Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

Resumen

Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.

Resumen

La presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpo puede causar diversos síntomas neuropsiquiátricos en los pacientes afectados, denominados encefalitis anti-NMDA autoinmune. Detección de los autoanticuerpos específicos contra el receptor NMDA en la sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) es esencial para la diagnosis exacta de esta condición. El receptor NMDA es un ion canal complejo de la proteína que contiene cuatro subunidades, incluyendo dos obligatorio NMDA receptor subunidad 1 (NR1) y uno o dos receptores NMDA 2A subunidad (NR2A), NMDA receptor la subunidad 2B (NR2B) subunidad del receptor NMDA 2C (NR2C), o del receptor NMDA subunidad 2D (NR2D). El epitopo del autoanticuerpo de anti-NMDA receptor se informó a estar presente en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del receptor NMDA. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia celular simple que puede utilizarse como una prueba de cribado para detectar la presencia de autoanticuerpos contra la subunidad NR1 del receptor NMDA en la sangre para facilitar la investigación clínica y básica de encefalitis autoinmune anti-NMDA.

Introducción

Encefalitis anti-NMDA autoinmune es una entidad nuevamente reconocida de enfermedad que puede ocurrir en pacientes de todas las edades y afecta a pacientes predominantemente femenino^1,2. Es una de la encefalitis más frecuentemente diagnosticada entre los pacientes con etiología desconocida inicial de encefalitis³. Los pacientes afectados con encefalitis anti-NMDA generalmente tienen síntomas prodrómicos de fiebre, seguida por el desarrollo rápido de cambio de nivel de conciencia y una variedad de síntomas neuropsiquiátricos agudos, como agitación, irritabilidad o dolor de cabeza , ataques de ansiedad, insomnio, alucinaciones, delirios, agresividad, comportamientos extraños, anormalidades de movimiento, dysregulation autonómico y asimiento^4,5. Reconocimiento temprano de esta condición y el tratamiento oportuno con inmunoterapia son importantes para un mejor resultado y recuperación completa incluso en los pacientes afectados⁶. Por lo tanto, se sugiere que la encefalitis anti-NMDA autoinmune se debe considerar como un importante diagnóstico diferencial de pacientes que presentan con características psicóticas agudas o del nuevo-inicio^7,8.

Además de las características clínicas, la detección de autoanticuerpos contra el receptor NMDA en la sangre o el CSF es esencial para la diagnosis exacta de anti-NMDA receptor encefalitis autoinmune⁹. La mayoría de las pruebas inmunológicas para detectar el autoanticuerpo del receptor anti-NMDA está disponible en algunos laboratorios de investigación^10,11, y hay solamente un análisis de la inmunofluorescencia celular comercialmente disponibles para la detección del anti-NMDA receptores autoanticuerpos¹². El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia de celular interna simple que puede ser utilizado convenientemente en el laboratorio para detectar la presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpos para facilitar la investigación clínica del receptor anti-NMDA encefalitis autoinmune. El receptor NMDA es un heterotetrámero ion canal complejo de la proteína expresado específicamente en el cerebro. Se hace de dos subunidades NR1 obligatorias y la combinación de una o dos subunidades de NR2A, NR2B, NR2C o NR2D¹³. Un estudio informó que el epitopo principal blanco de los anticuerpos fue en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del⁵. Por lo tanto, en este protocolo, expresa la proteína recombinante humana de la subunidad NR1 del receptor NMDA con proteína verde fluorescente (GFP) en la línea de células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293) la etiqueta de y desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia basadas en células para detectar la clase IgG de autoanticuerpos del receptor de anti-NMDA en la sangre.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital en Linkuo, Taoyuan, Taiwán (102-2577A3).

1. preparación del plásmido de expresión de GFP NR1

1. Mezcla 10 ng de plásmido NR1-GFP con 100 μl de cepa de células competentes de Escherichia coli DH5α de 1,5 mL estéril y centrifugar el tubo, pipetear la mezcla suavemente hasta 4 - 6 veces e incubar el tubo en hielo por 20 min.
2. Incubar el tubo a 42 ° C por 1 min en un baño de agua, retire el tubo del baño María, añada 1 mL Lisogenia caldo (LB) medio en el tubo e incubar el tubo a 37 º C en una incubadora con agitación durante 1 hora.
3. 50 μl de la mezcla en una placa de agar LB con ampicilina (0,1 mg/mL) se difundió e incubar la placa de agar LB a 37 ° C en una incubadora durante una noche.
4. Escoger una sola Colonia de la placa de agar LB durante la noche mediante una punta estéril y agitar la punta en un en un tubo de cultivo bacteriano que contiene 5 mL de medio LB y ampicilina (0,1 mg/mL). Incubar el tubo a 37 º C en una incubadora con agitación durante la noche.
5. Alícuota 3 mL del cultivo bacteriano durante la noche en un matraz de 500 mL que contiene 250 mL estéril LB medio y ampicilina (0,1 mg/mL). Incube el frasco a 37 ° C con agitación. Compruebe regularmente la densidad óptica (OD) de la cultura bacteriana en la longitud de onda de 600 nm, utilizando un espectrómetro hasta la OD600 0.6-1.0.
   Nota: Mezcle bien 800 μl de la cultura bacteriana durante la noche con 200 glicerol μL para preparar el stock de glicerol y almacenar el stock de glicerol debajo de-80 ° C para su uso futuro.
6. Preparación de plásmido de expresión de GFP NR1 de la cultura bacteriana de 250 mL
   1. Recoger las células por centrifugación a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
   2. Resuspender el precipitado de las bacterias en buffer de resuspensión de 10 mL conteniendo Rnasa A; vórtice completamente hasta que no se ven grumos.
   3. Añadir 10 mL de tampón de lisis a la suspensión bacteriana, suavemente invierta la mezcla 4 - 6 veces e incubar el lisado a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos.
   4. Añadir 10 mL de tampón de precipitación previamente enfriada a lisado, invierta suavemente la mezcla 4 - 6 veces.
   5. Vierta el lisado en el cañón de un cartucho de filtro con la tapa esperar 10 min a TA.
   6. Quite la tapa de la boquilla de salida del cartucho, inserte un émbolo del cartucho y empuje suavemente el émbolo. Recoger el filtrado lisado en un tubo de 50 mL.
   7. Añadir 2,5 mL propiedad tampón del fabricante para el filtrado lisado, mezcle la mezcla invirtiendo el tubo aproximadamente 10 veces e incubar la mezcla en hielo durante 30 minutos.
   8. Aplique la mezcla filtrada de lisado a una columna de filtro que fue previamente equilibrada con 10 mL de tampón de equilibrado. Deje que la columna de desagüe por gravedad.
   9. Lavar la columna con tampón de lavado 30 mL dos veces y luego eluir el ADN de la columna con 15 mL de tampón de elución.
   10. Agregar isopropanol de 10,5 mL (0,7 volúmenes) en el búfer de ADN eluído, mezclar bien y centrifugar la mezcla a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
   11. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y lavar el pellet de ADN con etanol al de 70% libre de endotoxina 5 mL una vez, Centrifugue a 20.000 x g durante 10 minutos.
   12. Decantar el sobrenadante y secar el pellet por 5-10 min en una campana química, disolver el pellet en 300-500 μl de tampón libre de endotoxinas.
   13. Determinar la concentración de plásmido mediante la medición de la absorción de la solución en UV 260/280 nm usando un espectrofotómetro.
       Nota: Prepare el plásmido de expresión de GFP utilizando el mismo protocolo.

2. transfección de células HEK293 con el plásmido de expresión de GFP NR1

1. Alícuota 200 μL de solución 2% de gelatina a cada pozo de una placa de 48 pozos cultura e incubar la placa a 37 ° C durante al menos 30 minutos.
2. Aspire la solución de gelatina de las células 5 x 10⁴ HEK293 bien y semillas en 200 μL de medio de cultivo celular que contenga 10% suero bovino fetal (FBS) en cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada provista de 5% CO₂ durante la noche.
   Nota: Las células se cuentan usando un hemocitómetro.
3. Al día siguiente, reemplazar el gastado medio de cultivo con 200 μL de medio de cultivo fresco que contiene 10% FBS por pozo.
4. Para cada individual, preparar solución A mezclando 100 ng de plásmido tGFP NR1 con 20 μl de medio de cultivo y B una solución mezclando 0,8 μl de reactivo de transfección con 20 μl de medio de cultivo. Multiplique al número de pozos necesarios para preparar el volumen total para cada experimento.
5. Preparar la solución C por mezclar solución A y solución B e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 minutos.
6. Alícuota de 40 μl de la solución C a cada bien que contiene las células HEK293, agitar la placa suavemente e incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada provista de 5% CO₂ durante la noche.
7. Comprobar la expresión de proteína recombinante NR1-GFP en las células hospedadoras bajo microscopio con 40 aumentos X-200 de fluorescencia (excitación/emisión: 482/502 nm) y proceder a lo análisis de la inmunofluorescencia celular.
   Nota: Transfectar el plásmido de expresión GFP en las células HEK293, usando el mismo protocolo.

3. Análisis de la inmunofluorescencia basadas en células

1. Aspire el medio gastado de los pozos, luego lave cada pocillo con 200 μL de fosfato tampón salino (PBS) tres veces.
2. Añadir 200 μL de solución de paraformaldehído al 4% a cada pocillo; Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos.
3. Aspirar la solución de paraformaldehído de los pozos y lave cada bien con 200 μL de PBS tres veces.
4. Añadir 200 μL de 10% de leche descremada en SAFT (0,1% Tween-20 en PBS) solución a cada pozo, incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave.
5. Aspirar el 10% de leche descremada en la solución de SAFT desde el pozo, luego lavar los pocillos con 200 μL de SAFT una vez.
6. Incube los pocillos con plasma diluido (1: 100 en SAFT) como el anticuerpo primario con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 hora.
   Nota: El Plasma se obtiene de la sangre de pacientes sospechados para tener encefalitis autoinmune.
7. Aspire el plasma diluido de los pozos y lave cada bien con 200 μL de SAFT tres veces.
8. Añadir 200 μL de antihumano de cabra IgG conjugado con Alexa Fluor 594 (1:1, 000 dilución en SAFT) a cada pocillo e incubar la placa de cultivo a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora.
9. Aspirar el antihumano de cabra IgG conjugado con Alexa Fluor 594 solución y lavar cada pozo con 200 μL de SAFT tres veces.
10. Añadir 100 μl solución de glicerol (glicerol al 50% en PBS y 1: 100.000 de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) a cada pocillo.
11. Observar y las células bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un 10 X ocular y 4 X, 10 X y 20 X objetivos de imagen.
    Nota: Utilizar el filtro correcto para cada tinte: para NR1-GFP (excitación/emisión = 482/502 nanómetro), para Alexa Fluor 594 (excitación/emisión = 561/594 nm), para DAPI (excitación/emisión = 358/461 nm). Realizar el control negativo utilizando las células HEK expresan la GFP de la misma manera.

Resultados

En promedio, podríamos obtener 200-300 μg plásmido de expresión libre de endotoxina NR1-GFP y GFP de cultivo bacteriano 250 mL siguiendo los procedimientos descritos en la sección 1 del protocolo. Una cantidad de 100 ng/pozo del plásmido de expresión se utilizó para la transfección de las células HEK293, cultivado en la placa de 48 pozos, como se describe en la sección 2 del protocolo. 24-30 h después de la transfección, las células expresan el NR1-GFP y se pudieran detectar...

Discusión

Hay varios ensayos inmunológicos celulares para detectar la presencia de autoanticuerpos contra el receptor NMDA, divulgado en la literatura, incluyendo inmunofluorescencia celular vivo ensayo¹¹, fijada de análisis de la inmunofluorescencia celular⁹ , y basados en la citometría de flujo ensayo¹⁴. El análisis de la inmunofluorescencia celular vivo debe realizarse poco después de la preparación de las células ectopically expresaban la proteína ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit