Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Resumen

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína son mecanismos fundamentales de transmisión transducción de señales en procesos celulares más; por lo tanto, la identificación de pares de interacción novedosa proteína-proteína y monitoreo de dinámicas de interacción de la proteína son de particular interés para revelar cómo las plantas responden a factores ambientales o señales de desarrollo. Una plétora de enfoques se han desarrollado para examinar las interacciones de proteínas, ya sea in vitro o en vivo. Entre ellos, la complementación de luciferase recientemente establecido imaging (LCI) es el método más simple y rápido para demostrar en vivo las interacciones proteína-proteína. En este ensayo, la proteína A o proteína B se fusiona con la mitad terminal amino o carboxilo terminal de la luciferasa, respectivamente. Cuando proteína interactúa con la proteína B, las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para formar una enzima luciferasa funcional y activo. Actividad de luciferasa puede grabarse con una cámara CCD o un luminómetro. En comparación con otros enfoques, el análisis LCI muestra las interacciones proteína-proteína cualitativa y cuantitativamente. Infiltración de Agrobacterium en hojas de Nicotiana benthamiana es un sistema ampliamente utilizado para la expresión transitoria de proteínas. Con la combinación de LCI y expresión transitoria, estos enfoques demuestran que la interacción física entre COP1 y SPA1 fue reducida gradualmente después del tratamiento del jasmonate.

Introducción

Con el fin de coordinar crecimiento con su entorno, las plantas han evolucionado elegante vías de señalización para sentido, transducir y responder a señales de señalización. Como los corredores en una carrera de relevos, las proteínas son necesarias en transduction de la señal de planta. Ha sido ampliamente reconocido que la interacción proteína-proteína (PPI) desempeña un papel importante para la comunicación celular. Degradación, acetilación y fosforilación de la proteína son todas dependen de la interacción física entre una proteína diana y sus enzimas de modificación. Por ejemplo, Jasmonate ZIM-dominio proteína (JAZ) familia proteínas interactúan con el factor de transcripción MYC2 y suprimen su actividad transcripcional^1,2. Dada la importancia de PPI, proteína a gran escala han sido interactomes en las plantas exploradas recientemente^3,4,5. Estos resultados del interactoma más revelan la compleja red de regulación que coordina diversas funciones celulares.

Hay algunos enfoques establecidos para el seguimiento PPI. La levadura dos híbridos (Y2H) es el método más ampliamente utilizado para la detección de PPI. Y2H es fácil de realizar y adecuado para una prueba rápida examinar las interacciones entre proteínas. Y2H es también ampliamente utilizado para la detección de socios desconocidos de la interacción de la proteína de interés específico. Sin embargo, porque Y2H se realiza enteramente en la levadura, no puede reflejar la situación real en la planta las células y aporta altos falsos positivos. Otra estrategia similar es el análisis pull-down. En general, dos proteínas son expresadas y purificadas de células de Escherichia coli mezcladas e inmovilizadas para la detección de las interacciones entre proteínas. Aunque este método no es desperdiciador de tiempo, que no puede obtener en vivo resultados de interacción ya sea. Para propósitos de interacción en vivo , co-inmunoprecipitación (co-IP) es el ensayo más popular, que requiere de anticuerpos de alta calidad para immunoprecipitate el proteína de interés y no se puede excluir la posibilidad de IBP indirectas. Por otra parte, debido a los complicados procedimientos experimentales en co-IP, los resultados generalmente varían con cada experiencia.

Ensayos de reconstitución de reportero basado en avanzarán enormemente la detección de en vivo PPI. Estos métodos incluyen la fluorescencia de resonancia energética transferencia (traste)⁶, bimolecular de la fluorescencia complementación (centro)⁷y la complementación de la luciferasa de luciérnaga (LCI) ensayo⁸la proyección de imagen. Aunque estos tres enfoques son mejor que co-IP directa en vivo PPI, FRET y centro necesitan microscopios específicos para detectar señales de fluorescencia y fácilmente no pueden cuantificar la intensidad de la interacción. Por el contrario, LCI aprovecha de luciferasa de la luciérnaga, que brillará después de reaccionar con su luciferin del substrato. Más importante aún, intensidad PPI puede determinarse el valor de actividad de luciferasa. Así, LCI no sólo indica si dos proteínas interactúan o no, sino que también proporciona información sobre la dinámica de interacción sobre el tratamiento. Aunque hay algunos métodos establecidos para el seguimiento de la interacción dinámica (basada en plasmones resonancia o estabilidad terma turnos)^9,10, estos enfoques requieren instrumentos delicados o etiquetado específico. En cambio, es más fácil de realizar y detectar LCI.

El principio de LCI es que las mitades amino terminal y carboxilo-terminal de luciferasa (denominado N-Luc o C-Luc, respectivamente) fueron fusionados con la proteína A y B y estas dos proteínas al mismo tiempo se expresaron en las células vegetales la fusión. Si protein A interactúa con la proteína B, entonces las dos mitades del luciferase serán reconstituidas para ser una enzima luciferase activo. Actividad de luciferasa puede detectarse con un luminómetro o una cámara CCD. No es necesario obtener transformantes estables para LCI; expresión transitoria es suficiente para obtener un resultado de la interacción de alta calidad.

ANILLO tipo E3 ubiquitina ligasa constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interactúa con un gran número de factores de transcripción y promueve su degradación por el proteosoma 26S del¹¹. Algunos de estos factores de transcripción dirigido por COP1 son reguladores positivos para photomorphogenesis. En la oscuridad, COP1 interactúa con supresor de fitocromos A-105 1 (SPA1), que mejora la COP1 E3 actividad⁸. Después de la percepción de la luz, fotorreceptores abrogan la interacción COP1-SPA1 para inhibir la actividad de COP1 y luego estabilizar COP1 sustratos^12,13,14. Este ejemplo ilustra la importancia biológica de PPI de estudiar y determinar la dinámica PPI.

Protocolo

1. preparación de plantas (8 semanas)

1. Poner 50 semillas de Nicotiana benthamiana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de 5% NaClO y solución al 0,1% Tritón X-100 (V/V) y licencia para 5 min esterilizar las semillas.
2. Enjuagar las semillas con agua estéril 5 veces y suspender las semillas en 200 μL de agua estéril.
3. Cuidadosamente lugar semillas individuales sobre la superficie del medio de MS-agar (1 L: 1 x sales de Murashige y Skoog, sacarosa 10 g, pH 5.8 (KOH), agar al 1%) con puntas finas y placas de medio de almacén en 4 ° C por 3 días sincronizar la germinación.
   Nota: Para evitar la contaminación del microbio, realice este paso en una mesa de trabajo limpia. No es necesario agitar el tubo durante la esterilización.
4. Colocar placas de medio bajo condiciones de crecimiento normal (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 blanco intensidad de la luz) durante 10 días y entonces transfiera las plántulas germinadas en el suelo.
   Nota: Asegúrese de que insertar las raíces de las plántulas en suelo y no dañar las raíces. Cubrir la bandeja con una cubierta de plástico transparente durante la noche para mantener la humedad.
5. Crecer las plantas en una habitación de crecimiento controlado a una humedad de ciclo y el 70% de 16 h a 8 h luz/oscuridad. 7 semanas de edad las plantas de N. benthamiana están listas para Agrobacteriumtumefaciens de infiltración (figura 1A).
   Nota: Plantas de agua y control de plagas según sea necesario para mantener las plantas sanas.

2. transitoria expresión en hojas de N. Benthamiana (7-10 días)

1. Entregan 150 ng de plásmidos (plásmido control pEGAD-HA-LUC y vacía vector plásmido construido para LCI de ensayo, en este caso hemos utilizado pCAMBIA1300-Nluc y pCAMBIA1300 Cluc para la construcción de plásmidos) en a. tumefaciens célula competente cepa GV3101 con un método de electroporación estándar.
2. Cultura a. tumefaciens en Luria-Bertani (LB) agar medio (1 L: 10 g NaCl, extracto de levadura 5 g, 10 g de triptona, agar 1,5%) que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina a 28 ° C durante 4 días.
   Nota: La elección de los antibióticos depende del vector y la cepa de a. tumefaciens empleada.
3. Inocular una sola Colonia de a. tumefaciens de cada placa en 3 mL de medio líquido LB que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina y agitar a 220 rpm a 28 ° C durante 24 h propagar el cultivo celular.
4. Transferencia de 75 μl de cultivo bacteriano en 15 mL LB líquido medio fresco que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina, diluyéndolo en un factor de 200. Cultura de las bacterias a 220 rpm a 30 ° C por cerca de 8 horas, hasta OD₆₀₀ es entre 0.5 a 1.0.
5. Transferir el cultivo líquido de a. tumefaciens en tubos de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 4.000 x g y 4 ° C por 15 minutos, descartar el sobrenadante y suspender la pastilla en 15 mL de solución de transformación para lavar el pellet.
6. Girar el tubo a 4.000 x g y 4 ° C por 15 min y descarte el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más.
7. Resuspender el precipitado en 5 mL de solución de transformación y mantener durante 2 h a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de a. tumefaciens pelotilla células con solución de transformación hasta que la concentración final de OD₆₀₀ es 0,5, o mezcla de dos muestras con igual volumen de interacciones de proteínas apareadas prueba.
8. Infiltrar las células suspendidas en el 4^th a 7 hojas de^th con una jeringa sin aguja 1 mL (figura 1B-C). Después de la infiltración, cubrir las plantas inmediatamente con una cubierta de plástico negro y coloque la bandeja en la oscuridad durante 12 h. Después de eso, crecen las plantas como de costumbre para 2 a 4 días antes de detectar actividades LUC.
   Nota: Elija hojas sanas de tamaño similar. La infiltración de cuatro zonas diferentes en una hoja es fina.

3. detección de actividad de luciferasa (un día)

Nota: Hay dos formas de controlar la actividad de luciferasa. Uno se basa en la proyección de imagen, y el otro es para medir cuantitativamente la actividad de luciferasa.

1. Método de proyección de imagen
   1. Separar una hoja infiltrada y el folleto entero en medio MS-agar.
   2. Tampón sobre la superficie adaxial de la hoja con un atomizador de 50 mL en spray luciferin trabajo. Mantener los materiales en la oscuridad durante 5 minutos apagar el auto fluorescencia de la clorofila.
   3. Utilizar un CCD refrigerado por poca luz imagen aparato (enfriado a-30 ° C) para capturar imágenes (figura 2). El tiempo de exposición presentado por luz es 50 ms, y tiempo de detección de luminiscencia es de 1 minuto.
      Nota: Ajuste los parámetros según el manual de la máquina. Temperaturas más bajas mejorarán la relación señal-ruido para mejorar la calidad de la imagen.
2. Por otra parte, medir luminiscencia directamente con un luminómetro comercial.
   1. Recortar fragmentos de la hoja (aproximadamente 0,25 cm²) de la zona de infiltración de las hojas de N. benthamiana y cuidadosamente sumerja el disco de hoja en 100 μl de agua desionizada en una placa de 96 pocillos blanca (figura 3).
   2. Añadir 10 μl de tampón de trabajo luciferin y dejar durante 5 minutos. Realizar tratamientos específicos para estudiar la dinámica de interacción de la proteína.
      Nota: Detectar la luminiscencia con un luminómetro en diferentes puntos temporales para obtener la dinámica actividad de luciferasa, que representan la cinética de las interacciones proteína-proteína bajo cierto tratamiento. Este método tiene ventajas para las pruebas de un gran número de pares de proteínas simultáneamente. Para aquellos sin un luminómetro comercial, examinar la concentración de proteína luciferase por western blot, por lo tanto se refieren a la posible actividad LUC. Si la luz no es necesaria, sólo mantener la placa en el luminómetro y medir luminiscencia en diferentes puntos temporales. De lo contrario, mueva la placa en una cámara de crecimiento durante el espacio de detección. Para obtener resultados estadísticamente significativos, utilizar al menos tres réplicas biológicas. Aunque varían las actividades LUC de zonas de infiltración diferentes, sus patrones de cambio son constantes después de la normalización.

Resultados

Tres pasos principales pueden ser singularizados en el presente Protocolo de complementación de la luciferasa para estudiar proteínas interacciones en vivo, incluyendo el crecimiento de las plantas, infiltración de tabaco y el ensayo de luciferasa. El paso más crucial en el presente Protocolo es infiltración de líquido a. tumefaciens en hojas de N. benthamiana (figura 1).

Discusión

El protocolo descrito aquí es simple y reproducible para el estudio en vivo las interacciones proteína-proteína y particularmente conveniente para detectar la dinámica de interacción de la proteína bajo tratamiento exógeno. El paso clave en este ensayo es infiltración de N. benthamiana . Para asegurar el éxito de infiltración, las plantas deben ser muy saludables. Otro factor crítico es cuando verificar actividad de luciferasa después de la infiltración. Existe una respuesta correcta para e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml