Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

Resumen

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Resumen

El sistema de expresión transitoria del gen es una de las tecnologías más importantes para la realización de análisis funcionales de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. Este sistema fue desarrollado para extranjeros expresan genes bajo el control del promotor baculovirales en plásmidos de expresión transitoria. Además, este sistema puede aplicarse a un análisis funcional de proteínas extrañas o baculovirus sí mismo. El sistema de expresión transitoria del gen más ampliamente y comercialmente disponible se desarrolla basado en el promotor de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Sin embargo, se observó un nivel de baja expresión de genes foráneos en células de los insectos. Por lo tanto, un sistema de expresión transitoria del gen fue construido para mejorar la expresión de la proteína. En este sistema, plásmidos recombinantes fueron construidos para contener la secuencia de destino bajo el control del Drosophila calor choque 70 (Dhsp70) promotor. Este protocolo presenta la aplicación de este calor basado en el choque pDHsp/V5-su (epitope V5 con 6 histidina)Spodoptera frugiperda Handy sistema (células sf9); Este sistema está disponible no sólo para la expresión de genes sino también para la evaluación de la actividad de anti-apoptotic de candidato proteínas en células de los insectos. Además, este sistema puede ser bien transfectado con un plásmido recombinante o transfected Co dos plásmidos recombinantes potencialmente funcionalmente antagónicos en células de los insectos. El protocolo demuestra la eficacia de este sistema y proporciona un caso práctico de esta técnica.

Introducción

Dos sistemas de expresión de proteínas se han utilizado comúnmente para la producción de proteínas: sistemas de expresión de proteínas de célula procariota (sistema de expresión de genes deEscherichia coli ) y sistemas de expresión de proteínas eucariotas. Un sistema de expresión de proteínas eucariotas popular es la expresión del baculovirus vector sistema (BEVS)¹. Primero se utilizaron los baculovirus como agentes de control biológico en todo el mundo de la agricultura y las plagas del bosque. En las últimas décadas, baculovirus fueron desarrollados como herramientas biotecnológicas para vectores de la expresión de la proteína así. Los genomas de baculovirus consisten en ADN circular de doble hebra y envuelta nucleocápside². Hasta la fecha, más de setenta y ocho baculovirus aislados han sido secuenciados³. Basado en la cascada de temporal expresiones baculovirales gene en las células del insecto huésped, la transcripción del gen podría clasificarse en cuatro cascadas temporales, incluyendo inmediata temprana, genes retrasado-temprano, tarde y muy tarde⁴.

BEVSs fueron señalados para que los promotores de genes muy tarde (es decir, poliedro o p10 promotor) fueron utilizados para conducir los genes de la blanco, mientras que el baculovirus recombinante fue generada por recombinación homóloga. Expresión de proteínas extrañas en las células de los insectos por baculovirus recombinante es similar a la de proteínas de mamíferas en modificaciones post-traduccionales (adecuadas para la producción de glicoproteínas). Así, el baculovirus ha sido ampliamente utilizado^5,6,7. Sin embargo, una limitación es la presencia de diferentes vías de N-glicosilación en células de insecto⁷.

Por lo tanto, se desarrolló un nuevo sistema de expresión de baculovirus, el sistema de expresión transitoria del gen. Este sistema expresa genes extranjeros en la unidad de promotores inmediata temprana baculovirales (promotor deie-1 ) en células de los insectos. Mediante este sistema, la proteína diana puede expresarse inmediatamente bajo el control del promotor es decir-1 mientras modifica el camino de N-glicosilación en células de los insectos, resultando en mejor oligosacáridos N-ligados⁷. Por otra parte, genes inmediatos tempranos baculovirales están transcritos por la polimerasa II del RNA de la célula huésped y no requieren ningún factor viral para activación⁴. Por lo tanto, las proteínas extranjeras pueden expresarse en células de los insectos dentro de poco tiempo. Hasta la fecha, el transitorio sistema de expresión del gene es una de las más importantes tecnologías para realizar análisis funcional de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. El sistema se puede aplicar para analizar la función de baculovirus o proteínas extrañas. Uno de los sistemas de expresión génica transitoria disponible comercialmente se basa en los promotores de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 y OpIE1 promotores).

Sin embargo, el menor nivel de expresión de genes foráneos en células de los insectos es todavía un problema cuando el sistema de expresión de gen transitoria basada en promotor de OpIE fue usado^8,9,10. Por lo tanto, otro sistema de expresión transitoria del gen fue construido basado en el promotor de la Drosophila calor choque proteína 70 (hsp70) gen^8,9. El promotor de la hsp70 funciona más eficientemente que el promotor baculovirales IE cuando inducida por choque del calor en células de los insectos¹⁰. En este sistema, los genes de la blanco se expresaron bajo la impulsión de 70 (Dhsp70) promotor de Drosophila calor choque. Genes foráneos pueden clonarse fácilmente en el plásmido de expresión génica transitoria por métodos de clonación basados en PCR. Además, el control de la sincronización para expresión génica puede realizarse por la inducción del choque de calor.

En este informe, seguir el enfoque y expresar tres diferentes truncamientos del gen baculovirales (inhibidor de la apoptosis 3, iap3 de Monacha xylina MNPV) mediante el sistema de expresión de proteína de choque transitorio de calor y más se aplican estas proteínas expresadas en el análisis de la actividad anti-apoptótica. Este sistema tampoco puede expresar las proteínas extranjeras rápidamente o ser más aplicado a la evaluación de la actividad de la proteína anti-apoptótica en las células sf9, teniendo también la posibilidad de ser aplicado a otros ensayos de actividad de la proteína.

Protocolo

1. preparaciones

1. Cultivo de células de insecto
   1. Preparar 50 mL de medio de cultivo celular. Para ello, Añadir 500 μl de antibióticos (anfotericina B = 0,25 μg/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina 100 μg/ml) y 5 mL de suero bovino fetal inactivado con calor en medio de cultivo celular sin suero (sin FBS o antibióticos).
      Nota: Calentar el suero fetal bovino a 65 ° C por 30 min en un baño de agua antes de su uso.
   2. Mantener Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), células de insecto sf9. Separar aprox. 80% de las células del frasco de 25 cm² de la célula cultura agitando el frasco y comprobar bajo microscopia ligera. Luego, transferir el 50% de la suspensión de células a un nuevo frasco de cultura 25 cm² de la célula y permitir a las células a conectar durante 15 min a temperatura ambiente. Reemplazar el medio con 5 mL medio de cultivo de células frescas y crecer en una incubadora a 28 ° C. Células de paso cada 2 a 3 días dependiendo del crecimiento de la célula.
2. Preparación de plásmidos para la transfección de la célula
   1. Insertar los fragmentos de la DNA de la blanco (e.g., Monacha xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene y sus construcciones de eliminación) en pDHsp/V5-su polimerización en cadena-basado clonación método¹¹. Comprobar el crecimiento de colonias transformadas por Colonia PCR usando PCR Master Mix (2 X) y la cartilla de pDhsp-F2/Op-IE2R preparada. Servicio de secuenciación comercial para confirmar las secuencias del plásmido.
      Nota: La tabla 1 enumera los cebadores para PCR y las construcciones correspondientes.
   2. Cultura única secuenciadas colonias bacterianas, que contienen construcciones citado plásmido (paso 1.2) en 200 mL LB que contiene medio seleccionan antibióticos (50 μg/mL), respectivamente.
   3. Extraiga la plásmidos de la culta e. coli mediante Midi Plasmid Kit según instrucciones^{12 del fabricante}.
3. Preparar medio de placas mediante la mezcla de 1,5 mL de medio de cultivo celular y 8,5 mL de medio de cultivo celular sin suero.
4. Preparar medio de cultivo celular de actinomicina D (ActD) agregando 1.5 μl de caldo ActD (1 mg/mL) en 10 mL de medio de cultivo celular (concentración final = 150 ng/mL). Almacenar a 4 ° C.

2. expresión transitoria de proteínas

1. Siembra de células
   1. Recoger las células sf9 por agitación matraz cultura derrocar y bajar la suspensión de células a tubo de 50 mL y transferir 10 μl a hemocitómetro una pipeta P10. Contar el número de células bajo un microscopio de luz.
   2. Placa de 3 × 10⁵ sf9 células en cada pozo de una placa de 24 pozos durante 15 min a temperatura ambiente. Reemplazar el medio con 0,5 mL de medio de la galjanoplastia.
2. Transfección de plásmidos
   1. Reactivo de transfección celular diluida: diluir 8 μl de reactivo de transfección de células en 100 μl medio de cultivo celular sin suero y mezclar con un vórtex durante 1 s.
   2. Añadir 2 μg de plásmido ADN (pDHsp70-Ac-P35/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su) en 100 μl de medio de cultivo celular sin suero y mezclar con un vórtex durante 1 s (figura 2).
   3. Combinan la DNA del plasmid diluido y el reactivo de transfección de células diluidas (210 μL) y mezclar con un vórtex para 1 s. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
   4. Agregar 210 μl de mezcla de reactivo de transfección de DNA gota a gota en las células mediante una pipeta P1000. Incubar a 28 ° C durante 5 h.
   5. Reemplazar el medio forro con 0,5 mL de medio de cultivo celular con una pipeta P1000. Sellar la placa de 24 pozos con cinta e incubar las células a 28 ° C durante 16 horas.
3. Choque de calor las células transfected: poner la placa en un baño de agua de 42 ° C (flotando en la superficie del agua). Calentar durante 30 min y devolver la placa de 24 pocillos a la incubadora de 28 ° C.
4. Detección de expresión de la proteína
   1. Después de 1 h o de shock térmico de 5 h, lavar las células con 0,5 mL de 1 x PBS tampón brevemente tres veces.
      Nota: Diluir 10 x tampón PBS 1 x buffer PBS mediante la adición de 1 mL de tampón de PBS 10 x 9 mL esterilizado ddH₂O
   2. Lyse las células con 40 μl de 1 x tinte de carga SDS transfiriendo hacia arriba y hacia abajo.
      Nota: Diluir 4 x SDS carga tinte mezclando 30 μl de 1 x de tampón PBS y 10 μl de 4 x SDS tampón.
   3. Calentar las muestras de proteína a 98 ° C por 10 min en un bloque de calor, desactivación durante 1 min y poner en hielo para ensayo de Western blot.
   4. Mancha blanca /negra occidental análisis
      Siga el procedimiento de ensayo de Western blot de Eslami y Lujan¹³. Correr de SDS-PAGE gel¹⁴: un gel sometido a azul de Coomassie (control de carga para comprobar que la cantidad de muestras de proteína cargadas en cada bien es igual en cantidad) la coloración y la otra sometida a Western blot ensayo, según Eslami y Lujan¹³ .
   5. Detectar proteínas de fusión etiquetada V5 con anticuerpos anti-V5 (5 mg/mL) (dilución 1: 5000 en buffer TBST trabajar la concentración de 1 μg/mL) y conjugado de peroxidasa (HRP) cabra anti-conejo IgG-rábano (0,8 mg/mL) (dilución de 1:10000 en buffer TBST a trabajar concentración 0,08 μg/mL).
      Nota: Ajustar el porcentaje de poliacrilamida 17.5% cuando el peso molecular de la proteína a ser < 17 kDa.

3. anti-apoptotic análisis de actividad

1. Apoptosis inducida por el gen celular: Repita el procedimiento anterior de 2.1 a 2.3. Transfectar Co 1 μg de plásmido pDHsp/D-rpr/bandera-su ADN (que contiene gen de inductor de la apoptosis) con 1 μg de ADN plásmido [pDHsp70/V5-su vector (control negativo), pDHsp70-CA-P35/V5-su (control positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su, respectivamente.]. En el tratamiento de shock de calor después de 5 h, realizar el análisis de viabilidad de la célula (figura 2).
2. Apoptosis de las células inducidas por químicos: Repita el procedimiento anterior de 2.1 a 2.3. En el paso 2.1.2, placa de 1 x 10⁶ células sf9 en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Transfectar 4 μg de plásmido ADN [pDHsp70/V5-su vector (control negativo), pDHsp70-CA-P35/V5-su (control positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su, respectivamente.]. En el choque de calor después de 5 h, tratar células sf9 con 2 mL de medio de cultivo celular ActD para 16 h y realizar el análisis de viabilidad de la célula (figura 2).
   Nota: Volumen mínimo para cubrir un pozo de placa de 6 pozos es de 1 mL.
3. Realizar los experimentos de arriba anti-apoptotic ensayo actividad, incluyendo 3.1 y 3.2 en triplicado.

4. Análisis de viabilidad de la célula

1. Lavar las células tratadas mediante la adición de 1 mL de tampón PBS de 1 x 1 min 3 veces. Resuspender las células transfiriendo 1 mL 1 x PBS de tampón que contiene 0,04% trypan azul y manchas durante 3 min a temperatura ambiente. Transferir la suspensión de células en un microtubo de 1.5 mL.
   Nota: Diluir la solución de azul de tripano 0.4% por 9 mL de 1 x PBS buffer y 1 mL 0.4% azul de tripano solución de mezcla.
2. Transferir 10 μl trypan azul manchado suspensión al hemocitómetro con una pipeta P10 y contar las células viables intactas bajo un microscopio de luz.
3. Análisis estadístico
   1. Calcular los datos registrados y se presentan como los medios ± S.D. para todos los cargos.
   2. Analizar los datos con el de dos colas prueba t de Student de Microsoft Excel. Definir datos estadísticamente significativos como P-valor < 0.05.

Resultados

Toda la longitud y otros dos truncamientos (dominios BIR y anillo) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV se sobreexpresa en las células sf9, basado en el calor basado en el choque pDHsp/V5-suSpodoptera frugiperda Handy sistema (células sf9). PDHsp/V5-su contenido Drosophila calor choque proteína promotora, que impulsa la expresión del gen aguas abajo a una temperatura de 42 ° C condición mediante el uso de factores transcripcionales celulares y la traducción del sistema (

Discusión

El concepto de calor basado en el choque pDHsp/V5-su/sf9 celular sistema primero fue descrito por Clem et en 1994⁸. Comparación del promotor del gen baculovirales (IE1) y hsp70 de Drosophila demostraron que hsp70 tenía una eficacia más alta en células de mosquito¹⁰. Además, debido a la inducción del choque de calor, el tiempo de expresión de la proteína podría ser controlado precisamente después del tratamiento de choque de calo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)