Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Resumen

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Resumen

Quimiotaxis es la migración a lo largo de un gradiente químico específico¹. Quimiocinas son citocinas quimiotácticas que promueven el tráfico celular con especificidad anatómica y temporal². Chemotaxis es una función crítica de los linfocitos y otras células inmunes que pueden ser cuantitativamente evaluaron in vitro. Este manuscrito describe métodos que permiten la evaluación de la quimiotaxis, en vitro y en vivo, para tipos de diversas células incluyendo líneas celulares y células nativas. El en vitro, formato basado en la placa permite la comparación de varias condiciones simultáneamente en tiempo real y puede terminar dentro de 1-4 h. In vitro ensayo condiciones pueden manipularse para introducir agonistas y antagonistas, como así como diferenciarse quimiotaxis chemokinesis, que es el movimiento al azar. En vivo tráfico evaluaciones, las células inmunes pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes múltiples y utilizan para la transferencia adoptiva. El etiquetado diferencial de células permite que las poblaciones de mezclado de la célula se introduce en el mismo animal, lo que disminuye la varianza y reducir el número de animales requeridos para un experimento estadístico adecuado. Migración en el tejido linfoide ocurre en tan poco como 1 h, y múltiples compartimentos de tejido pueden ser muestreados. Citometría de flujo después de la cosecha de tejido permite un análisis rápido y cuantitativo de los patrones migratorios de múltiples tipos de células.

Introducción

Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctico cofactor que acelera el quimiotactismo de las células T hacia C-C quimiocinas 19 y 21³. El propósito de los métodos descritos aquí son permitir evaluaciones cuantitativas de la Quimiotaxis de células inmunitarias en vitro y en vivo.

El análisis de la cámara de Boyden (migración celular e invasión) es un método rápido, barato y reproducible para evaluar la migración de la célula^4,5. En el ensayo estándar, la cámara superior es sembrada con células y está separada por una inserción porosa de una cámara inferior, en el cual las células migran. En el tiempo deseado, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción pueden ser fijo y manchadas para cuantificación por microscopia ligera. Sin embargo, estas mediciones restringen la recopilación de datos para un único punto de la final, que excluye la recolección de datos dinámica y pueden requerir extensa optimización para determinar el momento óptimo para el análisis. Aquí, se describen varias adaptaciones que permiten mediciones en tiempo real, cuantitativas y multiplexadas de quimiotaxis en vitro.

Estudios en vivo , se utiliza un punto funcional, es decir, la acumulación específica de células en un compartimento determinado tejido. Células de un donante previamente etiquetados se introducen animales receptores a través de transferencia adoptiva. Estas células del donante pueden identificarse posteriormente mediante citometría de flujo después de la cosecha de tejido receptor. También es una estrategia Co etiquetada que permite la determinación del tráfico de diferentes tipos de células dentro de un solo animal receptor. Este método elimina la variación entre animal de la inyección de células y representa la variabilidad entre animales fisiológica.

Protocolo

todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Rockefeller ' s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas.

1. quimiotaxis In Vitro

1. cultura THP-1 células ⁶ en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 4-(2-hidroxietil) -1- ácido-1-ácido (HEPES; 25 mM) (completar los medios), mantener la densidad entre 0.5-1.0 x 10 ⁶ células/mL.
2. Cultivo de células en un 35 mm plato, etiqueta 3.5 x 10 ⁵ THP-1 de células por condición con calceína acetoxymethyl (calceína-AM; 2.5 μm) u otro colorante fluorescente adecuado en medios completo a 37 ° C durante 30 minutos
   Nota: Tintes deben ser compatible con el etiquetado de células vivas y permeable a la membrana celular.
3. Pre-caliente un lector de placas a 37 ° C.
   Nota: Además del control de temperatura, funcionalidad de lectura de la parte inferior también es necesario. Ver paso 1.10.2 para una alternativa a un lector de placas para la cuantificación de la migración de las células.
4. Mientras que las células son etiquetas, preparar la placa de ensayo y la cámara baja. Placa de
   1. uso un cultivo de tejido de 24 pozos, con una condición por pozo. Realizar cada condición por triplicado.
   2. Añadir 750 μl de Hank ' s solución salina tamponada (HBSS) tamponado con 25 mM HEPES y 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) para la placa de 24 pocillos. Esto sirve como la condición basal de control.
      1. Uso otros pozos para las condiciones de comparación, manteniendo siempre el volumen total en la cámara inferior en 750 μl.
         Nota: En este ejemplo, humano monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) sirve como control positivo para quimiotaxis ⁷.
         1. Montar la mezcla de reactivo HBSS con 25 mM HEPES, BSA (0.1%) y MCP-1 (75 ng/mL). Utilizar suero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 como un control positivo adicional.
            Nota: Concentración de Chemokine y chemokine dependerá el eje quimiotáctico bajo estudio. Liofilizado de MCP-1 se resuspendió en agua destilada con BSA (0,1%) para hacer una solución con una concentración final de 50 μg/mL. Esto se puede diluir en agua a una solución de trabajo de 10 μg/mL. Añadir 5.6 μL de esta solución a la cámara baja.
   3. Una vez finalizada la composición de las cámaras inferiores, coloque una pieza porosa en cada pocillo, asegurando que alineen las lengüetas del inserto con las muescas de la placa.
      Nota: Elija el tamaño de poro adecuado para los insertos. Para monocitos y linfocitos, realiza bien un tamaño de poro de 3 μm. Algunos tipos de células o sistemas de chemokine pueden requerir una superficie revestida de matriz para la migración óptima. Por ejemplo, para la medición de la Quimiotaxis de monocitos THP-1 hacia la MCP-1, fibronectina o insertos recubiertos de colágeno se recomiendan. Para el lector de placas para la cuantificación, el inserto debe tener una capa luz impermeant, tales como tereftalato de polietileno, para evitar la detección de no-migrar las células en la parte superior del compartimiento ⁸.
5. Después de incubar las células por 30 min con calceína-AM, transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 minutos inspección visualmente las células para confirmar la absorción de calceína-AM ( figura 1).
6. Retire con cuidado el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío. Lavar las células etiquetadas en 1640 RPMI sin suero suplementado con HEPES 25 mM. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante.
Resuspender las células en suero RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM
7. . Contar las células y ajustar el volumen para que las células están en una concentración final de 1.0-1.5 x 10 ⁶ células/mL.
8. Suministrar 250 μL de la suspensión de células en el inserto (cámara alta).
9. Después de las cámaras superiores se han llenado, suavemente Levante la placa e inspección la parte inferior la presencia de burbujas de aire que pueden interferir con la detección y la migración. Para quitar una burbuja, primero prueba a quitar entonces reposicionar el inserto. Si no lo consigue, use una aguja de 27 G a pinchar la burbuja y luego vuelva a colocar el inserto.
10. Coloque la placa en el lector de la placa con 37 ° C.
    1. Adquirir lecturas de fluorescencia desde el fondo a intervalos de 1-3 min. Cuando se utiliza calceína-AM, establece la fluorescencia longitudes de onda de excitación y emisión a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Dependiendo del sistema de la tipo y quimioquinas de la célula, chemotaxis ocurre típicamente durante 1-4 h ( figura 2A).
    2. Como una alternativa a las mediciones continuas utilizando un lector de placas, imagen los pozos utilizando un microscopio fluorescente invertido ( figura 2B) capaz de excitación y detección de la luz a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Usar una ampliación baja para capturar a la mayoría de la parte inferior de la inserción. Cuantificar las células mediante el procesamiento de imágenes ImageJ o software similar ⁹.

2. La transferencia adoptiva de linfocitos murinos

1. preparación de células de donante
   1. Anesthetize semana 8-12-viejos ratones C57BL/6J donante masculino usando un vaporizador de la anestesia isoflurano (1-3%). Confirmar la adecuada profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca.
   2. Colocar el ratón en la posición supina. Haga una incisión de línea media con un bisturí y localizar el bazo en el espacio peritoneal izquierdo superior. Suprimir el bazo entero y coloque en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS y 25 mM HEPES; 1 bazo mL) en hielo. Eutanasia a animales anestesiados donantes por degollación.
   3. Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en medios completo (/spleen de 1 mL) con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a un tubo cónico de 15 mL.
   4. Añadir 4 volúmenes de cloruro de amonio lisis de potasio (ACK) de búfer e incubar 5 min a temperatura ambiente para lisar eritrocitos.
   5. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Si los eritrocitos permanecen en el sedimento, resuspender en tampón de lisis ACK, incubar 5 min a temperatura ambiente, centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descartar el sobrenadante.
   6. Resuspender las células en medios de comunicación completa en una concentración de 2-5 x 10 ⁷ células/mL, luego cuele la suspensión de células a través de una malla de nylon de 40 μm para eliminar restos de células.
   7. Etiqueta de 1 x 10 ⁷ ratón de células/receptor con un colorante fluorescente compatible con vive las células y que se mantendrá con fijación posterior, como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentración final 2 μM) ¹⁰ . Incubar a 37 ° C por 30 minutos
      Nota: Para el seguimiento de más de una población celular, utilizar otros tintes fluorescentes con poblaciones celulares adicionales. Visualizador, una porción de células del donante puede ser etiquetada con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoilo) amino) tetramethylrhodamine (concentración final 2 μM) ¹¹.
   8. 4 añadir volúmenes HBSS complementado con 25 mM HEPES, luego centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos y descartar sobrenadante. Resuspender el precipitado en HBSS suplementado con HEPES 25 mM para una concentración final de 1 x 10 ⁸ células/mL.
      1. Si utiliza más de un colorante fluorescente, mantener poblaciones celulares separadas hasta inmediatamente antes de la inyección.
      2. Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células de cada color en una solución fijadora (1 mL) para compensación de citometría de flujo posterior.
2. Transferencia de linfocitos
   1. anestesiar 8-12 semanas-ratones viejo receptoras de machos C57BL/6J con isoflurano (1-3%) usando un vaporizador; confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. Aplique ungüento veterinario animal ' ojos s para prevenir la resequedad.
   2. Brevemente las células donantes de vortex (1 s) y la transferencia a la jeringa de inyección de 1 mL 27 g, 0,5 en aguja, combinando poblaciones de células marcadas diferencialmente, en su caso.
      1. Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células mixtas con una solución fijadora (1 mL) para los análisis de citometría de flujo posterior.
   3. Lugar animales donadores en la posición propensa. Aplicar presión caudal suave sobre la piel dorsal a la vista, haciendo que el globo ocular sobresale un poco.
   4. Dirigir la aguja medialmente e inyectar 100 μl de suspensión de la célula donante retro-orbitally cada ratón receptor. Las células también pueden ser inyectadas a través de la vena de la cola.
   5. Poco a poco retirar la aguja de inyección y mouse solo en una jaula de recuperación. Animal del monitor hasta que ha recuperado la conciencia; una vez totalmente recuperado retorno del animal a la vivienda social.
3. Recogida y análisis de
   1. después de 1 h, anestesiar ratones receptores con anestesia isoflurano (1-3%) utilizando un vaporizador, confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. El bazo (u otro tejido de interés) de la cosecha (paso 2.1.2.) de cada lugar en medios completo (1 mL/destinatario) y ratón receptor. Eutanasia a animales anestesiados por degollación.
      Nota: Intervalos más largos antes de la cosecha de tejido aumentará la acumulación del tejido a través de al menos 24 h.
   2. Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en completa comunicación con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a tubo cónico de 15 mL.
   3. 4 añadir volúmenes de lisis ACK del almacenador intermediario e incuban 5 min a temperatura ambiente. Centrifugue la suspensión de células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
   4. Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de la tinción buffer (tampón fosfato salino suplementado con 1% FBS). Contar las células y ajustar a una concentración final de 3 x 10 ⁷ células/mL. Transferir 100 μl de la suspensión celular a un pozo 96 placa inferior redondo.
   5. Tinción de células para marcadores deseadas (véase tabla de materiales) para el análisis por citometría de flujo. Añadir anticuerpos conjugados fluoróforo (véase la tabla de materiales) contra los marcadores deseados e incubar a 4 ° C por 20 min en la oscuridad. Añada 100 μl tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.
   6. Resuspender el pellet en 200 μL tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.
   7. Resuspender el pellet en la tinción de 125 μl tampón y adquirir muestras utilizando un citómetro de flujo utilizando procedimientos estándar de.
      Nota: El tinte verde es excitado por un láser 488 y la emisión se detecta con los filtros dicroicos 505 y 530/30. El tinte anaranjado es excitado por un 561 nm y la emisión se detecta por un filtro dicroico 582/15.
      1. Uso salvo las células de 2.1.8.2 para compensar cada colorante fluorescente.
         Nota: Utilizando compensación de grano con fluoróforos que empareja la excitación y espectros de emisión de los tintes Etiquetadoras dará lugar a indemnización subóptima.
      2. Utilizar las células entradas guardadas desde el paso 2.2.2.1 para determinar con precisión la relación de marcado diferencialmente células de entrada si utiliza más de una población marcada ( figura 3). Calcular la migración específica de tejido basada en la relación de etiquetado a las células sin etiqueta ( figura 4).

Resultados

Cuando se usa tinte de calceína-AM, inspección visual de las células confirmará absorción de etiqueta (figura 1). Lecturas de fluorescentes automatizadas seguimiento migración como tránsito de las células en la parte inferior del parte movible en el tiempo. Estos datos muestran claramente una inducción de la migración celular hacia la MCP-1, así como un aumento de esta respuesta por el suero (figura 2A). Dependiendo de...

Discusión

Cuantificación de la migración de células inmunes puede lograrse usando simple y rápido de ensayos tanto in vitro como in vivo. Demostramos en vitro la Quimiotaxis de monocitos humanos en respuesta a un gradiente de MCP-1 y aumento por el suero. In vivo, esplenocitos murinos donantes fueron etiquetados diferencialmente y tras transferencia adoptiva, fueron recuperados de los animales receptores.

Usando un lector de placa tiene la ventaja de varios puntos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer