G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Resumen

Describimos una técnica para combinar la citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento para identificar regiones finales replicación del genoma.

Resumen

Numerosas técnicas se han desarrollado para seguir el progreso de la replicación del ADN a través de la fase S del ciclo celular. La mayoría de estas técnicas se han dirigido hacia la aclaración de la ubicación y el momento de inicio de la duplicación del genoma en lugar de su realización. Sin embargo, es fundamental que entendemos regiones del genoma que son última completar la replicación, porque estas regiones sufren niveles elevados de rotura cromosómica y mutación, y han sido asociados con la enfermedad y el envejecimiento. Aquí describimos cómo hemos ampliado una técnica que se ha utilizado para vigilar la iniciación de la replicación en cambio identificar las regiones del genoma última replicación completa. Este enfoque se basa en una combinación de citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento. Aunque este informe se centra en la aplicación de esta técnica a la levadura, el enfoque puede utilizarse con cualquier célula que se puede ordenar en un citómetro de flujo según el contenido de ADN.

Introducción

Replicación del genoma eucariota se inicia en múltiples sitios discretos, llamados origen de replicación, de que la replicación horquillas proceden en ambas direcciones (revisados en Fragkos et al., 2015¹). Orígenes varían en su tiempo y eficiencia de la cocción, y se han desarrollado varias técnicas para supervisar la actividad de origen de replicación y aclarar las causas de esta variación. De niveles de single-stranded DNA², que se forma alrededor de origen activo, puede inferirse la actividad de orígenes individuales o mediante el uso de electroforesis en 2D para supervisar la replicación específica intermedios³, que pueden ser detectadas con sondas radiactivas. Ambas de estas técnicas se aplican más fácilmente en S. cerevisiae que en células de mamífero, porque orígenes se limitan a secuencias específicas conocidas en la antigua. Con el advenimiento de los microarrays, llegó a ser posible evaluar origen disparando a nivel mundial. Esto fue hecho primero por etiquetado ADN con isótopos pesados, liberación de las células de un bloque de G1 en medio que contiene isótopos ligeros y monitoreo luego de la formación de pesados ligeros híbridos ADN en el genoma⁴. La introducción de secuenciación de alto rendimiento permitido genoma similares monitoreo de la actividad de origen sin el requisito de etiquetado isotópico caro. Las células fueron clasificadas en un citómetro de flujo según el contenido de ADN y su ADN sometido a secuenciación profunda. Porque la cobertura de secuencia procede de 1 x a 2 x en el transcurso de la fase S, sincronización de replicación relativa puede evaluarse comparando profundidades lecturas de células en fase S que en G1 o G2^5,6. Estas técnicas, aplicadas particularmente a levadura, condujeron a una comprensión más profunda de cómo proteínas de replicación de ADN, secuencia de la DNA y estructura de la cromatina regulan eficiencia y tiempo de origen.

La transmisión fiel de la información genética durante la proliferación celular requiere no sólo exitosa iniciación de la replicación del ADN, que ocurre en el origen, pero también superación de replicación, que ocurre el encuentro de las horquillas de replicación. Como iniciación de la replicación, el momento de la terminación de la replicación varía a lo largo del genoma con ciertas regiones restantes sin replicar hasta tarde en el ciclo celular. Tales regiones pueden ser particularmente distantes de orígenes de replicación activa o pueden contener secuencias o estructuras de cromatina que impiden polimerasas de la DNA. Tarde replicar las regiones puede manifestarse como sitios frágiles, que se asocian a fractura cromosómica y mayores tasas de mutación y se han implicado en cáncer y envejecimiento^7,8,9. Sin embargo, a pesar de la importancia de la correcta terminación de la replicación del ADN en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, nuestra comprensión de dónde y cómo esto ocurre ha retrasado lejos detrás de la iniciación de la replicación. Y mientras que los genes individuales cuya replicación tardía se ha asociado con la enfermedad han sido estudiados con, por ejemplo, qPCR¹⁰, globales estudios dirigidos a dilucidar las localizaciones y causas de la última replicación han faltado subyacentes. Aquí describimos una técnica que nos referimos a como "G2 seq" en el que combinamos la citometría de flujo con secuenciación de alto rendimiento para arrojar luz sobre la terminación de la replicación del genoma de la levadura¹¹. Con pequeñas modificaciones, este protocolo puede ser adaptado a cualquier célula que puede ser flujo y ordenada según el contenido de ADN.

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Protocolo

1. preparación de células de flujo Cytometry clasificación

1. Inocular tubos de ensayo de 15 mL que contiene 8 mL de caldo YEPD tal que los cultivos alcanzan una densidad de 5 x 10⁶ a 1.5 x 10⁷ células por mL después de crecimiento durante la noche (véase la discusión Nota 1).
2. Desactivación de las células de levadura (1.400 x g, a temperatura ambiente o 4 ° C) en un tubo de centrífuga de 15 mL tapón durante 5 min, resuspender las células en etanol al de 70% 1.5 mL y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga 1.6 mL, dejando este sit 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 3 h de hielo ( se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C) (véase punto de discusión (2)).
3. Desactivación de las células de levadura en la microcentrífuga (14.000 x g, 4 ° C) durante 1 minuto, resuspender en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2, giro (14.000 x g, 4 ° C) durante 1 minuto, aspirar el sobrenadante, resuspender en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2 , que contiene 0.25 mg/mL solución de Rnasa por 1 h a 50 ° C o durante la noche a 37 ° C en baño de agua o bloque de calor.
4. Añadir 50 μl proteinasa K solución (20 mg/mL resuspendió en 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl₂, peso de 50% de glicerol de volumen) e incubar 1 h a 50 ° C.
5. Desactivación de las células (14.000 x g, 4 º C), resuspender las células en 1 mL citrato de sodio 50 mM, pH 7.2, desactivación (14.000 x g, 4 º C), aspirar el sobrenadante con vacío, resuspender en 1 mL 1 μm ácido nucleico verde tensión resuspendió en citrato de sodio 50 mM , pH 7.2 e incubar en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente, someter a ultrasonidos 2 x 2 s cada (2 vatios de potencia de salida).

2. celda de clasificación

1. Utilizando un clasificador de celda, ordenar las células según el contenido de ADN en las fases G1, S, "primera G2" y "G2 tardía", que recoge al menos 1,6 millones células haploides de cada fase del ciclo celular como en la figura 1 (véase punto de discusión (3)).
2. Células de transferencia a tubos de microcentrífuga y desactivación de las células durante 20 min a 14.000 xg a 4 ° C en la microcentrífuga y aspirar sobrenadante con vacío (la pelotilla puede guardarse congelada a-20 ° C por tiempo indefinido; véase el punto (4)).

3. DNA extracción y la preparación de la secuenciación de las bibliotecas

Nota: Los pasos siguientes se basan en "Protocolo" en la extracción de ADN genómico de levadura Kit (véase Tabla de materiales).

1. Añadir 120 μl de "Tampón de digestión", un tampón patentado que permite enzimas líticas levadura y digerir la pared celular y 5 μl de enzima lítica de la levadura, agite con un vórtex, incubar a 37 ° C durante 40-60 min.
2. Añadir 120 μl de tampón de lisis del"," un propiedad tampón que contiene detergente y vórtice dura de 10-20 s.
3. Añadir cloroformo μl 250 - mezclar bien durante 1 minuto.
4. Girar a la velocidad máxima en una microcentrífuga durante 2 minutos.
5. Cargar el sobrenadante a la columna de unión de ADN y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga durante 1 minuto.
6. Añadir 300 μL de "ADN lavado Tampón", un tampón patentado que contiene etanol y centrifugue durante 1 min a velocidad máxima en una microcentrífuga. Deseche el flujo a través, añadir 300 μL de tampón de lavado de ADN y repita el proceso de lavado.
7. Transferir la columna spin a un tubo de microcentrífuga fresco, añadir 60 μL de agua (no TE) - esperar 1-3 minutos y luego centrifugar durante 10 s a fin de eluir el ADN.
8. Medir la concentración al añadir 5 μl de ADN a 195 μl del reactivo de alta sensibilidad de dsDNA que ha sido diluido 1: 200 en buffer de alta sensibilidad de dsDNA y luego medir la fluorescencia en un fluorómetro, con 10 μl de estándares suministrados para la calibración; esperar entre 10 y 50 ng de rendimiento total de ADN.
9. Someter a ultrasonidos (pico incidente energía 450, Factor de servicio 30%, ciclos por estallar 200, tratamiento tiempo 60 s, 6 de nivel de agua) para romper el ADN en fragmentos de 250-350 bp.
10. Preparar una biblioteca utilizando el kit de preparación de muestras de ADN y secuenciarlo (lecturas del solo-fin de bp 50 por lo menos 10 millones) en el instrumento de la secuencia de DNA en modo rápido (ver nota de discusión (5)).

4. Análisis de la secuencia de datos y generación de replicación de perfiles

1. Alinear secuencias de genoma de sacCer3 de Saccharomyces cerevisiae con Gsnap¹² (ver nota de discusión (6)).
2. Determinar por la base par Lee profundidades utilizando "genomeCoverageBed" software^{13 de Bedtools}.
3. Quitar puntas artefactuales en profundidades de lectura, si está presente (ver nota de discusión (7)).
4. Lisa Lee profundidades por cromosoma usando medias en una kb 20 corredera ventana mediante la función "runMean" en R paquete "caTools" (ver nota de discusión (8)).
5. Parcela Lee profundidades en fase S, G2 temprana y tardío G2 como un porcentaje de profundidad leer completamente replicado (ver nota de discusión (9)).

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Resultados

Hemos utilizado el procedimiento descrito anteriormente para identificar sitios de replicación tardíos en levadura de florecimiento. Prueba este planteamiento con una región de replicación finales conocida en un cromosoma artificial demostró la técnica exacta y fiable. Nuestros resultados también han demostrado la importancia biológica de la oportuna terminación de la replicación, mostrando que una región replicación tardía en el cromosoma 7, que identificamos como replicaci?...

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Discusión

Mientras que esta técnica es robusta y relativamente directo, una atención especial debería destinarse a los siguientes:

(1) recomendamos que las culturas crecen durante al menos 12 h antes de llegar a la fase de registro, ya que las diferencias se manifiestan en ciclo celular distribuciones si las culturas son cosechadas después de haber alcanzado la densidad deseada a 4 h después de la inoculación. Nuestra hipótesis es que una distribución de ciclo celular que ha alcanzado un equilib...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomic DNA kit	Genesee Scientific	11-323
1 µM SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2
50 mM sodium citrate, pH 7.2
RNase solution (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20°
proteinase K solution (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III columns	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrument	Illumina	SY–401–2501
gsnap alignment software	open source software / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap