Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Resumen

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Resumen

Roturas de DNA doble cadena (DSB) son graves lesiones de ADN. Análisis de la formación y reparación de DSB es relevante en un amplio espectro de áreas de investigación incluyendo la integridad del genoma, genotoxicidad, Radiobiología, envejecimiento, cáncer y desarrollo de medicamentos. En respuesta a OSD, la histona H2AX es fosforilada en serina 139 en una región de varios pares de megabase formando discretos focos nucleares detectables por microscopia de la inmunofluorescencia. Además, 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína sensible al OSD importante promover la reparación de DSB por nonhomologous end-joining evitando la recombinación homóloga. Según las funciones específicas de γH2AX y 53BP1, el análisis combinado de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un enfoque razonable para un análisis detallado del OSD. Este manuscrito ofrece un protocolo paso a paso con notas metódicas para la realización de la técnica. Específicamente, se demuestra la influencia del ciclo celular en patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Además, el valor de los focos de γH2AX como un biomarcador es representado en los linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano. Finalmente, se investiga inestabilidad genética en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Introducción

DNA se daña continuamente por endógeno (p. ej., estrés de replicación, especies reactivas de oxígeno, la inestabilidad intrínseca del ADN) y exógenos (por ejemplo, los radicales químicos, irradiación) fuentes (figura 1)^{1,2 ,3,4}. Entre los daños en el ADN, roturas de DNA doble cadena (DSB) son particularmente graves lesiones y pueden inducir la muerte celular o carcinogénesis. Cerca de 50 OSD puede surgir por célula y ciclo celular⁵. En células de mamífero, recombinación homóloga (HR) y nonhomologous end-joining (NHEJ) desarrollados como principales vías para la reparación de DSB (figura 2). HR se produce en la fase de finales S/G2 y utiliza una hermana intacta cromátide como plantilla para la reparación potencialmente libre de errores. En comparación, el NHEJ es activa durante todo el ciclo de la célula y potencialmente mutagénicos como pares de bases puede ser añadidos o resecados antes de la ligadura de los extremos rotos. Además, unirse a final alternativo se podrá contratarse como un mecanismo de lenta reparación mutagénica de respaldo en caso de deficiencia NHEJ^6,7.

DSB inducen la fosforilación de la histona H2AX en 139 de serina en una región de varios megabase pares alrededor de cada OSD. Los focos nucleares formando se denominan focos de γH2AX y son detectables por inmunofluorescencia microscopia⁸. ΓH2AX promueve el reclutamiento de proteínas más sensible al OSD y participa en la remodelación de la cromatina, la reparación del ADN y de transducción de señal⁹. Como cada enfoque γH2AX se considera representar un OSD único, la cuantificación del OSD por microscopia de la inmunofluorescencia es posible, que se ha demostrado en líneas celulares de cáncer y muestras de los pacientes^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína clave en la mediación reparación DSB. Está implicado en el reclutamiento de DSB-responsivo proteínas, puesto de control las señales y la sinapsis de OSD extremos¹⁵. Además, 53BP1 desempeña un papel fundamental en la elección de vía de reparación DSB. Activa la reparación de DSB hacia NHEJ mientras que HR es prevenido¹⁶. Teniendo en cuenta las funciones originales de γH2AX y 53BP1 en reparación DSB, el análisis simultáneo de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un método útil para el análisis exacto de la formación y reparación de DSB.

Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para realizar microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 en núcleos celulares. Específicamente, la técnica se aplica en fibroblastos normales de la línea celular NHDF, en linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano y en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda. Los detalles del método se señalan en el contexto de los resultados presentados.

Protocolo

todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el II Comité de ética de la Mannheim facultad médica de la Universidad de Heidelberg. Escrito el consentimiento informado fue obtenido de todos los individuos.

1. preparación de materiales

1. solución anticoagulante: Prepare una solución anticoagulante de 200 U.I. heparina / mL en cloruro de sodio 0.9%. Llenar cada uno de los tubos de colección (dibujar volumen 9 mL) con 2 mL de la solución anticoagulante antes de retiro de las muestras de sangre o médula ósea.
2. Solución de lisis de glóbulos rojos: preparar el 10 x solución de lisis de eritrocitos con 82,91 g de cloruro de amonio, bicarbonato de amonio 7,91 g y 2 mL de 0,5 M solución de ácido etilendiaminotetraacético a un pH de 8.0 mediante la disolución de los agentes en doble y agua destilada para un volumen total de 1 L.
3. Solución de fijación: 8.3 Añadir μl de una solución de hidróxido de potasio de 1 M a paraformaldehido (PFA) de la 360 mg en un tubo de microtitulación. Llenar el tubo con tampón fosfato salino (PBS) hasta la marca de 1 mL del tubo y el tubo en un bloque calefactor a 95 ° C para obtener 1 mL de una solución PFA 36% del calor. Transferir la solución PFA de 36% 1 mL a un tubo con una capacidad de 15 mL. Añadir 8 mL de PBS a la solución 1 mL para el PFA de 36%, a 9 mL de una solución madre de PFA 4%. Alícuota de la solución madre de PFA 4% y almacenar a-18 ° C hasta que utilizan para la fijación de las células.
   PRECAUCIÓN: 1) Potasio hidróxido en solución es corrosivo. Ser conscientes de la protección cutánea y ocular. 2) PFA es carcinogénico. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Preparar la solución de fijación bajo una campana de.
4. Solución de permeabilización: añadir 50 μl Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obtener una solución de aproximadamente 0.1% Octoxinol 9.
5. Bloqueo de solución: Prepare 5% y 2% bloqueo soluciones mezclando el agente bloqueador de proteínas con PBS y tienda en 6 – 8 º C.

2. Preparación de las muestras

1. fibroblastos en cultivo celular: cultivar fibroblastos humanos de la línea celular NHDF en humidificado 5% CO ₂ ambiente a 37 ° C en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 4 mM glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina.
   1. Preparación de portaobjetos de un microscopio con adherente fibroblastos
      1. Retire el medio del frasco (área de crecimiento 75 cm ²) con el exponencial crecimiento fibroblastos NHDF. Añadir 10 mL de PBS en el matraz. Lavar los fibroblastos adherentes suavemente agitando manualmente el matraz durante 1 minuto
      2. Quitar el PBS y añadir tripsina 1 mL en el matraz. Agite el frasco suavemente para asegurarse de que todas las células adherentes son cubiertas por la tripsina. Retire el matraz a la tripsina. Poner el matraz en la incubadora durante 5 min a 37 ° C.
      3. Tomar el frasco de la incubadora y añada 10 mL de RPMI 1640 medio en el matraz. Pipeta el medio arriba y abajo varias veces para dispersar a los fibroblastos.
      4. Pipeta 0,3 mL de los fibroblastos dispersos en cada uno de los dos campos del portaobjetos y colocar la corredera en la incubadora durante 24 h para que los fibroblastos se adhieren a la diapositiva. Para la inmunotinción de γH2AX y 53BP1 en los núcleos de los fibroblastos, pasar al paso 3.1.
2. Las muestras de pacientes
   1. las muestras de sangre: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante y añadir 7 mL de sangre en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3).
   2. Las muestras de médula ósea: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante (paso 1.1) y añadir 7 mL médula en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3). Utilizar microesferas de CD34 y células columnas de separación para el aislamiento de células CD34 +.
   3. Aislamiento de células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad
      Nota: Las células mononucleares son aisladas de muestras de médula ósea y sangre por centrifugación del gradiente de densidad ^{17 , 18 , 19}.
      1. Diluir la muestra de sangre heparinizada en una proporción de 1:1 con PBS y la muestra de médula ósea heparinizada en una proporción de 1:3 con PBS. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces.
      2. Añadir un volumen de densidad gradiente medio a un tubo nuevo. Suavemente la capa diluida sangre o médula ósea en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no para mezclar las dos capas.
      3. Centrifugar el tubo durante 30 min a temperatura ambiente y x 400 g. extraer la capa superior de plasma con la pipeta. Luego cosechar cuidadosamente las células mononucleares en la capa por encima de la media de gradiente de densidad. Transferencia de las células mononucleares en un tubo fresco.
      4. Agregar por lo menos tres volúmenes de PBS a las células mononucleares en el tubo. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces. Centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x
      5. Después de la vuelta, quite el sobrenadante y añadir 10 mL de 4 ° C, 1 x solución de lisis de glóbulos rojos. Resuspender suavemente las células por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos. Añada 30 mL de PBS a 4 ° C y centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x
   4. Preparación de los cytospins
      1. preparar dos cytospins con células mononucleares de las muestras del paciente (es decir, un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y uno cytospin para γH2AX y 53BP1 combinado de tinción de inmunofluorescencia) por centrifugación (300 x g, 10 min) de 1.0 x 10 ⁵ células para cada preparación ( figura 3 y 4).

3. γH2AX y 53BP1 tinción de inmunofluorescencia

1. fijación y permeabilización: fijar las células con 200 μL de 4% PFA durante 10 minutos. Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS durante 5 minutos en un agitador de laboratorio. Luego permeabilizar las células con 200 μL de 0,1% Octoxinol 9 durante 10 minutos lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de solución de bloqueo de 5% por 5 min en un agitador de laboratorio. Bloquear las células en 30 mL de dulce 5% bloquea la solución 1 h.
2. Incubación con los anticuerpos
   1. incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y un policlonales anti-53BP1 anticuerpos (1: 500) durante la noche a 4 ° C.
   2. Después de incubación lavado las células suavemente 3 veces con 30 mL de solución de bloqueo del 2% por cada 5 min en un agitador laboratorio.
   3. Quitar la solución de bloqueo e incubar la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario de cabra Alexa488 conjugado anti-ratón (1: 500) y la segunda preparación de las células con una cabra Alexa488 conjugado anticuerpo secundario anti ratón ( 1: 500) y un burro Alexa555 conjugado anti-conejo de anticuerpo secundario (1: 500) por 1 h a temperatura ambiente.
3. Medio de montaje: poner la diapositiva con las células en un bol y lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS por cada 5 min en un agitador de laboratorio. Retirar el PBS y Monte las células con medio de montaje que contiene 4, 6-diamidino-2-phenylindole. Poner cuidadosamente un cubreobjetos sobre el medio de montaje para que burbujas de aire no son incrustado. Esperar al menos 3 h para endurecer el de medio de montaje antes de analizar las células por microscopía de fluorescencia.

4. Análisis de γH2AX y 53BP1 focos

1. microscopía de fluorescencia: analizar los focos γH2AX y 53BP1 en los núcleos de la célula con un microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante proyección de imagen en un objetivo de X 100 Ampliación. Grabar imágenes con una cámara y procesar las imágenes con software de imagen apropiado.

Resultados

Análisis de los focos de γH2AX en las células es más precisa en la fase G0/G1 y el G2 fase cuando γH2AX focos aparecen como puntos fluorescentes distintas (figura 5A). En contraste, análisis de focos de γH2AX en las células durante la fase S se complica con puntos dispersos γH2AX pan-nuclear causados por el proceso de replicación (figura 5B).

Fijación de las ...

Discusión

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de la formación y reparación de DSB en un amplio espectro de áreas de investigación. Los parámetros críticos que influyen en el resultado de los experimentos son la fase del ciclo celular, los agentes utilizados para la fijación y permeabilización de las células, la elección de los anticuerpos y el hardware y el software del microscopio de fluorescencia.

La influencia del ciclo celular en pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software