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Resumen

Este protocolo describe una técnica que se utiliza para modelar la infección del virus Zika del cerebro humano en desarrollo. Wildtype o líneas de células madre diseñadas, los investigadores pueden utilizar esta técnica para descubrir los diferentes mecanismos o tratamientos que puedan afectar principios infección cerebral y microcefalia resultante en embriones infectados por el virus Zika.

Resumen

La reciente aparición del virus Zika (ZIKV) en poblaciones susceptibles ha llevado a un aumento abrupto de microcefalia y otras afecciones del neurodesarrollo en recién nacidos. Mientras que los mosquitos son la principal vía de transmisión viral, también se ha demostrado a través de contacto sexual y transmisión vertical de madre a feto. En este último caso de transmisión, por el tropismo viral único de ZIKV, el virus se cree que predominantemente objetivo las células progenitoras neurales (PNJ) del cerebro en desarrollo.

Aquí un método para modelar ZIKV infección y la microcefalia resultante, se producen cuando organitas cerebrales humanas están expuestos a vivir ZIKV se describe. Los organoides Mostrar altos niveles de virus dentro de su población de progenitoras neurales y presentan muerte celular severa y microcefalia en el tiempo. Este modelo de organoide cerebral tridimensional permite a los investigadores para llevar a cabo experimentos de especies comparable para observar e intervenir potencialmente con infección por ZIKV del cerebro humano en desarrollo. El modelo proporciona mayor relevancia a través de métodos estándar de dos dimensiones y contiene arquitectura celular específico de humanos y expresión de la proteína que no es posible en modelos animales.

Introducción

Zika virus (ZIKV) rápidamente se ha extendido en Micronesia, Polinesia y América y recientemente se ha demostrado para cruzar la barrera placentaria1,2 para infectar el cerebro fetal en desarrollo, conduce a enfermedades del neurodesarrollo tales como microcefalia3,4,5,6 . El impacto a largo plazo en la vida de estos pacientes y la falta de tratamiento, ha llevado a los investigadores y los clínicos codificar para una mejor comprensión de los mecanismos detrás de ZIKV infección y replicación. Estudios previos han examinado la infección ZIKV de sistemas in vitro en una variedad de tipos de células fisiológicamente relevante7,8,9, así como en vivo10 con inmunocompetentes e immunocompromised ratones11,12,13 y primates no humanos14,15,16. Además de estas técnicas más convencionales, varios grupos han implementado organitas cerebral derivados de células madre para entender más sobre infección por ZIKV del cerebro humano en desarrollo. Estos grupos han utilizado humanos organitas cerebral para confirmar la microcefalia fenotipo17,18, receptores relacionados a virus entrada19de investigar, examinar respuestas fisiológicas a la infección20 , 21y potencialmente pantalla para candidatos de drogas22. Aquí se describe una técnica para producir rápidamente e infectando organitas cerebral derivado de células madre, como se mostró anteriormente19, para mejorar la comprensión de la infección por ZIKV del cerebro humano en desarrollo.

Puesto que los organoides se forman de culturas (PSC) de la célula de vástago de pluripotent estándar, esta técnica permite para una variedad de cuestiones científicas para ser contestadas con respecto a la infección viral del cerebro en desarrollo. Por ejemplo, ingeniería CRISPR puede usarse para modificar estas líneas PSC antes de organoide infección en un ritmo más rápido que la mayoría en vivo genética estudios19. Además, a diferencia de en dos culturas de diferenciación (2D) dimensional estándar, organitas exhiben la compleja arquitectura celular que es crítica para corticogenesis, y estudios recientes han demostrado que esta arquitectura puede interrumpirse con infección 21. Por último, el relativamente bajo costo de generar organitas permite mayor rendimiento experimentación y proyección en comparación con modelos en vivo . Por otra parte, hay algunas desventajas para la utilización de organoides estudiar ZIKV. Organoides son más biológicamente relevantes que culturas 2D, hay retos adicionales en la evaluación de los organoides debido a su naturaleza (3D) tridimensional. La proyección de imagen y disociación de los organoides tiende a involucrar a más equipos y una mayor inversión de recursos que en las culturas 2D estándar. Además, carecen de organoides la vasculatura y los componentes inmunológicos que están presentes en los modelos en vivo , así que los investigadores interesados en los aspectos de la infección viral se recomienda buscar un protocolo alternativo.

Hay una serie de técnicas para la formación de humanos organoides y neuroesferas en cultivo, y por lo general caen dentro de las categorías estampado o liso . Métodos de modelado implementan factores para regular la Wnt, BMP, TGFβ y otras vías de señalización para impulsar la diferenciación hacia linajes específicos23. Anula los métodos, como el descrito aquí, se aprovechan de la propensión de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) y células de madre embrionarias humanas (hESCs) para diferenciar hacia un linaje neuroectodérmico por defecto24. Después de aproximadamente tres semanas de la diferenciación, los organoides que consisten en grandes, estructuras neuroepiteliales de biomiméticos que contienen varios tipos de células que se observan en el cerebro en desarrollo temprano.

La técnica para producir organoides de culturas PSC estándar, alimentador-libre y que infecta estos organoides con ZIKV se presenta en su totalidad. Para orientación sobre los métodos de cultivo necesario para alimentador-libre PSCs, consulte métodos anteriores publicaciones de25,26. Además, para aplicar cantidades constantes de virus para experimentos múltiples, es importante calcular el MOI antes de tiempo. Esto se hace mediante la realización de una infección de las células Vero, seguido por tratamiento con medio de recubrimiento, incubación y el immunostaining. Las descripciones y los métodos de esta técnica han sido previamente descritos19,27.

Una vez que la cultura PSC alcanza la confluencia de objetivo de 50-70%, las células son entonces disociadas y agregación en placas de 96 pocillos de fijación ultra baja. Las células son mantenidas durante 3 días en medios de mantenimiento de celulares gratis xeno (SCMM) y luego se convierte en un medio de inducción neural para el resto de la cultura. Una vez que se han diferenciado las organitas durante 3 semanas, la infección puede llevarse a cabo. Por rutina tomar imágenes durante la semana después de la infección, los investigadores observarán muerte celular progresiva y alteración de los organoides. Los investigadores también pueden disociar las organitas en este momento para llevar a cabo transcripcional o perfiles proteómicos. Métodos Cryosectioning y lightsheet se recomiendan para la proyección de imagen, y los investigadores pueden esperar altos niveles de infección y replicación viral particularmente dentro de las poblaciones progenitoras neurales (NPC) de la célula de los organoides. En definitiva, esta técnica permite a los investigadores examinar rápidamente los mecanismos de la infección viral del cerebro humano con equipo de bajo costo y limitada.

Protocolo

1. organitas Cerebral creando de iPSC / hESC cultura 2D (día 0)

Nota: este protocolo asume que la célula de vástago (SC) mantenimiento se lleva a cabo en medio SCMM vitronectina o Geltrex substrato. Si está usando una alternativa, alto en proteínas células cultivo los medios de comunicación, conviene transición SC culturas SCMM para por lo menos dos pasos antes de iniciar la formación de organoide. El Protocolo no ha sido probado con los métodos basados en el alimentador SC cultura.

  1. SC regular uso mantenimiento métodos 25 , 26, traer culturas al 50% - 70% de confluencia. Esto es típicamente 3-4 días después de pases, aunque esto puede ser dependiente en la línea de método y de la célula cultura.
    Nota: Se necesitan aproximadamente 2 pocillos de una placa de 6 pozos para producir una placa completa de 96 pocillos de organoides.
  2. Inspeccionar las culturas mediante microscopía brightfield con 10 aumentos X-20 para morfología de las colonias sanas, con la no diferenciación perceptible.
  3. SCMM traer a 37 ° C en un baño de agua caliente y descongelar un vial de 50 μl 50 mm Y-27632 (inhibidor de la roca) y 2 mL de reactivo de separación enzimática a temperatura ambiente.
  4. Preparar una fijación ultra baja (ULA) U fondo 96 bien la placa, una pipeta multicanal de la P200 y un reservorio de reactivo 25 mL.
  5. Alícuota 45 mL de SCMM en un tubo cónico de 50 mL y añadir 45 μl de 50 mM Y-27632. Mezcla bien por trituración.
  6. Vacío Aspire los dos pozos que contienen SCs y rápidamente agrega 1 mL de reactivo de separación libre de enzima a cada pocillo con una pipeta P1000. Incube la placa en una incubadora de 37 ° C durante 4 min
  7. Vacío Aspire los pozos tratados y agrega 1 mL de reactivo de separación enzimático a cada pocillo con una pipeta P1000.
    1. Incubar la placa en una incubadora de 37 ° C para un adicional 5 min.
    2. Quitar la placa y examinar los pozos tratados. Golpee suavemente sobre la placa para romper las células agregadas. Si racimos de célula grande son todavía visibles, Incube la placa durante 2 min adicionales a 37 ° C. Repita este paso hasta que los racimos no son visibles a simple vista.
  8. Una vez que las células son debidamente disociadas, añadir 1 mL de SCMM a cada pocillo para desactivar las enzimas disociación. Piscina 4 mL de la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mL y tomar una pequeña alícuota para el recuento celular.
    1. Devolver cualquier pozos restantes, sin tratar de la placa de mantenimiento a la incubadora de 37 ° C.
  9. Contando, centrifugar la suspensión de células a 300 x g durante 5 min.
  10. Determinar el número total de células y calcular la cantidad de SCMM + Y-27632 solución que será necesarios para lograr una suspensión de 60.000 células/mL.
  11. De vacío cuidadosamente aspirar el sobrenadante y agregar el volumen calculado de SCMM + Y-27632 solución. Mezclar 5 - 10 veces con una pipeta de 5 mL, asegurar una suspensión uniforme.
  12. Transferir la suspensión de células en un reservorio de reactivo y Pipetear 150 μL en cada pocillo de la placa de fondo ULA U 96 pozos utilizando una pipeta multicanal de la P200. Esto produce 96 organitas individuales, cada uno inicialmente consistiendo en las 9.000 células.
  13. Centrifugar la placa a 150 x g durante 1 minuto
  14. Coloque la placa en una incubadora de 37 ° C y no molestes a la placa de 48 h.

2. Mantenimiento de organoide cerebral (día 2)

  1. preparar 17 mL de SCMM con 17 μl de Y-27643 de 50 m m en un tubo cónico de 50 mL. Caliente el SCMM + Y-27632 solución a 37 ° C en un baño de agua caliente.
  2. Tomar la placa de organoide de la incubadora y usando una pipeta multicanal de P200 en 75 μl, poco a poco elaborar mediana desde el borde del pozo en la primera fila. Una vez dibujado el medio, expulsar rápidamente el medio de nuevo en el pozo para levantar las células sueltas y organitas. Repetir este proceso para cada fila.
    Nota: Esta técnica, en lo sucesivo como un " dispersión, " ruina celular y los organoides se levanta en suspensión. El organoide se hunde rápidamente en el fondo del pozo, mientras que los restos más pequeños se mantiene en suspensión, lo que le permite ser eliminado con un cambio de los medios de comunicación. Esto ayuda a prevenir el organoide de la reclinación en detritos celulares en cultura.
    1. Después de todos los pozos han sido dispersos, esperar por 15 s para asegurar que el organitas han hundido en el fondo de cada pozo.
  3. Lenta y cuidadosamente aspirar 75 μl del medio de cada bien utilizando la pipeta multicanal de la P200 y dispensar en un depósito de basura.
    Nota: Mayoría de los usuarios de vez en cuando aspire un organoide durante alimentaciones regulares. Esto puede ocurrir aproximadamente el 1% del tiempo. Por favor planee en consecuencia asegurar que suficiente organitas sobreviven a momentos experimentales.
  4. Transferencia SCMM + solución Y-27632 en un reservorio de reactivo y dispensar 150 μL en cada organoide bien usando la pipeta multicanal de P200.
  5. Coloque la placa en una incubadora de 37 ° C.

3. Mantenimiento de organoide cerebral (día 3)

  1. caliente 17 mL de SCMM a 37 ° C, esta vez sin Y-27643.
  2. Con la pipeta multicanal de P200 a 100 μl, dispersar a todos los pocillos de la placa de organoides (vea el paso 2.2). Esperar 15 s para asegurar que organitas han hundido en el fondo de sus pozos.
  3. Preparar un depósito de residuos y transferencia SCMM calentado en un reservorio fuente.
  4. Cuidadosamente aspirar 125 μl del medio de cada pozo y reemplazar con 150 μL de SCMM fresco utilizando la pipeta multicanal de P200.
  5. Coloque la placa en una incubadora de 37 ° C.

4. Mantenimiento de organoide cerebral (día) 4 +

Nota: realizar este mantenimiento cada otro día hasta infección.

  1. Antes de comenzar la alimentación el día 4, preparar medio de inducción Neural (NI). Frasco de 5 mL
    1. deshielo una alícuota de 250 μl de heparina 2 mg/mL, junto con uno de 100 X N-2 suplemento. Añadir 250 μl de heparina, 5 mL de N-2 X 100 y 5 mL de 100 X MEM-AANE a 500 mL de DMEM / F12 + GlutaMAX. Estéril del filtro la solución mezclada en un filtro de 500 mL.
      Nota: Mantener NI a 4 ° C cuando no esté en uso; NI dura hasta dos semanas antes de medio fresco debe estar preparado.
  2. Caliente 17 mL de NI medio a 37 ° C.
  3. Con la pipeta multicanal de P200 a 100 μl, dispersar a todos los pocillos de la placa de organoides (vea el paso 2.2). Esperar 15 s para asegurar que organitas han hundido en el fondo de sus pozos.
  4. Preparar un depósito de residuos y transferir NI calentado en un reservorio fuente.
  5. Cuidadosamente aspirar 125 μl del medio de cada pozo y reemplazar con 125 μl de fresco NI con la pipeta multicanal de P200.
  6. Coloque la placa en una incubadora de 37 ° C.

5. Organoide infección por ZIKV (~ 24 día)

Nota: después de aproximadamente 3 semanas de la diferenciación, hay wiva a ser estructuras neuroepiteliales grande y rosetas visibles en el organoide que sea altamente susceptible a la infección por ZIKV.

  1. Traer Earle ' s 1 X equilibrio sal solución (EBSS), 1 X PBS y NI a 37 ° C en un baño de agua caliente.
  2. Diluir ZIKV de concentración conocida en 1 X EBSS a la infección de destino multiplicidad de infección (MOI).
    Nota: Valoraciones de MOIs diferentes se recomiendan para lograr una respuesta viral dosis. Esto puede variar según la cepa del virus; para ATCC VR-1838 y ATCC VR-1843, MOI típico valores entre 0.1 y 10).
  3. Retire cuidadosamente todo medio de organoide bien con una pipeta de P200 de canal único. Rápidamente añadir 200 μL de 1 X PBS a cada pocillo con una pipeta multicanal de P200 lavar el organitas.
  4. Retire cuidadosamente todo medio de organoide bien con una pipeta de P200 de canal único. Rápidamente añadir 50 μl de 1 X sólo EBSS (falsa infección) o solución de antivirus ZIKV bien y asegurar que el organoide esté totalmente sumergida. Repita para cada organoide que debe estar infectado para el estudio.
  5. Coloque la placa en una incubadora de 37 ° C por 2 h.
    Nota: Incubando organitas mock infectados de esta duración no debe afectar significativamente su crecimiento en comparación con organoides.
  6. Aproximadamente 30 min antes de la incubación viral es completado, alícuota 25 mL de NI en un tubo cónico de 50 mL y llevar a 37 ° C en un baño de agua caliente.
  7. Una vez finalizada la exposición viral, lave los organoides con 200 μL de 1 X PBS para cada pozo, permiten organoides que conformarse con 15 s y luego quitar 1 X PBS utilizando una pipeta monocanal P200.
  8. Añadir 200 μL de fresco NI a cada uno bien y vuelva a coloca la incubadora.
    1. Opcional: para un día de tiempo 0 punto, organoides pueden ser reflejada una hora después de la infección.
  9. Continuar a la cultura mediante la sustitución de 125 μl NI todos los días utilizando el método de dispersión (ver paso 4). Asegúrese de deshacerse de gastado los medios y puntas, ya que contiene partículas infecciosas ZIKV.

Resultados

Durante el día de la formación de organoide, culturas de SC deben ser en la fase de crecimiento de registro, en el que son confluentes de 50-70%, como se muestra en la figura 1(A-C). Culturas deben formar colonias redondeadas con bordes distintos, y los pozos deben ser claros de diferenciación de la figura 1(D-E). Si está ocurriendo la diferenciación, se recomienda realizar una selección de quitar para limpiar las zonas afectadas dentro de las placas de al menos un día antes de la creación de organoides. Si se distingue una porción grande de la cultura, puede ser necesario realizar un paso extra, descongelar un vial nuevo o modificar técnicas de cultivo de células madre para asegurar que se están formando los organoides por culturas de célula madre pura.

La disociación por una combinación de tratamiento de reactivos de separación enzimática y enzima libre debe llevar a sobre todo las células, aunque todavía puede haber pequeños agregados de células observadas durante la cuenta. La presencia de pequeños agregados parece no perturbar la formación de organoide, aunque puede afectar la exactitud del conteo. Se recomienda que varias cuentas se hacen por muestra, y si las cuentas varían en más de 20%, puede ser necesario aumentar el tiempo de disociación para singularizar las células más.

Una vez que las células son sembradas y girar hacia abajo en una placa de fondo ULA U 96 pocillos (figura 2A), aparecen como una hoja plana, densa de células en la parte inferior de cada pocillo. Las células se agregan lentamente durante los próximos dos días. Es mejor no molestar a la placa durante estas 48 horas, como las fuerzas mecánicas pueden interrumpir el agregado formado libremente. Para los primeros 10 días, el organoide seguirá siendo principalmente esférico y crecerá de ~ 300 μm a 600-800 μm (figura 2B). Estructuras observables más comienzan a aparecer en el organoide entre 10 y día 20 (figura 2C-E). Día 24, los investigadores deberían ser capaces de observar el rosetón-como las estructuras mediante microscopía de campo luminoso (figura 2F). Manteniendo la cultura, estas estructuras neuroepiteliales pueden aumentar en cantidad y tamaño durante varios días (figura 2G). Durante alimentaciones, el investigador dará cuenta de cantidades considerables de residuos recogida en el fondo de cada pozo, particularmente durante las primeras 2 semanas de la cultura. La técnica de dispersión que se describe en el paso 2.2 quita la mayor parte de esta ruina celular para evitar que los desechos apoptóticos acumulen sobre múltiples feeds (figura 3A). Esta suciedad puede interferir con la proyección de imagen, puede hacerla más difícil observar y cuantificar la muerte celular inducida por la infección y puede proporcionar señalización asimétricos a la vecina organoide que puedan afectar a la diferenciación. Si la técnica de dispersión se lleva a cabo correctamente, este debe ser reducido (figura 3A-b-C, 3D-E).

Se recomienda realizar cryosections o lightsheet la proyección de imagen para examinar la estructura cortical formando dentro de los organoides. En día 25 organoides, las zonas ventriculares y estructuras de roseta son claramente visibles en DAPI (figura 4A) y tinción de fosfo-vimentina (figura 4B). La presencia de TBR2 (figura 4C) indica que se están formando progenitores intermedias, con una morfología que sugiere que la migración hacia el exterior. MAP2 + (figura 4D) neuronas pueblan las regiones exteriores de cada roseta. De estas proteínas, uno puede visualizar la zona ventricular (VZ), zona subventricular (SVZ), zona intermedia (IZ) y placa cortical (CP) en cada roseta (figura 4E, 4E'). Uno puede seguir estos organoides de la cultura con el fin de observar en etapas avanzadas de desarrollo. Aunque no es tan prominente en este tipo de organoide acodar cortical, el interruptor natural gliogenesis ocurre mucho como lo hace en vivo. Esto puede observarse en organoides día 108, en que una gran parte de las células expresan MAP2 o GFAP (figura 4F-I).

Los usuarios pueden esperar para ver las diferencias en tamaño de organoide por aproximadamente 3 días después de la infección por ZIKV, según el Ministerio del interior viral aplicado a los organoides (figura 5A-B). Después de estos 3 días, también habrá un aumento en ruina celular en los pozos infectados en comparación con los pozos de simulacros. Esta diferencia de tamaño de organoide aumentará durante la semana siguiente, hasta que el organitas infectadas comiencen a aparte (figura 5C, D). Una variedad de ensayos puede utilizarse en este momento para investigar mecanismos de infección, incluyendo extracción de RNA viral y cryosectioning (recomendado anticuerpos reportados en la tabla de materiales). En cryosectioning, los usuarios observarán una gran presencia de virus en la región apical de las estructuras neuroepiteliales, que sugieren una susceptibilidad de las células progenitoras neurales (PNJ) a la infección por ZIKV (figura 6). Inmunofluorescencia de organoides seccionado también demostrarán un aumento en la expresión de caspasa-3 hendida en los organoides infectados (figura 7).

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Figura 1 : Morfología de las colonias celulares antes de organoide formación.
Colonias deben ser 50% - 70% confluente en el momento de la disociación para producir una gran cantidad de organoides consistente. (A) dispersos, cultivos sembrados recientemente aún no han alcanzado crecimiento de registro de fase y no va a producir muchos organoides. (B) una vez que las células alcanzan la confluencia adecuada, están listos para la disociación. También es importante que estas colonias son inspeccionadas para asegurar que son claros de diferenciación. (C) las colonias que se toman demasiado llega a confluencia excesiva y no se recomiendan para la formación del organoide. Culturas en este estado tienen más probabilidades de contener células diferenciadoras. (D) los bordes de la Colonia deben ser distintos, con morfología de célula consistente de células redondeadas en el centro y ligeramente alargada de las células hacia los bordes. (E) diferenciación mínima debe estar presente en las culturas. Si las células grandes, aplanadas se observan en los centros o los bordes de las colonias (flecha blanca) y más de aproximadamente 1% de la cultura, se recomienda que se llevan a cabo pasos adicionales o quitar selección para formar una población uniforme de células madre. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : Crecimiento organoide cerebral con el tiempo.
(A) un diagrama para la producción de organoides cerebral de 2D PSCs mantienen en medio gratis xeno, alimentador. (B) para los primeros 8 días, organitas seguirán siendo sobre todo esférico con algunas de las características perceptibles. El diámetro de los organoides que van desde aproximadamente 300 μm a 500 μm. (C-E) en el día 10 regiones más claras comienza a ser detectable alrededor de la periferia de los organoides y pierden su forma esférica. Siguen aumentando de tamaño a aproximadamente 1 mm de diámetro, dependiendo en gran medida en la línea celular se utiliza para producir el organitas. (F) después de aproximadamente 20 días de diferenciación, los usuarios observarán la formación de estructuras neuroepiteliales (flecha negra) en las regiones periféricas claro de mayoría organitas. Éstos tienen una morfología anular, con estructuras apicales y basales, las de la corteza en desarrollo imitando. (G) estas estructuras neuroepiteliales continuará creciendo y aumentando de tamaño durante aproximadamente 20-30 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Claro de detritos celulares vía dispersión técnica de alimentación.
Durante el crecimiento organoide, una gran cantidad de muerte celular es de esperar y puede conducir a la acumulación de detritos celulares alrededor de la base de los organoides. (A) la técnica de dispersión representado permite a los investigadores extraer la mayor parte de esta basura durante cada alimentación. Para ello, usando una pipeta multicanal de la P200, poco a poco elaborar el medio usado y luego rápidamente para levantar los escombros organoide y células en suspensión. El organoide descenderá rápidamente hasta el fondo del pozo, momento en el que puede llevarse a cabo una alimentación regular. Ejemplos de un organoide de día 6 antes de (B) y después (C) alimentación de dispersión muestra la reducción considerable de desechos. Esto continúa por varias semanas, como se muestra en un organoide 18 del día antes (D) y después (E) dispersión de alimentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Caracterización de organoides cerebral mediante inmunohistoquímica.
Lightsheet imágenes de organoides cerebral aparecen para ofrecer un ejemplo de la arquitectura celular que se forma. En el día 25, DAPI (A) y de fósforo-vimentina (B) indicar rosetas y las zonas ventriculares, respectivamente. (C) TBR2 etiquetas intermedias progenitores que están migrando hacia el exterior y MAP2 (D) las etiquetas las neuronas que se han formado en la placa cortical. (E, E') La combinación de estas proteínas, muestra claramente la recapitulación del desarrollo cortical en los modelos de organoide cerebral. (F-I) Día 108, gliogenesis ha ocurrido, con una mezcla de GFAP + y células MAP2 + rellenar gran parte de los organoides. VZ = zona ventricular, SVZ = zona subventricular, IZ = zona intermedia, CP = placa cortical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 : Degradación de infectados organitas.
Imágenes de campo claro (A) de Mock y organitas cerebrales infectados por ZIKV en MOI = 0.1 y 10. Imágenes fueron tomadas inmediatamente después de la infección (día 0), así como 3 y 6 días post-infección. (B-C) Brightfield imágenes de los restos de células que rodean mock (B) y (C) infectados por ZIKV en MOI = 10 organitas cerebral 3 días post-infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6 : Criosección e inmunofluorescencia de infectaron organitas.
Día 24 organitas expusieron a ZIKV en MOI = 0.1 y cryosectioned 6 días más tarde. En esta etapa, hay una clara presencia de virus en las zonas ventriculares y subventricular intermedias de organoide, donde residen las células progenitoras neuronales y glia radial. (A) por medio de tinción nuclear, estas regiones neuroepiteliales son claramente visibles debido (flechas blancas) a la alta densidad de núcleos que forman el anillo-como las estructuras alrededor de la superficie apical. (B) por la coloración de la envuelta viral, se observa una presencia relativamente alta de virus dentro de estas estructuras de roseta (flecha blanca). Tenga en cuenta que hay una pequeña cantidad de virus presente en las células periféricas no identificadas varios. (C-D) Mostrar que hay neuronas presentes en las culturas que no parecen estar infectados por el virus cuando overlaid con la mancha viral las manchas MAP2 u otra neurona-específica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7 : Troceados caspasa-3 inmunofluorescencia de organoide infectado.
Después de la infección, uno puede utilizar indicadores de apoptosis para investigar los mecanismos de muerte celular que ocurren dentro de los organoides. En este ejemplo, 24 organitas día expusieron a ZIKV en MOI = 0.1 y cryosectioned 6 días más tarde. (A) no infectadas organitas no mostrar ninguna envoltura vírica (2 de 4 proteínas) y una cantidad mínima de exfoliados caspasa-3 debido a apoptosis homeostática que ocurren en el tejido. (B) rosetas infectados comienzan a mostrar niveles elevados de apoptosis. (C) los rosetones que muestran infección severa via 2 4 tinción también tienden a mostrar altos niveles de exfoliados caspasa-3 en estas regiones. Hay una correlación directa entre la gravedad de la infección y exfoliado caspasa-3 expresión dentro de las rosetas de infectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Hay varias advertencias a tener en cuenta cuando utilizando organoides cerebral humana para investigar infección por ZIKV. Una consideración importante es que la formación organoide y estructura es altamente dependiente en la línea de células madre de la cual se forman. Tenga cuidado al comparar entre las líneas celulares, incluyendo líneas isogénicas de ingeniería; es mejor sacar conclusiones utilizando varios subclones e idealmente múltiples líneas de células madre. Además debido a esta diferencia en las líneas celulares, se recomienda experiencias piloto para asegurar que la diferenciación apropiada está ocurriendo en el organitas. Mientras que las estructuras neuroepiteliales son visibles por microscopía brightfield, también se sugiere llevar a cabo experimentos de qRT-PCR o cryosectioning a buscar marcadores de diferenciación neural como PAX6 o fosfo-vimentin.

Uno debe anticipar también una variabilidad considerable entre los organoides en la misma línea celular. Debido a lo liso del Protocolo, el número y tamaño de estructuras neuroepiteliales pueden variar entre los organoides. Por lo general, uno puede esperar al menos dos grandes (> 200 μm de diámetro por D24) neuronales rosetas por organoide. Por esta razón, estudios longitudinales, tales como la observación de cambio de tamaño de organoide sobre infección, son particularmente iluminadoras. Variabilidad entre lotes puede también ocurrir, con la causa más probable para esto ser inexacta célula contando o siembra. Se recomienda llevar a cabo múltiples cuentas y para asegurarse de que la suspensión de células se mezcla bien antes de sembrar en las placas de fondo ULA U 96 pocillos.

Cuando cultivo organitas en placas de fondo ULA U 96 pocillos, plan en ver efectos de evaporación considerable alrededor de los bordes de las placas. Es ideal para rellenar estos pozos con PBS y trabajar solamente con los 60 pozos centro. Debido a la evaporación, organitas en pozos exteriores estarán expuestos a diferentes condiciones que en el centro, lo que probablemente afectará a su crecimiento y diferenciación. Por favor considere esto al planear el número de organoides que se necesitarán para los experimentos. Además, organitas comenzará a cubran el formato de 96 pozos después de aproximadamente 30 días, que será visibles por la decoloración del medio de cultivo. Si planea tomar el organitas más allá de los 30 días, se recomienda transferir el organitas a una placa de 24 pocillos ULA. Realizar a la transferencia, utilice tijeras para cortar una punta de P1000 para que la apertura es mucho mayor que los organoides propios, y transferir los organoides por pipeteo.

Organoides cerebrales humanos tienen gran potencial en el avance de la comprensión del campo de desarrollo neurológico y las enfermedades. Los investigadores se anima a modificar el protocolo según sea necesario. Por ejemplo, uno podría aplicar factores de diseño para mejorar la eficiencia de la diferenciación hacia tipos específicos de la célula, lo que les permite explorar el impacto viral en ciertas regiones anatómicas. Los efectos del desarrollo neurológico de ZIKV son todavía poco conocidos, pero este nuevo enfoque le dará a los investigadores una manera accesible, rápida y de alto rendimiento de investigar los mecanismos de infección.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Los autores agradecen ayuda con propagación inicial y cuantificación de ZIKV Priscilla L. Yang y Dominique J. Burri de medicina de Harvard. También nos gustaría agradecer a Nathaniel D. Kirkpatrick de apoyo. K.E. fue apoyado por el centro de Stanley de investigación psiquiátrica y el Instituto Harvard de células madre.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSRStemCell Technologies5873
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100ML
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X)Gibco10565-018(+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate
N-2 Supplement (100X)Gibco17502-048
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11140-050
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)GE Healthcare Life SciencesSH30029.02
Stericup Filter (500mL)Millipore220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round BottomCorning7007
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL)Integra4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+Rainin17013810
Large Centrifuge, Culture Plate-CompatibleThermo Scientific75007210
Culture Plate Centrifuge RotorThermo Scientific75005706
Vero CellsATCCCCL-81For virus expansion, if necessary
Zika Virus (Uganda Strain)ATCCVR-1838Other strains may be used
Zika Virus (Puerto Rico Strain)ATCCVR-1843Other strains may be used
phospho-vimentinMBLD076-3mouse polyclonal,  1:250 dilution
TBR2Abcamab23345rabbit polyclonal, 1:300 dilution
MAP2NovusNB300-213chicken polyclonal, 1:1500 dilution
GFAPCell Signaling TechnologiesCST12389Srabbit polyclonal, 1:200 dilution
D1-4G2 flavivirus envelope proteinEMD MilliporeMAB10216mouse monoclonal, 1:500 dilution
cleaved caspase-3Cell Signaling Technologies9661rabbit polyclonal, 1:200 dilution
488 anti-mouse IgGThermo FisherA-11001goat polyclonal, 1:1000
594 anti-rabbit IgGThermo FisherA-11037goat polyclonal, 1:1000 dilution
647 anti-chicken IgYThermo FisherA-21449goat polyclonal, 1:1000 dilution

Referencias

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