En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Resumen

El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.

Resumen

Las metodologías actuales para la matanza de específica de antígeno son limitadas para uso in vitro o utilizadas en modelos de enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe no un protocolo diseñado específicamente para medir el antígeno específico homicidio sin una infección. Este protocolo está diseñado y se describen métodos para superar estas limitaciones por lo que permite la detección de antígeno específico matando de una célula diana por CD8 células⁺ T en vivo. Esto se logra por la fusión de un modelo de vacunación con el objetivo marcado con CFSE tradicional matando a ensayo. Esta combinación permite al investigador evaluar el potencial CTL específica de antígeno directamente y rápidamente como el ensayo no es dependiente sobre el crecimiento del tumor o infección. Además, la lectura se basa en citometría de flujo y por lo tanto debe ser accesible a la mayoría de los investigadores. La principal limitación del estudio es identificar la línea de tiempo en vivo que sea apropiada a la hipótesis de ser probada. Variaciones en fuerza de antígeno y mutaciones en las células de T que pueden producir la función citolítica diferencial deben ser evaluados cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la cosecha celular y la evaluación. La concentración adecuada de péptidos para la vacunación ha sido optimizada para hgp100_25-33 y OVA_257-264, pero además se necesitarían validación de otros péptidos que pueden ser más apropiados para un determinado estudio. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

Introducción

Existen múltiples protocolos para evaluar el citolíticos (CTL) potencial de un CD8⁺ o CD4⁺ T-cell. Esta evaluación puede hacerse fácilmente en vitro en condiciones controladas^1,2,3. Además, modelos de enfermedades infecciosas, tales como LCMV, clásicamente han examinado la función CTL a través diferencialmente CFSE (-(and 6) 5-Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster) etiquetado como células diana donde la CFSE^hi-las células marcadas están pulsada con un péptido y CFSE^lo-destino etiquetado células quedan unpulsed. Las células son inyectadas en una proporción 1:1 y evaluó la pérdida de la CFSE^Hola-etiquetado objetivos pulsadas por citometría de flujo⁴. Vacuna y rechazo de modelos también han utilizado estrategias similares para la evaluación de en vivo de la matanza por ambos CD8⁺ y CD4⁺ T las células así como NK células^5,6. Esto es un ensayo potente, pero requiere el uso de agentes infecciosos y que prime el sistema inmunológico antes de la inyección de destino.

Este protocolo, por el contrario, requiere una infección previa del huésped y en su lugar utiliza una estrategia de vacunación para cebar el sistema inmunológico antes de la inyección de destino. Esta vacuna se compone de una formulación a base de agua de vacuna peptídica que requiere la provisión de un inmunoestimulador cóctel llamado covax⁷, que consiste en un peaje-como el receptor 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonística anticuerpo y la interleucina-2 (IL-2) a la combinación sinérgica de los agentes inmunoestimulantes para la obtención de péptidos específicos cebado y respuesta inmune robusta. Como tal, este ensayo proporciona una lectura rápida de la función CTL como la vacuna se administra junto con las células para la evaluación de la función de sólo tres días antes de la inyección de las células diana. Además, el cebado covax es lo suficientemente fuerte como para que la capacidad de matanza de la célula de T específicas de antígeno preparada puede verse entre 4 y 24 h después de la inyección.

La limitación principal de este protocolo es identificar la línea de tiempo en vivo para la detección de la matanza de destino apropiado para el antígeno y la hipótesis ensayada. Cuidadosa evaluación debe realizarse, como variaciones en la fuerza de antígeno así como alteraciones genéticas siendo probado en las células T podría resultar en función diferencial de CTL que requiera una detección de diferentes tiempos de asesinato de destino. Además, si bien la concentración adecuada de péptido de vacunación ha sido optimizada para el antígeno de melanoma humano glicopéptido 100 (hgp100_25-33) y ovoalbúmina_257-264 (OVA_257-264)^8,9 _, uso de otro modelo de antígeno que puede ser más apropiado para un determinado estudio requiere mayor validación. Debido a diferencias esperadas en la capacidad de los antígenos de un objetivo para estimular la función efectora CTL en combinación con el covax como coadyuvante, optimización de la frecuencia de dosis y concentración de dosis IL-2 puede ser esencial para lograr el objetivo deseado. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.

1. preparación de péptidos para la vacuna

1. Disolver el péptido liofilizado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración adecuada y el vortex durante 30 s.
   Nota: Para hgp100_25–33, la concentración final es de 1 mg/mL y para OVA_257–264, la concentración final es de 0,5 mg/mL. Reconstituir el péptido antes de la inyección. No guarde después de la reconstitución.

2. aislamiento de esplenocitos de ratón transgénico

Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.

1. Eutanasia el ratón transgénico de OT-1 utilizando el método de asfixia aprobado de CO₂ y extirpar el bazo.
   Nota: Ratón transgénico apropiado se utiliza en este paso específico para el péptido de elección.
   1. Coloque el ratón sobre su lado derecho. Rocíe el lado izquierdo del ratón con 70% de etanol (EtOH). Tire de la piel con unas pinzas y cortar la piel con tijeras quirúrgicas; el bazo será visible dentro de la cavidad peritoneal. Con cuidado corte la cavidad peritoneal para acceder al bazo. Extirpar el bazo con unas pinzas.
2. Separar el bazo colocando un filtro μm 70 en una placa Petri con medio de 2 mL A (PBS con 1% de suero bovino fetal (FBS)) y rotura del bazo con el extremo de un émbolo.
   1. Recoger los esplenocitos de la placa de Petri y el lugar en un tubo cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 5 mL de medio A dos veces a recoger todas las células. Añada medio un up a 25 mL y centrifugar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente a 475 x g.
3. Aspirar las células y resuspender en 1 mL / por tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) de bazo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos agregar 10 mL de medio A centrifugar a temperatura ambiente a x 475 g. Resuspender el precipitado en 10 mL de medio A y eliminar los desechos por la suspensión de células a través de un filtro de 70 μm en un limpio cónico de 50 mL de filtrado.
4. Contar celdas con azul de tripán y un hemocitómetro. Resuspender las células en PBS a una concentración final de 10⁶ - 100⁶ células/mL. Para OVA_257–264 específico matar, suspender 10⁶ células/ml y para hgp100_25–33 específico matar, resuspender en 100⁶ células/mL.
   1. Vuelta las células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en 15 mL PBS frío para lavar las células. Repetir una vez más la etapa de lavado. Vuelta las células a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender en PBS frío según volumen final determinado en el paso 2.4.
   2. Transferir la suspensión unicelular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y no en hielo hasta su inyección en el receptor del ratón C57/BL6.

3. inyección de esplenocitos de ratones transgénicos

1. Coloque el ratón C57/BL6 destinatario en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Administrar por vía intravenosa 100 μl de suspensión de célula (sección 2) en la vena de la cola utilizando una aguja de 27 G con el bisel hacia arriba.

4. Covax administración

Nota: Si las células se inyectan en la tarde, covax debe administrarse dentro de las 18 h de la inyección de células a la mañana siguiente.

1. Coloque el ratón en una caja claro la anestesia con isoflurano 1-3%. Después de ratones son completamente anestesiados, transferir los ratones a los conos de nariz conectados al colector de la cámara de anestesia. Mantener los ratones restringidos con el lado dorsal hacia arriba.
   Nota: Anestesia es confirmada por una pizca de breve del dedo del pie para comprobar que una respuesta de retirada no se produce. La ley federal restringe el uso de isoflurano del orden de un veterinario con licencia.
2. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. Inyectar 100 μl de solución de péptidos (de la sección 1) por vía subcutánea con una aguja de 27 G con la jeringa penetra 4-5 mm en la región base de la cola, la aguja bisel hacia arriba.
   Nota: Los ratones son vacunados en un costado con la inyección subcutánea en la base de la cola¹⁰.
3. Inyectar 100 lateral de μl anti-CD40 anticuerpo (valores de 0,5 mg/mL) para el sitio de la inyección de la vacuna.
4. Aplique cuidadosamente el imiquimod crema 50 mg/ratón en los sitios de vacunación. Frote la crema de imiquimod sobre la superficie hasta que la crema ya no es visible y es absorbida completamente.
5. Inyectar 100 μl de proteína de rhIL-2 de 100,000 UI/mL por vía intraperitoneal (i.p.) en la región abdominal inferior. Observar los ratones durante 5 minutos después de recuperarse totalmente de la anestesia.
   Nota: El experimento se pausa en este punto durante 3 días.

5. aislamiento de esplenocitos de destino para el etiquetado con CFSE

Nota: Aislamiento de células desde el bazo debe realizarse de forma estéril.

1. Eutanasia a los ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO₂ . Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.
2. Extraer células para contar utilizando un hemocitómetro y calcular para una concentración final de células a 10⁶ células/mL en solución de etiquetado CFSE (descrito en el paso 7). Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.

6. péptido pulsación de esplenocitos de destino

Nota: Péptido pulsación debe realizarse de forma estéril.

1. Resuspender las células en 10⁶ células/mL en medios de información (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)). Las células se dividen en 2 tubos (etiquetadores de 15 mL). Etiquetar cada tubo de pulsado o unpulsed.
2. Añadir péptido al tubo etiquetado pulsada. Para OVA_257–264 pulsación, añadir 1 μg/mL y hgp100_25–33 pulsación, añadir 2 μg/mL.
   Nota: Las células unpulsed se someten a la misma incubación como las células pulsadas sólo sin la adición del péptido.
   1. Incube las células + péptido a 37 ° C durante 1 hora.
3. Añadir 10 mL de medio completo (medios RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-glutamina (L-Gln), 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep)) a cada tubo para lavar tanto pulsada y unpulsed las células diana. Células restantes a temperatura ambiente durante 5 minutos a 475 x aspirar sobrenadante de g. de la vuelta.

7. preparación de la CFSE para el etiquetado de esplenocitos de destino

1. Preparar la solución de etiquetado CFSE durante la célula en paso 6.3; las células pulsadas serán marcadas como CFSE^Hola y el unpulsed como CFSE^lo. Preparar 1 mL de solución de etiquetado CFSE 10⁶ células.
   Nota: CFSE es sensible a la luz y debe protegerse de la luz en todo momento.
   1. Preparar CFSE^Hola -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución stock de 5 mM) para una concentración final de 5 μm/mL en Medio RPMI 1640 con un 2% FBS.
   2. Preparar CFSE^lo -etiquetado de los medios de comunicación mediante la adición de 1 uL/mL CFSE (solución 0.5m m) para una concentración final de 0,5 media de μm/mL RPMI 1640 con un 2% FBS.

8. etiquetado de esplenocitos de destino con CFSE

Nota: CFSE etiquetado debe realizarse de forma estéril.

1. Resuspender las células de la blanco pulsada y unpulsed (de paso 6.3) a 10⁶ células/mL etiquetado CFSE medios de comunicación. Resuspender las células pulsadas con preparados CFSE^Hola-etiquetado de los medios de comunicación y las células unpulsed con preparados CFSE^lo-etiquetado de los medios de comunicación.
2. Mezcle las células y medios etiquetado CFSE por inversión suave o remolinos. No mezclar con un vórtex. Incube las células y medios etiquetado CFSE a 37 ° C durante 15 minutos Remix las células cada 5 min.
3. Añadir 10 mL de medio completo a cada células de suspensión y giro de celular a temperatura ambiente durante 5 min a x 475 g.
4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS frío. Girar las células a 4 ° C por 5 min a x 475 g.
5. Repetir el punto 8.4.
6. Contar las células y la mezcla de péptidos-pulsada, CFSE^Hola-etiquetado con unpulsed, CFSE^lo-etiqueta las células en una proporción de 1:1 para su inyección en ratones receptores. Mantener una alícuota de 1 x 10⁶ mezclado las células a utilizar para una evaluación inicial de citometría de flujo (sección 11).
   Nota: El volumen de inyección final es 100 μl por ratón. El recuento final de la célula es 10e6 células. Pérdida de volumen en la jeringa y la aguja debe ser tomado en cuenta y debe ser estimada en 500 μl.

9. inyección de las células diana

Nota: Mantenga las células marcado con CFSE protegidas de la luz antes y durante la inyección lo más posible.

1. Coloque el receptoras ratones C57BL/6 en un limitador con el lado dorsal hacia arriba. Rocíe el área base de la cola de inyección con alcohol isopropílico al 70%. 100 μl de suspensión celular solo administrar por vía intravenosa en la vena de la cola con el bisel hacia arriba.

10. su aislamiento de las células diana

Nota: El momento de este paso es crítico y depende de la fuerza del antígeno para la estimulación y la citotoxicidad CTL. Para la evaluación de matar a un objetivo pulsado OVA_257–264 , las células necesitan ser cosechado 4-6 h después de la inyección. Ya que células marcado con CFSE bazos sensibles, proceso luz en la oscuridad.

1. Eutanasia el receptoras ratones C57BL/6 según el método de asfixia aprobado de CO₂ .
2. Retire el spleen(s) como en el paso 2.1.1. Desagregación del bazo y lavar esplenocitos como en los pasos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse células de sangre rojas como en los pasos 2,3 - 2.3.2.
3. Resuspender las células en células de fluorescencia activada 1 mL buffer (FACs) (1% BSA + PBS) de clasificación para la evaluación por citometría de flujo.

11. compuerta lógica para determinar la actividad CTL por citometría de flujo

1. Realizar evaluación de la actividad CTL utilizando un protocolo de citometría de flujo estándar. Adquirir las células mediante el canal FITC en un citómetro de flujo con láser 488 nm para la excitación¹¹.
   1. Puerta en linfocitos vivo usando los parámetros de dispersión (SSC) lado de forward scatter (FSC) vs. Subgate dentro de la puerta en linfocitos de la población total de CFSE-positivo.
      Nota: Las células inyectadas CFSE-labeled formarán un pequeño subconjunto de los linfocitos totales presentes en el bazo. Las células positivas de CSFE deben aparecer como dos poblaciones distintas en la escala log.
   2. Utilice un formato de histograma para determinar el porcentaje de la unpulsed (izquierda pico, CFSE^lo) y pulsada (razón pico, CFSE^Hola) poblaciones. Pérdida de las células CFSE^Hola indica actividad CTL antígeno-específica.

Resultados

Antes de la inyección de las células diana marcada con CFSE, corre a la mezcla 1:1 células en un citómetro de flujo para determinar las frecuencias de línea de base del CFSE^Hola y CFSE^lo las células diana. Figura 1 A muestra la estrategia bloquea para detectar cambios en las poblaciones de la CFSE, una puerta inicial está hecha usando parámetros de FSC y SSC. Las células positivas de CFSE total entonces se subga...

Discusión

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben realizarse con cuidado. El cebado covax después de la inyección de la célula de T específicas de antígeno sometido a prueba es necesario ver todo asesinato de objetivos pulsados. Aunque es posible que la vacunación a base de agua covax crea una condición inflamatoria aguda, para la fase inflamatoria crónica, cambiar la formulación a base de agua de breve duración con un enfoque de base de aceite de liberación lenta del antígeno puede pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice	Charles River	027	C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice	Jackson Labs	003831
hgp10025–33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257–264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
Imiquimod cream 5%	Fougera	51672-4145-6	Aldara Cream
CD40-specific mAb	BioXcell	BE0016-2	clone FGK4.5
rhIL-2 protein	Hoffman LaRoche Inc	136	Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	Phosphate Buffered Saline
FBS	Life Technologies	26140-079	fetal bovine serum
RBC lysis buffer	Life Technologies	A10492-01	red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
L-Glutamine	Life Technologies	25030081
Pen/Strep	Life Technologies	15140122	penicillin/streptomycin
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
1.5 mL MCT graduated natural	Fisher	05-408-129	microcentrifuge tube
70% ethanol	Fisher	BP8201500	EtOH
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061
Hemocytometer	Fisher	267110
27 gauge needle	BD	305109
1 mL syringe	BD	309659