Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Resumen

Este protocolo demuestra la inducción de la enfermedad de malformación cavernosa cerebral en un modelo de ratón y utiliza contraste realzado micro tomografía para medir la carga de lesión. Este método aumenta el valor de modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para la malformación cavernosa cerebral y otras enfermedades cerebrovasculares.

Resumen

Las mutaciones en el CCM1 (aka KRIT1), CCM2, o CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformación cavernosa cerebral (CCM) en seres humanos. Se han establecido modelos de ratón de la enfermedad CCM por tamoxifeno inducido supresión de genes de Ccm en animales postnatales. Estos modelos de ratón proporcionan herramientas muy valiosas para investigar el mecanismo molecular y aproximaciones terapéuticas para la enfermedad CCM. Un método preciso y cuantitativo para evaluar la progresión y la carga de lesión es fundamental para aprovechar todo el valor de estos modelos animales. Aquí, demostramos la inducción de la enfermedad en un modelo murino de CCM y el uso del contraste mejorado método de (micro-CT) micro tomografía de rayos x a medida CCM lesión carga en cerebros de ratón. En el día postnatal 1 (P1), utilizamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para activar la actividad recombinase de Cre de transgén Cdh5 CreErt2 hender el alelo floxed del Ccm2. Se analizaron las lesiones CCM en cerebros de ratón en P8. Para micro-CT, solución de Lugol yodo basado fue utilizado para mejorar el contraste en el tejido cerebral. Hemos optimizado los parámetros de exploración y utiliza una dimensión del voxel de 9,5 μm, que conducen a un tamaño mínimo de la función de aproximadamente 25 μm. Esta resolución es suficiente para medir el número y volumen de la lesión CCM a nivel global y precisa y proporcionar cartografía 3D de alta calidad de lesiones CCM en cerebros de ratón. Este método aumenta el valor de los modelos de ratón establecido para estudiar la base molecular y terapias potenciales para CCM y otras enfermedades cerebrovasculares.

Introducción

CCM son de paredes delgadas, dilatados malformaciones vasculares en el cerebro con prevalencia de hasta el 0,5% en la población humana¹. CCM puede ser heredado como un desorden dominante debido a las mutaciones de pérdida de función en uno de tres genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2y CCM3 (también llamado PDCD10)^{2,3,4 ,5,6}. Estos genes están presentes en un solo complejo de señalización.

Varios modelos se han desarrollado la enfermedad humana de CCM modelo y comprender las vías descendentes de los genes CCM que son responsables de CCM^7,8,9,10. El modelo más robusto es condicional eliminar alguno de los genes MCP con tamoxifeno-inducible CreERT2 Cdh5 en P1 en cachorros recién nacidos^8,10. Estos cachorros desarrollan lesiones CCM en el cerebro de P6 hacia adelante y se espera que sean un modelo ideal para los estudios preclínicos en búsqueda de mecanismos y agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades CCM.

CCM lesión en cerebro de ratón se ha medido principalmente por métodos basados en la histología, un enfoque que es extremadamente lento y sujeto a investigador diagonal^10,11,12. Métodos de MRI basado se han utilizado para evaluar la carga de lesión CCM en el ratón adulto modelo^9,13. Sin embargo, un especializado instrumento de MRI animal pequeño y largo tiempo de la exploración de varias horas hasta toda la noche es necesaria para lograr una resolución satisfactoria para identificar lesiones CCM. Además, si la MRI puede usarse para detectar lesiones CCM en ratones neonatales no se ha divulgado y resolución puede limitar la sensibilidad.

Recientemente hemos desarrollado una técnica de micro-CT para la imagen y analizar CCM lesión^14,15. Esta alta resolución, tiempo y rentable método dramáticamente habían aumentado el valor del modelo de enfermedad CCM en estudios mecanísticos y terapéuticos. Métodos de tinción mejoran el contraste, todo Monte se han utilizado para micro-CT en la proyección de imagen de tejidos blandos y de embriones de ratón^16,17. Previamente, hemos utilizado una tinción basada en osmio para mejorar contraste para micro-CT en la proyección de imagen de las lesiones CCM en el cerebro¹⁴. En este trabajo, usamos menos tóxico, no-destructiva, y reactivo eficiente, un yodo basado en solución de Lugol, para mejorar el contraste para la proyección de imagen micro-CT. Yodo puede difundir a través del cerebro y tiene una alta afinidad de sangre¹⁸.

El protocolo detallado se presenta aquí de la inducción de lesiones CCM en un modelo de ratón neonatal junto con la proyección de imagen y análisis de las lesiones CCM con un contraste basado en micro-CT. Este método basado en micro-CT proporciona medición cuantitativa global del volumen de lesión CCM, identifica con precisión el número y la localización 3D de CCM lesiones en el cerebro de ratón y reduce el costo y tiempo requerido para el fenotipo de estos animales.

Protocolo

todos los animal ética y protocolos fueron aprobados por el Sydney Local salud distrito Animal Comité de bienestar institucional Animal atención y Comité uso (IACUC) de la Universidad de medicina de Tianjin. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices/normas del Instituto Centenario, Universidad de Sydney y Universidad de medicina de Tianjin

1. Inducción de malformaciones cavernosas cerebrales en modelos de ratón

1. Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^fl/fl ratones con Ccm2 ^fl/fl generar camadas con Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^fl/fl (Ccm2 ^iECKO) cachorros y littermate controles (Ccm2 ^fl/fl). CreErt2 Cdh5 y Ccm2 ^fl/fl animales han sido previamente descritos ¹⁹.
2. Disolver 4HT en etanol al 100% y almacenar a-80 ° C en alícuotas de 30 μl (4HT concentración: 10 mg/mL). En el día de uso, diluir alícuotas 4HT en aceite de maíz (0.5 mg/mL).
3. Intragástricamente inyectar 50 μl de 4HT (0.5 mg/mL) a cachorros neonatales en P1 para inducir lesiones CCM experimentales utilizando una jeringa de insulina.

2. Preparación de exploraciones del Micro-CT de la muestra

1. eutanasia neonatales cachorros en P8 mediante asfixia dióxido de carbono.
2. Realizar perfusión intra cardiaca mediante la inserción de una aguja de calibre 29 con 3 mL de paraformaldehído al 2% en PBS en una jeringa de 10 mL en el ventrículo del corazón de ratón.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.
3. Separar la cabeza del cuerpo usando unas tijeras. Quitar toda la piel de la cabeza usando unas tijeras y retire el cráneo usando pinzas para diseccionar el cerebro entero.
4. Tomar imágenes del cerebro con el estereomicroscopio en 7,82 x aumento, aumento de x 1, gamma 0,6 y tiempo de exposición de 20 ms.
5. Fijar los cerebros disecados con paraformaldehído al 4% en solución de PBS durante la noche.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.
6. Al día siguiente, separar usando un fórceps de hindbrains y lavarse con solución de PBS.
7. Incubar hindbrains en Lugol ' solución de yodo de s para 48 h.
8. Después de la incubación, brevemente aire seco hindbrains para quitar exceso Lugol ' solución de yodo s.
9. Paquete el Lugol ' yodo s manchado hindbrains en tubos de microcentrífuga de 0,65 mL y sello totalmente con película de plástico de parafina para evitar la contracción del tejido ( figura 2 A).
10. Colocar tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de 5 mL con esponjas para evitar movimientos durante la exploración ( figura 2 B).

3. Micro-CT Scan de CCM en el cerebro de ratón

1. montar verticalmente el cerebelo que se embalará en un tubo sobre un soporte de aluminio en el sistema de micro-CT.
2. Configurar los parámetros de exploración 540 proyecciones y tiempo de exposición de s 2 condiciones fuente de 50 kV y 10 W para adquirir los conjuntos de datos tomográficos (imagen resolución 9,5 μm/píxeles).
3. Las radiografías de la exploración se reconstruyen automáticamente por el software de reconstrucción de proyección basados en hardware suministrado por el sistema de micro-CT, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16-bit (" TXM " archivo).

4. Análisis de conjuntos de datos de Micro-CT

1. abrir el archivo de imagen reconstruida (" TXM " archivo) en el software de análisis 3D y visualizar el cerebro usando la " volumétrica " función.
2. Transformar el cerebelo a la orientación deseada usando el " rectángulo de " y " plano de recorte " funciones.
3. Volver a muestrear la imagen transformada en modo extendido y preservar el tamaño de voxel.
4. Crear " editar nueva etiqueta campo " en la imagen transformada (4.3) y resaltar solo el cerebelo con intensidad en escala de grises.
5. Agregar las zonas resaltadas y ejecutar " Análisis de la etiqueta " para obtener mediciones del cerebelo todo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.
6. Visualizar el cerebelo usando la " representación de isosuperficies " función.
7. Crear otro " editar nueva etiqueta campo " en las transformada imagen y resaltar las áreas con lesiones usando la intensidad en escala de grises.
8. Agregar las zonas resaltadas y ejecutar " etiqueta " análisis para obtener mediciones de las lesiones en el cerebelo (es decir, volumen total y área). Exportación medidas en un archivo de Excel.
9. Visualizar las lesiones utilizando el " generar superficie " y " de la superficie vista " funciones.
10. Instantánea de las imágenes del cerebelo en orientaciones deseadas o generar una película para la visualización 3D de las lesiones.

Resultados

Una sola inyección de 4HT en P1 fue suficiente para inducir lesiones en el cerebelo de CCM. Micro-CT en contraste de yodo de Lugol suficientemente detectó lesiones CCM y podría cuantificar su número y volumen. Utilizando el micro-CT en optimizado, imágenes de lesiones CCM en el hindbrains de ratones Ccm2^iECKO . Se reconstruyeron imágenes escaneadas de rayos x para producir imágenes 3D de cerebro de ratón, que permitió la visualización de todas lesiones en el...

Discusión

CCM es una malformación vascular común que afecta hasta el 0,5% de los individuos¹. CCM puede ocurrir en forma esporádica o familiar. Pronóstico paciente desconoce a menudo como lesiones CCM pueden romperse inesperadamente para causar derrame cerebral y otras consecuencias neurológicas. Actualmente, la opción único tratamiento es extirpar quirúrgicamente las lesiones, que van acompañadas de alto riesgo.

Las condiciones humanas de CCM han sido reproducidas recie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy tamoxifen	Sigma-Aldrich	H6278	To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope	Leica	M205FA	To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution	Sigma-Aldrich	L6146	To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film	Parafilm	PM992	To package samples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400	Micro-CT
3D rendering software	FEI Visualization Science group	Avizo 3D image processing software	To analyse micro-CT scans