Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Resumen

Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.

Resumen

Aunque se han desarrollado ensayos de invasión 3D, el desafío sigue siendo estudiar las células sin afectar la integridad de su microambiente. 3D tradicionales ensayos tales como el compartimiento de Boyden requieren que las células son desplazadas de la ubicación original de la cultura y se trasladó a un nuevo entorno. No sólo hace esto interrumpir los procesos celulares que son intrínsecos al microentorno, pero a menudo resulta en una pérdida de células. Estos problemas son especialmente difíciles cuando se trata de las células que son raros, o extremadamente sensibles a su microambiente. Aquí, describimos el desarrollo de un ensayo de invasión 3D que evita ambos problemas. En este ensayo, las células se platean dentro de un pequeño bien y una matriz del ECM que contiene un chemoattractant se coloca encima de las células. Esto no requiere desplazamiento de la célula y permite a las células invadir hacia arriba en la matriz. En este ensayo, invasión celular y morfología celular puede ser evaluada en el gel de colágeno. Usando este análisis, se caracteriza la capacidad invasiva de las células raras y sensibles; las células híbridas resultantes de la fusión entre las células de cáncer de mama MCF7 y mesenquimales multipotentes/tallo/estroma células (MSCs).

Introducción

La motilidad celular es un proceso fisiológico y de desarrollo normal de las células. Sin embargo, cambios en el patrón y la capacidad de las células para migrar e invadir están asociados a condiciones patológicas como enfermedades inflamatorias y cáncer metástasis^1,2,3. La metástasis es posiblemente el aspecto más mal entendido en cáncer. Para metástasis, las células cancerosas deben degradar la matriz extracelular (ECM), invaden el tejido local y intravasate. Una vez en circulación, las células cancerosas se difundir el sitio distante extravasate y formar tumores secundarios. Por lo tanto, la capacidad de las células para degradar el ECM, a migrar y a invadir se relaciona con su potencial metastásico. Han desarrollado diferentes enfoques para analizar y cuantificar las capacidades de migración y la invasión de las células. Los enfoques más utilizados incluyen la cicatrización ensayo, microscopía Time-lapse y el análisis de la cámara de Boyden. La herida curativo ensayo⁴ y tiempo lapso microscopia son ensayos simples y convenientes que darían visión preliminar de migración de la célula. Sin embargo, ambos son ensayos 2D que reflejan el entorno 3D en el que las células existen en vivo. Los estudios han demostrado que las células responden de manera diferente a un entorno 3D comparado con un 2D^5,6. Por otra parte, ensayos curativos de heridas son difíciles de reproducir y producir resultados cuantitativos^7,8,9. El análisis de la zona de exclusión de la célula, que es una modificación 3D de ensayo de las heridas, es un ensayo más fisiológico relevante pero no es adecuada para células bajas en número como células híbridas resultantes de celular fusión eventos^10,11 .

El análisis de la cámara de Boyden es un ensayo de 3 dimensiones que provee microambientes pertinentes estudios celulares. Sin embargo, necesita extraerse su microentorno original y ser depositado en la cámara alta del sistema de análisis de Boyden para migrar e invadir hacia abajo hacia el medio que contiene chemoattractant. Este enfoque 3D no es apropiado en el análisis de la capacidad de migración y la invasión de células vulnerables a su microambiente o limitada en número de^11,10,12. Un enfoque más reciente para analizar la invasión y migración de la célula es la microfluídica cámara gradiente análisis¹³. Aunque conveniente y fiable en los estudios de migración y la invasión, este análisis son más costoso y pueden ser técnicamente difícil para un laboratorio típico. Describimos aquí un ensayo de invasión vertical invertido simple que es compatible con muchos tipos de células incluyendo las células sensibles a su microambiente o restringidas en número. Este ensayo fue adaptado del protocolo propuesto por Hooper et al. ¹⁴. en este ensayo, las células permanecen en su microentorno original y su migración y la invasión se controla mientras se mueven hacia arriba en el gel de colágeno que contiene un chemoattractant¹¹. Este ensayo es reproducible y ha sido optimizado y validado en la placa de cultivo de 35 mm. Podría adaptarse a las condiciones de ensayo diferentes incluyendo tamaños de célula diferente cultura, diferentes matrices o fuerza de adherencia y diferentes atrayentes. Este análisis podrían servir como una plataforma en vitro para la detección inicial en el proceso de descubrimiento de fármacos.

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Protocolo

Nota: Este protocolo se describe en McArdle et al. ¹¹. una línea de tiempo se proporciona en la figura 1.

1. preparación de la placa de cultivo

1. Lave la placa de cultivo de 35 mm que contiene un fondo de cristal de 10 mm con 1 mL de 1 M de ácido clorhídrico (HCl) durante 15 minutos reducir la hidrofobicidad de la parte inferior de cristal.
2. Lave la placa de cultivo dos veces con 1 mL de solución salina buffer fosfato (PBS) para deshacerse de la HCl.
3. Lave la placa de cultivo dos veces con 1 mL de etanol al 70%.
4. Enjuague la placa de cultivo con 1 mL de medio de cultivo específico celular (aquí uso α-MEM suplementado con 10% de calor inactiva FBS y los de aminoácidos no esenciales 1%).
   Nota: La placa de cultivo tratado que contiene el medio de cultivo se puede almacenar en la incubadora de CO₂ con un humidificador a 37 ° C hasta el día siguiente.
5. Crecen las células (MSCs y MCF-7 co de la cultura) en el fondo de cristal tratado de la placa de cultivo de 35mm a 100% de confluencia. Co de la cultura células MSC 35.000 y 75.000 de células MCF7 durante 24 h.

2. preparación del gel de colágeno

1. Guarde las puntas de micropipeta utilizadas para pipetear el gel de colágeno en el congelador para evitar la polimerización del colágeno al entrar en contacto.
   Nota: Este es el paso más crítico.
2. Determinar un volumen de colágeno de cola de rata I utilizar basado en la concentración de la población de colágeno. Preparar 100 μl de gel de colágeno para este ensayo.
   Nota: Alta concentración de colágeno de la cola de rata que stock funciona mejor. Determinar el volumen de 10 x medio modificado Eagle de Dulbecco para diluir el colágeno por consiguiente.
3. Combinar en el colágeno de cola de rata de hielo I (acción de 3,8 μg/mL), modificado Eagle de 10 x Dulbecco mediana y 1 x celular medio de cultivo suplementado con 2% de suero bovino fetal y la chemoattractant correspondiente a una concentración final de colágeno de 2.4 mg/mL.
4. Añadir a la mezcla 4,5% de solución de bicarbonato de sodio para neutralizar el gel de colágeno.
   Nota: El volumen de solución de bicarbonato de sodio añadido puede variar según el pH exacto de los otros reactivos. Es mejor probar la mezcla con tiras de pH para garantizar la solución neutral, o usar un indicador de pH en el medio de cultivo.
5. Pone 80 μl de la mezcla de colágeno sobre las células en el fondo de cristal de la placa de cultivo.
6. Permita que el gel de colágeno polimerizar durante 30 minutos en un incubador de CO₂ con un humidificador a 37 ° C.
7. Cubrir el gel de colágeno con 2 mL de medio de celular con suero reducido (2%) e incubar a las células a 37 ° C en un incubador de₂ CO con un humidificador para 24, 48 o 72 h.
   PRECAUCIÓN: La placa debe manejarse con cuidado para evitar que el gel de colágeno extraer desde el fondo de cristal.

3. ejemplo de elaboración de colágeno gel usando un stock de colágeno de cola de rata de 3,8 μg/ml

1. Con hielo, combinar 114.5 μl de colágeno de cola de rata, 16.6 μl de 10 x DMEM y 33,1 μl del medio de cultivo que contiene la chemoattractant.
2. Neutralizar la mezcla de colágeno con 14.0 μL de bicarbonato de sodio.
3. Continuar como en el paso 2.5.

4. la proyección de imagen de las células

1. Retire con cuidado los medios de comunicación de la fuente.
2. Enjuague suavemente el gel con 1 mL de PBS.
3. Fijar las células con 1 mL de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos.
4. Lavan las células dos veces con 1 mL de PBS.
5. Se tiñen las células con solución DAPI (100 ng/mL) durante 20 min a temperatura ambiente.
6. Imagen de las células utilizando un microscopio confocal en diferentes lugares y tomando imágenes de z-stack de 400 μm de cada ubicación en 16 pasos de μm. El microscopio utilizado tiene un disco central que permite la proyección de imagen confocal usando una luz blanca, fuente de excitación del arco de la exploración. Utilizar un objetivo de X 20 utilizado con apertura numérica de 0,75.
7. Imágenes de reconstituir.
   1. Abrir imágenes de un gel determinado (alrededor de 25 imágenes) y crear una pila de imagen pulsando en imagen → pila → imágenes para apilar. La primera imagen corresponde a la parte inferior del gel (z = 0 μm), la segunda imagen corresponde al primer paso en la dirección z (z = 16 μm), la tercera imagen corresponde al segundo paso en la dirección z (z = 32 μm). Evaluar cada núcleo en cada profundidad de imagen y designar la profundidad en que el núcleo estaba en el foco más agudo como la profundidad de invasión para ese celular particular.

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Resultados

Hemos utilizado una placa de cultivo de 35 mm con un vidrio inferior y rata de cola colágeno I a desarrollar y optimizar una invasión en vitro 3D análisis de protocolo. Usando este análisis, hemos demostrado eso mama células cancerosas MCF7 y MSC células podrían invadir en el gel de colágeno a una distancia media de 0.04 μm ± 1.8 y 41,3 ± 76.0 respectivamente después de 48 h cuando IGF1 (18,6 ng/mL) fue utilizado como chemoattractant (figura 2

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Discusión

Aquí, describimos un ensayo de invasión vertical invertido simple que es conveniente para una variedad de tipos de células incluyendo las células que son raros o dependiente en su microambiente. En este ensayo de invasión 3D, las células permanecen en su microentorno original y están cubiertas por el gel de colágeno que contiene un chemoattractant. Las células entonces migraran e invaden en el colágeno. En este ensayo, las células pueden ser manchadas y fácilmente monitoreadas en el gel. La simplicidad y repr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective