar el otro forro adhesivo de la parte superior del espaciador y añadir un cubreobjetos de cristal sobre las muestras. Con la punta de unas pinzas, aplicar una ligera presión sobre el área adhesivo para sellar. Imagen de los tejidos montados inmediatamente o almacenar las diapositivas a-20 ° C para su posterior análisis.

7. Adquisición de la imagen

1. pilas de adquisición de imágenes de fluorescencia confocal utilizando un microscopio confocal con un 40 X (NA = 1.2, inmersión en agua) objetivo o 63 X (NA = 1.4, inmersión aceite) objetivo (tamaño de pixel = 1.024 x 1.024 en el plano xy; Distancia entre dos secciones confocales = 0.5 μm). Ajustar la ganancia del detector y el desplazamiento en cada canal de tal manera que no hay pixeles saturados y cero valores de los píxeles están presentes en las imágenes; Esto evita la pérdida de información y asegura uso del rango dinámico completo del detector de.
   Nota: Puesto que la proyección de imagen 3D es desperdiciador de tiempo, las mediciones pueden automatizarse mediante la exploración de múltiples muestras en paralelo en diferentes lugares. Para evitar la evaporación con el objetivo de inmersión de agua, uso de medio de inmersión de aceite especial con índice de refracción n = 1.33.
2. Procesar las pilas confocales para proyecciones de máxima densidad, cambios en el tono del canal y el ajuste de brillo y contraste con cualquier software de análisis de imagen estándar (véase Tabla de materiales).

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Resultados

Esta sección ilustra ejemplos de resultados que pueden obtenerse mediante la técnica MCFO en el cerebro adulto de Drosophila . La figura 3 muestra un esquema del método. Tres diferentemente etiquetadas de membrana Reporteros (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG y myr-smGFP-V5) bajo control de la UAS se guardan silenciosos por un terminador transcripcional flanqueado por dos sitios de la FRT (FRT-parada-FRT). Un pulso de choque de calor...

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Discusión

Este protocolo describe un método sencillo y eficaz para estudiar la morfología de los diferentes tipos de células en un tejido de interés en alta resolución. Con la técnica MCFO, varios reporteros con epítopos diferentes etiquetas se utilizan en combinación para etiquetado estocástico multicolor (figura 2). Similar a otros métodos como Brainbow/Flybow^15,16,17, MCFO aumenta la diversidad d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning