Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Resumen

En este estudio, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar la interrupción de la barrera sangre - cerebro en enfermedades neurodegenerativas. Para lograr nuestro objetivo, nos infunde isotiocianato de fluoresceína de alto peso molecular etiquetado (FITC)-albúmina en yugular de ratón de la vena y evaluado su salida en el parénquima cerebral por microscopía de fluorescencia.

Resumen

La interrupción de la integridad de la barrera blood - brain (BBB) es una característica común de distintas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Aunque la interacción entre homeostasis perturbada de BBB y la patogenia de los trastornos cerebrales necesita mayor investigación, el desarrollo y validación de un procedimiento confiable para detectar con precisión alteraciones BBB pueden ser crucial y representan una herramienta útil para predecir la enfermedad potencialmente la progresión y desarrollo habían concentrado en estrategias terapéuticas.

Aquí, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar salida BBB en una condición neurodegenerative como eso que ocurre en un modelo de ratón preclínica de la enfermedad de Huntington, en el que son claramente detectables precozmente en defectos en la permeabilidad de BBB la enfermedad. En concreto, el alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína etiquetado (FITC)-albúmina, que es capaz de cruzar el BBB solamente cuando éste se deteriora, es agudo infundida en la vena yugular de un ratón y su distribución en los distritos vasculares o parenquimatosos se determina por microscopía de fluorescencia.

Acumulación de verde fluorescente-albúmina en el parénquima del cerebro funciona como un índice de permeabilidad BBB aberrante y, cuando se cuantificaron utilizando software de procesamiento de imagen J, se divulga como intensidad de la fluorescencia verde.

Introducción

Homeostasis en el sistema nervioso central (SNC) es un prerrequisito para la comunicación adecuada y la función de las células neuronales. El parénquima de la CNS está cerrado de la periferia por la endotelial barrera blood - brain (BBB), que representa la interfaz entre el cerebro y la circulación sanguínea periférica y desempeña un papel crucial en las conversaciones entre estos dos barrios^{1 ,2}. El BBB es un complejo y dinámica de la estructura tridimensional se compone principalmente de micro vasos endoteliales células especializadas (ECs) enlazadas entre sí mediante complejos de Unión intercelulares - ensambladuras apretadas (TJs) - y rodeado del pericitos, neurona terminaciones y astrositos pie procesos^1,2.

En condiciones fisiológicas, la permeabilidad extremadamente baja de la BBB intacto garantiza la estricta regulación del transporte de nutrientes y otras moléculas entran y salen del cerebro y ofrece una protección única de los cambios que ocurren en el SNC la composición de la sangre que podría influir en la actividad de los nervios y contra potencial periférico insulta a^1,2,3.

Interrupción de la integridad de la BBB y su mayor permeabilidad ha sido conocida para constituir una característica clave para muchos neurológicas y neurodegenerativas trastornos⁴ incluyendo la enfermedad de Huntington (HD)^5,6, sin embargo , si esta disfunción es un fenómeno causal o un evento propagativo en el curso de la enfermedad es todavía confuso. El tiempo de ruptura BBB también sigue siendo evasivo, sin embargo, nuevas pruebas por nuestro grupo y otros indican que la alteración integridad BBB no representa un evento tardío en la progresión de la enfermedad, sino más bien un primer paso^{6,7 , 8}, que puede tener consecuencias a largo plazo.

Con esto en mente, es importante revelar precozmente descomposición BBB en la neurodegeneración para desarrollar estrategias útiles para predecir la progresión de la enfermedad y daño cerebral y para desarrollar con éxito las intervenciones alternativas y más específicas capaces de mitigación de las consecuencias clínicas de tal interrupción. Imagen fiable de la debilitación de la BBB es, por tanto, de gran importancia en la investigación experimental y manejo clínico de enfermedades del cerebro.

En este artículo describimos un procedimiento exitoso y simple para la evaluación de la permeabilidad BBB en un modelo de ratón de HD usando el alto peso molecular fluoresceína isotiocianato etiquetados-albúmina (albúmina de FITC). Extravasación de albúmina FITC, que normalmente no puede cruzar la barrera, en el parénquima cerebral se midió como un índice de fuga BBB. Esta técnica es fácilmente adaptable a las ratas y a otras condiciones patológicas caracterizadas por cerebrovasculature deterioro^9,10.

Protocolo

todos los procedimientos en animales fueron aprobados por la Junta de revisión cuidado de IRCCS Neuromed Animal y por " Istituto Superiore di Sanità " (número de permiso: 1163/2015-PR) y estaban de acuerdo con las directrices de la UE Directiva 2010 / 63/EU para los experimentos con animales.

1. preparación de FITC-albúmina solución para ser inyectada en la vena yugular

Nota: todos los experimentos eran llevado en manifiesto ratones de EH de R6/2 (11 - semanas de edad) y en edad y sexo-emparejado el salvaje-tipo (peso) control hermanos de camada.

1. Disolver FITC-albúmina en polvo (véase Tabla de materiales) en tampón fosfato salino (PBS) 10 mg/ml.
   Nota: Para obtener resultados óptimos, esto debe estar preparado fresco para cada reacción etiquetado.

2. Preparación de los equipos a ser utilizados durante la cirugía

1. disponer los instrumentos quirúrgicos previamente esterilizados (véase Tabla de materiales).
2. Limpiar el Banco quirúrgico con alcohol (solución de etanol 70%). Preparar la zona quirúrgica (45 cm x 45 cm) con un paño de toalla desechable estéril quirúrgica y establecer el funcionamiento Estereomicroscopio.

3. Procedimiento quirúrgico para FITC-albúmina perfusión en la vena yugular

1. registrar el peso corporal de ratón para la anestesia.
2. Ratón de Anesthetize con una inyección intraperitoneal (i.p) de una dosis adecuada de ketamina (100 mg/kg) - solución de xilacina (10 mg/kg).
3. Monitor animal sedación por pellizco suave del dedo del pie retiro reflejo de Walantus et al. ^{11 , 12}.
4. Coloque el ratón anestesiado en posición supina boca arriba y fije las cuatro patas y la cola en el Banco de trabajo quirúrgico con cinta adhesiva.
5. Después de que el ratón está asegurado, cuidadosamente afeitado el adecuado margen quirúrgico en el cuello con una afeitadora eléctrica (véase Tabla de materiales) y desinfectar con povidona yodada solución y 70% etanol.
6. Seco la superficie expuesta del afeitado con bastoncillos de algodón.
7. Suavemente tire hacia arriba la piel afeitada y hacer una incisión de 1.5 cm largo longitudinal, por bisturí en el midclavicular line empezando a mitad de camino en el tórax y que se extiende justo debajo de la nuca.
8. Cuidadosamente estirar aparte del tejido conectivo con fórceps bajo observación microscópica (5 aumentos) para exponer la vena yugular externa.
9. Asegurar un espacio suficiente a la derecha y la izquierda de la vena yugular para facilitar la inserción de la aguja de 30½ G de la infusión de la solución de albúmina de FITC.
10. Inyectar el animal por vía intravenosa (derecha vena yugular) lentamente (más de 3 minutos) con 100 μl de 10 mL/kg FITC-albúmina utilizando la aguja de 30½ G.
11. Después de 15 minutos, eutanasia el ratón por decapitación, rápidamente Retire el cerebro del cráneo como se describió anteriormente ¹³ y sumergirlo durante 15 min en al menos 10 veces el volumen del cerebro sí mismo de isopentano enfriado previamente.
12. Mover el isopentano congelado el cerebro en un tubo previamente enfriado y almacenar en un congelador de-80 ° C hasta secciones histológicas.

4. Histológica de seccionamiento de cerebro impregnado de FITC-albúmina

1. Embed congelado compuesto cerebro en temperatura óptima de corte (OCT) (véase Tabla de materiales) antes de secciones de criostato.
2. Serie cortado el cerebro en secciones gruesas de 20 μm, con un criostato (véase Tabla de materiales) y montar sobre portaobjetos de cristal.
3. Realizar el FITC-albúmina/laminina Co manchas usando un específico del anticuerpo anti-laminina (véase tabla de materiales) como describió anteriormente ⁶.
   1. Brevemente, incubar las secciones con el anticuerpo primario anti-laminina (pAb 1: 1000) durante la noche y proceder a su correspondiente anticuerpo secundario conjugado con Cy3.
   2. Cubreobjetos portaobjetos con medio de montaje que contiene 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (pico de absorción = 360 nm, pico de emisión = 460 nm (véase Tabla de materiales).
   3. Deja la diapositiva seca durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.
   4. Observar la fluorescencia coloración bajo un microscopio de fluorescencia (véase Tabla de materiales) con 20 aumentos equipado con ambos FITC (pico de absorción = 495 nm, pico de emisión = 525 nm) y filtros Cy3 (pico de absorción = 550 nm; emisión pico = 570 nm).
      1. Para ver las muestras inmediatamente después de la tinción, asegure el cubreobjetos en las esquinas usando esmalte de uñas y examinarlas bajo el microscopio como arriba (4.3.3).

5. Ajuste hasta el microscopio de fluorescencia y adquisición de imágenes de color

1. configurar el microscopio de fluorescencia así.
   1. Encender la lámpara de fluorescencia unos 10 minutos antes de su uso. Encienda el microscopio, la computadora conectada y la cámara digital. Ejecutar el software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales).
   2. El objetivo apropiado para colección óptima de la señal y resolución espacial y seleccionar los filtros adecuados.
2. Adquisición de imágenes de color
   1. Seleccione el comando [en vivo] en el software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales) y configurar los parámetros de iluminación óptimo para cada filtro.
   2. Seleccione el comando [freeze] para tomar la imagen de color de canal individual y añadir la barra de escala (' editar > escala de quemar ')
   3. Guardar cada imagen en el ' .tiff ' formato de.
   4. Combinar canales en una sola imagen al seleccionar ' archivo > canal de fusión ' y guardarlo en el
   5. tiff ' formato de.
   6. Adquirir un mínimo de cuatro veinticuatro bits color fotos (2200 μm x 3400 μm) por rebanada del cerebro (6 secciones por diapositiva).

6. Evaluación de la extravasación de albúmina FITC

1. analizar la intensidad de fluorescencia para cada canal individual mediante el libremente disponible ImageJ ^{14 , 15}.
2. Normalizar la intensidad total de la señal fluorescente de la FITC-albúmina por la total intensidad fluorescente CY3-laminina por cada imagen y reportar la albúmina extravasada fuera de los vasos como la intensidad de la fluorescencia verde.

Resultados

Infusión adecuada de FITC-albúmina en los resultados de la vena yugular en la extravasación del trazador fluorescencia verde de la circulación sanguínea en el cerebro parenchymawhen que la BBB es peligro⁶. En condiciones fisiológicas, distribución de la albúmina infundida de fluorescente está restringido al interior de los vasos del cerebro y no hay señal en el parénquima perivascular alrededor de área o cerebro es detectable (figur...

Discusión

La técnica que Describimos aquí es principalmente útil para la detección de fugas BBB en condiciones de enfermedad cerebral. Disfunción BBB está ganando atención como una característica común de diversos trastornos neurológicos⁴. Anteriormente se utilizó este enfoque para describir el derangement principios de integridad BBB en un modelo de ratón de una enfermedad neurodegenerativa rara como HD⁶.

Este método toma ventaja de la relati...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate	SIGMA	A9771-100MG
pAb anti-Laminin	Novus Biologicals	NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat	MILLIPORE	AP132
SUPERFROST PLUS	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm	Thermo Scientific (DIAPATH)	61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound	Bio Optica	05-9801
VECTASHIELD Mounting Media	VECTOR	H-1500	Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe	RAYS Health & Safety	INS1ML26G13
30G 1/2"	BD Microlance	304000	Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle	F.S.T.	91003-12
#22 Disposable Scalpel blads	F.S.T.	10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm	F.S.T.	14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm	F.S.T.	11251-35
Graefe Forceps 10 cm	F.S.T.	11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm	F.S.T.	11251-20
Medical patch	Medicalis	34788
Sterile disposable towel drape	Dispotech	TVO50VE
Stereoscopic Microscope	NIKON	SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)	NIKON	1003167	Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	932162	Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera	Nikon	DS-Ri2	Microscope camera
Intenslight	Nikon	C-HGFI	Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit	Nikon	AR 4.40.00	Analysis Software
Electric Razor	Gemei	GM-3007