Evaluación de la fragilidad del hueso Cortical bovino utilizando pruebas de Scratch

Resumen

Este estudio evalúa la resistencia a la fractura del hueso cortical bovino a nivel sub-meso mediante pruebas microscópicas de cero. Se trata de un original, objetivo, riguroso, y reproducible método propuesto para probar la resistencia a la fractura debajo de la escala macroscópica. Aplicaciones potenciales están estudiando cambios en la fragilidad del hueso debido a enfermedades como la osteoporosis.

Resumen

El hueso es un material complejo jerárquico con cinco niveles distintos de organización. Factores como el envejecimiento y las enfermedades como la osteoporosis aumentan la fragilidad del hueso, lo que es propensa a la fractura. Debido al gran impacto socio-económico de la fractura de hueso en nuestra sociedad, hay una necesidad de nuevas formas evaluar el desempeño mecánico de cada nivel jerárquico del hueso. Rigidez y la fuerza pueden ser sondeados en todas las escalas – nano - micro-, meso-, y macroscópico – evaluación de fractura ha hasta ahora se han limitado a pruebas macroscópicas. Esta limitación restringe nuestro entendimiento de la fractura de hueso y restringe el ámbito de laboratorio y estudios clínicos. En este estudio, investigamos la resistencia de la fractura del hueso de las microscópicas a las escalas de longitud mesoscópica usando las pruebas de scratch micro combinadas con la mecánica de fractura no lineal. Las pruebas se realizan en la orientación longitudinal corto en muestras de hueso cortical bovino. Se desarrolla un minucioso protocolo experimental y un número grande (102) de las pruebas se llevan a cabo para evaluar la resistencia a la fractura de las muestras de hueso cortical mientras que representa la heterogeneidad asociada a microestructura del hueso.

Introducción

En este estudio, medimos la resistencia a la fractura de hueso compacto bovino de la mesoescala (osteons) a microescala (nivel laminar) utilizando una nueva técnica de rayado micro^{1,2,3,4, 5}. Procesos de fractura incluyendo iniciación y crack propagación de grieta en el hueso son directamente influenciados por escalas de la longitud debido a los diferentes componentes estructurales y organización en los diferentes niveles de jerarquía. Por lo tanto, evaluar la fractura de hueso en escalas más pequeñas de la longitud es esencial al rendimiento una comprensión fundamental de la fragilidad del hueso. Por un lado, compacto de pruebas convencionales como tres puntos de flexión, tensión y flexión las pruebas se realizan comúnmente en bovino fémur y la tibia para la caracterización de la fractura en la escala macroscópica^{6,7, 8}. por otro lado, para medir la resistencia a la fractura en la escala microscópica, fractura de indentación de Vicker fue propuesta⁹. Micro sangría se realizó con penetrador de Vicker para generar grietas radiales. Además, el método de dureza de fractura de nanoindentación de Oliver Pharr se realizó mediante un fuerte cubo esquina penetrador¹⁰.

En los estudios mencionados de nanoindentación en fractura dureza, se midieron las longitudes de las grietas así generadas por el observador y se utilizó un modelo semi-empírico para calcular la resistencia a la fractura. Sin embargo, estos métodos son irreproducible, subjetiva y los resultados dependen mucho de la habilidad del observador debido a la necesidad de medir la longitud de grieta utilizando microscopia óptica o microscopia electrónica. Además, se realizaron pruebas de cero en la escala de nano, pero el modelo matemático subyacente no está basado en la física ya que no tiene en cuenta la reducción en la fuerza debido a grietas y defectos¹¹. Por lo tanto, existe una brecha de conocimiento: un método para la evaluación de la fractura a nivel microscópico basado en un modelo mecanicista basado en la física. Esta brecha de conocimiento motivó la aplicación de micro arañazos pruebas para compactar hueso centrándose primero en especímenes porcinos⁵. El estudio ahora se ha extendido aún más entender hueso cortical bovino.

Dos orientaciones diferentes de las muestras son posibles: longitudinal transversal y corta longitudinal. Transversal longitudinal corresponde a propiedades perpendiculares al eje longitudinal del fémur la fractura. Mientras, corta longitudinal corresponde a las propiedades de fractura a lo largo del eje longitudinal del fémur⁵. En este estudio, aplicamos pruebas scratch bovino huesos corticales para caracterizar la resistencia de la fractura del hueso en la dirección longitudinal corto.

Protocolo

Nota: El protocolo descrito aquí, sigue las pautas de cuidado de los animales de la Comisión de uso y cuidado Animal institucional de Illinois.

1. muestra adquisiciones

1. Recoger fémur bovinos recién cosechados de un Estados Unidos Departamento de agricultura USDA certificado matadero y transportan en bolsas de plástico herméticas en una hielera.
   Nota: Para el estudio realizado aquí, fémur se obtuvieron de animales que fueron 24-30 meses edad, Morillas y pesados unos 1.000 - 1.100 libras.
2. Congele el fémur en –20 ° C hasta el inicio del procedimiento de preparación de muestras. Esta temperatura mantiene el fémur fresco^12,13,14.

2. corte, limpieza, incrustación y las muestras

1. Descongelar los congelados fémures en un recipiente con agua por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente.
2. Cortar varios discos de unos 10-15 mm de espesor de la región de la diáfisis media usando una sierra de banda de mesa diamante superior para producir a ejemplares con uniforme de la superficie transversal del hueso cortical.
3. Utilice un kit de disección para quitar cualquier tejido suave o la carne unido a la cortical ósea.
4. Las secciones transversales de los fémures obtenidas en el paso 2.2 usando una hoja de diamond wafering a una baja velocidad de sierra bajo condiciones húmedas a lo largo del eje longitudinal del hueso para obtener múltiples secciones más o menos cuboidales.
   Nota: Aquí, sólo preparación de la muestra y cero pruebas realizadas en el corto – muestras longitudinales se discuten. Sin embargo, excepto para la dirección del corte, el procedimiento de preparación es el mismo para la orientación transversal.
5. Limpie a los especímenes en una solución preparada con 1.5% aniónico limpiador y lejía 5% para una duración de 20 minutos en un limpiador ultrasónico.
6. Incrustar las muestras de hueso cortical en resina acrílica (adjunto Polimetil metacrilato (PMMA)) para facilitar la maniobrabilidad y estabilidad.
   1. Para incrustar a las muestras, primero una capa las paredes del molde con un agente de liberación. Luego mezclar la resina y el endurecedor en un vaso, según las instrucciones dadas por el fabricante PMMA.
   2. Una de las muestras de hueso cortical corte poner en cada molde con la superficie a rayar hacia abajo. Vierta la mezcla de resina acrílica en estos preparados los titulares de la muestra. Deje que las muestras de la curación para una duración de hasta 4-5 h.
7. Cortar los especímenes incrustados en discos de espesor 5 mm, exponer la superficie a ser rayada, con la baja velocidad VI y montar las muestras en discos de metal (aluminio) de diámetro 34 mm y altura 5 mm con adhesivo de cianoacrilato.
8. Envolver los ejemplares en un calibre empapado en Hanks equilibrada solución salina (HBSS) y refrigerar a 4 ° C hasta más de^15,de uso¹⁶.

3. pulido y protocolos

Nota: Un requisito previo a las pruebas de alta precisión a escalas pequeñas de longitud es una superficie lisa y nivelada de las muestras. Anteriores protocolos de pulido^13,17 resultan en una gran rugosidad de la superficie, conduce a considerable imprecisión en la medida. El reto está en lograr la baja rugosidad de superficie promedio, menos de 100 nm, sobre una superficie de área grande 3 x 8 mm² .

1. Moler a las muestras de hueso cortical bovino a temperatura ambiente usando grano 400 y 600 artículos de carburo de silicio grano por 1 min y 5 min, respectivamente. Mantener la amoladora pulidora a una velocidad base de 100 rpm y 150 rpm, respectivamente.
2. Máquina de moler las muestras de hueso cortical bovino a temperatura ambiente en los papeles de grano 800 y 1.200 para una duración de 15 minutos para cada paso. Mantener la amoladora pulidora a una velocidad base de 150 rpm, cabeza velocidad de 60 rpm y de funcionamiento de 1 lb.
3. Polaco los especímenes utilizando 3 μm, 1 μm y 0,25 μm diamante suspensión soluciones en el mismo orden en un duro, perforado, tela no tejida para una duración de 90 min a temperatura ambiente. Mantener la carga de operación de cada paso en 1 lb con velocidades de base y la cabeza de la pulidora en 300 rpm y 60 rpm, respectivamente.
4. Pulir a la muestra con solución de suspensión de alúmina 0,05 μm en un paño suave, sintéticas rayón para una duración de 90 min en 1 lb con base y la cabeza de 100 rpm y 60 rpm, respectivamente, también a temperatura ambiente.
5. Poner a las muestras en un vaso de precipitados con agua desionizada y puso el vaso en un baño ultrasónico durante 2 min entre cada paso consecutivo de esmerilado y pulido para limpiar los residuos y evitar la contaminación cruzada.
6. Ver las características de superficies mediante microscopía óptica y proyección de imagen de SEM.
   Nota: Como se muestra en la figura 1, osteons, conductos de Havers, líneas de cemento, las regiones intersticiales y lagunas fueron observados en las muestras de hueso cortical bovino. Estos métodos imagenológicos revelan la naturaleza porosa, heterogénea y anisotrópica de las muestras de hueso cortical. Además, prueba avanzada de la superficie de las muestras fue realizado para evaluar la calidad de la superficie pulida. Una representante de la superficie pulida se muestra en la figura 2.

4. micro arañazos prueba

Nota: Micro arañazos pruebas se realizan en las muestras de hueso cortical bovino pulido con un comprobador de memoria micro (figura 3). Un diamante penetrador Rockwell con un radio de punta de 200 μm y vértice el ángulo de 120° se utiliza para el estudio. El instrumento permite la aplicación de una carga progresiva lineal hasta 30 N. Además, el instrumento está equipado con sensores de alta precisión para medir la carga horizontal, la profundidad de penetración y emisiones acústicas generadas debido al rascado. El instrumento puede capturar los panoramas de surcos del rasguños.

1. Antes de la prueba de las muestras de hueso cortical, calibrar la punta del penetrador Rockwell con policarbonato como material de referencia³.
2. Coloque a la muestra de hueso cortical en el escenario y elija el sitio de la prueba de scratch con el microscopio óptico creado integrado al módulo probador micro de la memoria.
3. Aplicar una carga progresiva lineal con una carga inicial de 30 mN y final de la carga de 30 N. La velocidad de carga debe ajustarse a 60 N/min y la longitud de cero a 3 mm.
4. Realizar series de pruebas de scratch en el longitudinal corto (figura 3b) muestras de hueso cortical bovino como se ilustra en la figura 3.
5. Humedezca la superficie del espécimen con HBSS después de una serie de cada tres o cuatro cero pruebas para mantenerlos hidratados.
6. Analizar los datos de prueba cero basados en mecánica de fractura no lineal, modelado².

Resultados

Microscopía de fuerza atómica fue utilizado para medir la rugosidad de la superficie pulida. Como regla general, la muestra califica como un bien pulido si la rugosidad es un orden de magnitud más pequeño que las características superficiales de interés. En este caso, la aspereza superficial medida de 60 nm en una superficie de μm 40 μm x 40 cae claramente dentro de este criterio.

La figura 4

Discusión

Micro pruebas scratch inducir una fractura de modo mixto³. Además, en las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto, se activan procesos de fractura como la sonda excava más profundo. Para un arañazo largo 3 mm, el volumen prismático sondeado es alrededor de 3.600 μm de largo, ancho 600 μm y μm 480 profundo. Este gran volumen ayudó a predecir una respuesta homogeneizada. Un modelo de mecánica de fractura no lineal nos permitió extraer la resistencia de la fractura basada en el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table Top Diamond Band Saw	McMaster Carr, Elmhurst, IL	Model  C-40	Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	112780	Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser	(Through) Grainger, Peoria, Illinois	39J365	Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	497250	8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester	Anton Paar Switzerland AG	163251	Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope	JEOL USA, Inc., Peabody, MA		Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG	FEI Company		Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Bovine Femur	L&M Slaughter house, Georgetown, IL		Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner	Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603	1104-1	Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting	Electron Microscopy Sciences	24210-02	Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080400	Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080600	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	36080800	Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	16081200	Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407638	Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	407518	Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406631	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406630	Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	406629	Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm	Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044	40-6377-032	Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025126	Buffer Solution