Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Resumen

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Resumen

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica ampliamente utilizada para el mapeo de la localización de modificación postraduccional de las histonas, variantes de las histonas, factores de transcripción o enzimas modificadores de la cromatina en un locus determinado o en una escala genoma-ancha. La combinación de ensayos de ChIP con secuenciación de próxima generación (es decir, ChIP-Seq) es un enfoque poderoso para descubrir todo el mundo redes reguladoras del gene y para mejorar la anotación funcional del genoma, especialmente de secuencias reguladoras no codificantes. Protocolos de chIP normalmente requieren grandes cantidades de material celular, así que la aplicabilidad de este método a la investigación de tipos raros de la célula o biopsias de tejido pequeño. Para hacer el ensayo de ChIP compatible con la cantidad de material biológico que se puede obtener normalmente en vivo durante la embriogénesis temprana de vertebrados, se describe aquí un protocolo simplificado de ChIP en el que el número de pasos necesarios para completar la ensayo fueron reducidas para minimizar la pérdida de muestra. Este protocolo de ChIP se ha utilizado con éxito para investigar modificaciones de las histonas diferentes en varios embrionario pollo y ratón adulto tejidos utilizando baja a un número medio de células (5 x 10⁴ - 5 x 10⁵ células). Lo importante, este protocolo es compatible con la tecnología ChIP-seq con métodos de preparación de la biblioteca estándar, proporcionando epigenómica global mapas en tejidos embrionarios muy relevantes.

Introducción

Modificaciones post-traduccionales de las histonas están directamente involucradas en diversos procesos dependiente de la cromatina, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN^1,2,3. Además, modificaciones de las histonas diferentes muestran positivos (por ejemplo, H3K4me3 y H3K27ac) o negativo (por ejemplo, H3K9me3 y H3K27me3) correlaciones con la expresión de genes y puede ser definido ampliamente como marcas de activación o represión de la histona, respectivamente^2,3. En consecuencia....

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Protocolo

según las pautas de cuidado de los animales alemana, ninguna aprobación institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) era necesaria para llevar a cabo los experimentos de embrión de pollo. Según las directrices locales, sólo los experimentos con embriones de pollo HH44 (18 días) y mayores requieren la aprobación del IACUC. Sin embargo, los embriones utilizados en este estudio estaban en etapas tempranas del desarrollo embrionario (es decir, HH19 (72 h)).

Nota: el propósito de este protocolo es proporcionar una descripción detallada del ensayo ChIP por lo que puede ser efectivamente combinado con qPCR o secuenciación de pró....

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Resultados

Para ilustrar el funcionamiento de nuestro protocolo de viruta, se realizaron experimentos utilizando secciones SNT agrupadas de embriones de pollo de HH19, las prominencias maxilares de HH22 pollo embriones y embriones de pollo HH3 etapa para investigar los perfiles de unión de ChIP-seq varias modificaciones de las histonas (es decir, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 y H3K27me3). Una vez que se obtuvieron ADNs de viruta, se evaluó la eficacia de la sonicación por electroforesis del .......

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Discusión

Epigenómica perfiles de modificación de las histonas con ChIP-seq pueden utilizarse para mejorar la anotación funcional de genomas vertebrados en diferentes contextos celulares^4,5,18. Estos perfiles epigenómica pueden utilizarse, entre otras cosas, para identificar elementos de reforzador, para definir el estado regulador de potenciadores (es decir, activo, preparado, o preparada) y definir los reguladores de identi.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSA powder	Carl Roth	3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Tris-HCL pH 8.0	Sigma Aldrich	T1503
NaCl	Carl Roth	3957.2
EDTA	Carl Roth	8043.2
EGTA	Carl Roth	3054.2
Na-Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-24
N-lauroylsarcosine	Sigma Aldrich	61743-25G
Hepes	Applichem	A3724,0250
LiCl	Carl Roth	3739.2
NP-40	Sigma Aldrich	I3021-100ml
SDS	Carl Roth	1833
Protein G/magnetic beads	Invitrogen	1004D
37% Formaldehyde	Sigma Aldrich	252549-1L
Glycine
RNase	Peqlab	12-RA-03
Proteinase K	Sigma Aldrich	46.35 E
Na-butyrate	Sigma Aldrich	SLB2659V
Proteinase inhibitor	Roche	5892791001
SYBRgreen Mix	biozym	617004
dH2O	Sigma Aldrich	W4502
1 Kb ladder	Thermofisher	SM1333
Orange G	Sigma Alrich	03756-25
Agarose	Invitrogen	16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100)	Roth	3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium)	Gibco	31331-028
Gel loading tips Multiflex	A.Hartenstein	GS21
qPCR Plates	Sarstedt	721,985,202
384 well	Sarstedt	721,985,202
1.5 mL tubes	Sarstedt	72,706
100 - 1,000 µL Filter tips	Sarstedt	70,762,211
2 - 20 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,213
2 - 200 µL Filter tips	Sarstedt	70,760,211
0.5 - 10 µL Filter tips	Sarstedt	701,116,210
H3K27me3 antibody	Active Motif	39155
H3K27ac antibody	Active Motif	39133
H3K4me3 antibody	Active Motif	39159
H3K4me2 antibody	Active Motif	39141
End Repair Mix	Illumina	FC-121-4001
Paramagnetic beads	Beckman Coulter	A63881
Resuspension buffer	Illumina	FC-121-4001
A-Tailing Mix	Illumina	FC-121-4001
Ligation Mix	Illumina	FC-121-4001
RNA Adapter Indexes	Illumina	RS-122-2101
Stop Ligation Buffer	Illumina	FC-121-4001
PCR Primer Cocktail	Illumina	FC-121-4001
Enhanced PCR Mix	Illumina	FC-121-4001
Genomic DNA ladder	Agilent	5067-5582
Elution Buffer	Agilent	19086
Sample Buffer	Agilent	5067-5582
Library Quantification Kit	Kapa Biosystems	KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs	LSL Rhein Main	KN: 15968
Needle (Neoject)	A.Hartenstein	10001
Syringe (Ecoject 10 mL)	Dispomed witt oHG	21010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Hermle	Z 216 MK
Thermoshaker	ITABIS	MKR13
Sonicator	Active Motive	EpiShear probe sonicator
Sonicator	Diagenode	Bioruptor Plus
Rotator	Stuart	SB3
Variable volume (5 –1,000 μL) pipettes	Eppendorf	N/A
Timer	Sigma	N/A
Magnetic holder	Thermo Fisher	DynaMag-2 12321D
Table spinner	Heathrow Scientific	Sprout
Mixer	LMS	VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler	Roche	Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler	Applied Biosystems	Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system	Agilent	Agilent 4200 TapeStation System
Forceps	Dumont	5-Inox-H
Perforated spoon	World precision instruments	501997