Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Resumen

Genes específicos de edición usando CRISPR/Cas9 ha facilitado enormemente la comprensión de las funciones biológicas de los genes. Aquí, utilizamos la metodología CRISPR/Cas9 para mutaciones de calreticulina modelo en dependiente de citoquinas hematopoyéticas células para estudiar su actividad oncogénica.

Resumen

Agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) es un sistema de inmunidad adaptativa en procariotas ha sido repurposed por los científicos para generar RNA-dirigida de nucleasas, como CRISPR-asociado (Cas) 9 para el genoma eucariótico específico edición. Ingeniería del genoma por Cas9 utiliza robusta, eficiente y fácilmente modificar genes endógenos en muchas líneas celulares mamíferos biomédico pertinentes y organismos. Aquí mostramos un ejemplo de cómo utilizar la metodología CRISPR/Cas9 para entender la función biológica de las mutaciones genéticas específicas. Modelo de calreticulina (inserción) mutaciones en murinos interleucina-3 (mIL-3) dependiente pro-B (Ba/F3) las células por la entrega de una guía RNAs (sgRNAs) contra el locus endógeno de inserción en la región específica donde inserción o canceladura (indel ) Las mutaciones de inserción ocurren en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN), un tipo de cáncer de la sangre. El sgRNAs crear roturas de doble cadena (distritales) en la región específica que son reparados por no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) a indels de varios tamaños. Luego empleamos el ensayo de transformación celular de Ba/F3 estándar para comprender el efecto de expresión nivel fisiológico de las mutaciones de inserción en la transformación celular hematopoyético. Este enfoque puede aplicarse a otros genes para el estudio de su función biológica en varias líneas celulares mamíferos.

Introducción

Tecnología CRISPR/Cas9 recientemente ha revolucionado la edición del genoma específica de organismos y células vivas. Se ha convertido en una herramienta extremadamente poderosa para la investigación biomédica y en la actualidad está siendo utilizada como una vía potencial para la terapia de enfermedades genéticas¹. La base de todas las herramientas de edición genoma se basa en la creación de una nucleasa-inducida ADN doble trenzada ruptura (de diferencias OSD) en el locus genómico a modificarse. Los consejos escolares distritales pueden repararse por final-Unión no homólogos (NHEJ) o reparación dirigida de homología (HDR)^2,3. La ventaja de la nucleasa Cas9 sobre otro genoma ingeniería nucleasas, como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas de efectores como activador de transcripción (TALENs) es su dependencia del RNA para dirigir la nucleasa para una secuencia de ADN deseada, en comparación con a las interacciones DNA proteína encontradas en ZFNs y TALENs^2,3.

Después del descubrimiento de la vía de nucleasa CRISPR/Cas9 como un sistema inmune adaptante en las células procariotas^4,5, mucho esfuerzo ha entrado en la adaptación de la vía para el uso en líneas de células de mamífero y de organismos modelo^{2, 3}. como una herramienta para la edición de gene, el camino CRISPR/Cas9 utiliza dos componentes principales: el Streptococcus pyogenes (Sp) derivados Cas9 nucleasa y sgRNAs contra el gen de interés^2,3. Lo sgRNA consta de 20 nucleótidos Cas9 directo a un sitio específico en el genoma a través de RNA-DNA pares complementariedad^2,3. El sitio de destino de lo sgRNA debe estar adyacente a un sitio de protospacer motivo adyacente (PAM) en forma de 5' NGG, reconocida por la nucleasa de SpCas9. Con estas herramientas, Cas9 pueden ser dirigidas a cualquier secuencia de ADN mediante el diseño de sgRNAs orientados a la región de interés. Además Sp derivado Cas9, hay variantes adicionales para Cas9 con diferentes características dependiendo de la aplicación específica. Por ejemplo, hay variantes de Cas9 con mayor especificidad para la edición en blanco o capacidad escote solo-filamento de la DNA mellar^6,7. Por otra parte, Cas9 catalítico inactivo se ha desarrollado recientemente para la regulación transcripcional⁸. Los científicos ahora han utilizado el sistema CRISPR/Cas9 para una variedad de aplicaciones, como knockin gene knockout para el estudio de las funciones biológicas de los genes⁹, de la función de pérdida y ganancia de función biblioteca pantallas¹⁰ y genética Ingeniería de organismos modelo¹¹.

En este protocolo, se combina la metodología CRISPR/Cas9 con el ensayo de transformación celular de Ba/F3 para entender la función biológica de las mutaciones de inserción . Ba/F3 células son un murino IL-3 dependientes de células hematopoyéticas que se pueden representar IL-3 independientes sobre la expresión de ciertos oncogenes como BCR-ABL¹². Para entender si calreticulina mutante puede transformar las células Ba/F3 para el crecimiento independiente de citoquinas, dirigido el exón 9 del locus endógeno de inserción utilizando CRISPR/Cas9 para introducir mutaciones indel y retiró IL-3 de las células para aplicar una presión de selección positiva, con el objetivo de recapitular las mutaciones de inserción de ganancia de función encontradas en pacientes de la MPN. El protocolo incluye el diseño, la clonación y la entrega de sgRNAs, el desarrollo de estable Cas9 células expresando y proyección para CRISPR objetivos gene edición. Este protocolo se puede aplicar a diferentes genes y diferentes líneas de celulares de citoquinas dependientes de interés y es especialmente valiosa para modelar y estudiar la función biológica de genes implicados en cáncer.

Protocolo

1. sgRNA diseño utilizando herramientas en línea¹³

1. SgRNAs diseño contra el gen de interés utilizando herramientas libremente disponibles en línea.
   1. Copie y pegue la secuencia de Referencia NCBI del gen de interés en la herramienta de diseño web Instituto Broad sgRNA: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Nota: Esta herramienta identifica secuencias sgRNA con sitios de la hendidura dentro de los exones y los que abarcan el límite intrón/exón pero todavía hienden dentro del exón.
   2. Descargar y abrir el archivo de salida de texto en excel.
   3. Se centran en las columnas con las sgRNA las secuencias y las secuencias de contexto sgRNA. Tenga en cuenta que las secuencias sgRNA no contienen el protospacer adyacente (PAM) pero las secuencias marco.
   4. Tenga en cuenta que la puntuación de eficacia en blanco muestra la puntuación de eficiencia de hendidura prevista en una escala de 0 a 1 donde una puntuación de 1 indica una mayor eficiencia de escote.
   5. Utilice la función de 'ordenar' de excel para ordenar bien los objetivos por la puntuación de eficacia o por ubicación dentro del gene de la blanco a través de la columna '% blanco corte'.
      Nota: Ordenar por ubicación dentro del gen es útil para identificar sgRNAs que apuntan a un dominio específico o un exón de interés.
   6. Seleccione 3-6 sgRNAs que el área de interés con alta (> 0.6) puntuaciones de eficacia en el objetivo. Puede ser útil saber qué tipos de mutaciones pueden ser responsables del fenotipo que es deseada (ver figura 1 explicando la estrategia de segmentación utilizada para calreticulina).
      Nota: sgRNAs por debajo del umbral de puntuación de eficacia 0,6 sugerido debe considerarse cuando existe una falta de otros buenos candidatos.
   7. Utilice la herramienta MIT gRNA análisis web a pantalla para posibles efectos off-target (http://crispr.mit.edu/). Para cada sgRNA seleccionado, ejecutar la secuencia de destino (incluyendo el PAM).
      Nota: La herramienta de diseño web Instituto Broad sgRNA podría usarse también para detectar efectos off-target (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Tenga en cuenta que la herramienta de análisis MIT sgRNA puntuaciones cada sgRNA en una escala de 1 a 100 donde una puntuación de 100 denota mayor especificidad. Una puntuación superior a 70 es ideal y representa un sgRNA con mínimos efectos off-target. Este sitio web también genera una lista de éxitos de fuera de objetivo con su localización dentro del genoma y cuántas uniones mal hechas cada uno tiene con la guía del candidato.
         Nota: Hits objetivo con cuatro desajustes o más se consideran seguros¹⁴. Accesos fuera de objetivo con menos de cuatro uniones mal hechas puede ser problemáticos si caen dentro de los exones¹⁴.
   8. Elegir 2-3 sgRNAs que apuntan distintas localizaciones dentro de la región de interés para el gene de la blanco, y que tienen los puntajes más altos de eficiencia y objetivo de escote pares (ver tabla 1 para sgRNA secuencias dirigidas a exón 9 de inserción).
      Nota: Dependiendo de los objetivos experimentales, puede colocarse mayor énfasis sobre los diferentes valores obtenidos de las herramientas mencionadas.

2. clonación sgRNA Oligos¹³

1. Generar el oligo forward
   1. Crear una lista de secuencias sgRNA sin el sitio de PAM.
   2. Agregar a G en el extremo 5' de la secuencia si el extremo 5' de la secuencia sgRNA no es un G.
      Nota: Este G es necesaria para maximizar el nivel de transcripción sgRNA U6-conducido. Adición de un G es necesaria para m1 sgRNA (tabla 1).
   3. Añadir la secuencia "CACC" en el extremo 5' de la secuencia de la guía G-optimizado (no map) (tabla 2) con el fin de generar los voladizos para ligadura de oligos recocido en BsmBI digerido lentiGuide vector (ver paso 3).
2. Generar el oligo reverse
   1. Complemento reverso la secuencia guía G-optimizado (no map).
   2. Añadir la secuencia "AAAC" en el extremo 5' de la secuencia inversa guía complementa optimizado G (tabla 2).
   3. Los oligos diseñados de una empresa de síntesis de primer orden.
3. Recocido y fosforilan oligos
   1. Añadir 1 μl de oligo forward (100 μm), 1 μl de oligo reverse (100 μm), 1 μl de 10 x T4 ligadura tampón, 0,5 μl de la quinasa de T4 Polinucleótido (PNK) y 6,5 μl de H₂O a un tubo PCR (Total = 10 μl).
   2. Ejecutar el siguiente programa en el termociclador: 37 ° c por 30 min, 95 ° c por 5 min, rampa de 95 a 25 en 0.1 ° C/s.
   3. Diluir el producto de la reacción en el 1: 250 en H₂O.

3. digestión de lentiGuide Puro Vector¹³

1. Vector de Puro lentiGuide Digest
   1. Montar una reacción de digestión 50 μL con los siguientes componentes: 5 μg de plásmido circular, 2 μl (30 unidades) de la enzima de la restricción de BsmBI, 5 μl de buffer de enzima de la restricción y hasta 50 μl de H₂O.
   2. Ejecutar la reacción 2 h a 55 ° C. Después de la primera hora, añadir más 1 μl de enzima de la restricción BsmBI.
2. Dephosphorylate el espinazo cortado
   1. Añadir 7 μl de tampón de reacción fosfatasa y 2 μl de enzima fosfatasa al vector digerido.
   2. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
3. Polimerización en cadena purificar el corte y la columna vertebral desfosforilatado utilizando un kit comercial.
   Nota: Sustituir las columnas color rosa suministradas con el kit de miniprep azul columnas coloreadas ya que estos pueden adaptarse mejor a tamaños grandes plásmidos. El rendimiento puede ser aumentado por el tampón de elución en un bloque de 90 ° c de calor antes de la elución de la calefacción y liberador de la DNA de la columna dos veces en el extremo (ejecutar el ADN eluído desde la primera elución por segunda vez).

4. ligadura ofAnnealed Oligos en columna vertebral digerido¹³

1. Añadir 50 ng de columna vertebral digerido, 1 μl de recocido oligo dilución, 1 μl de 10 x T4 ligadura tampón, 1 μl de T4 ligasa y hasta 10 μl de H₂O a un tubo PCR. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente
2. Transformar las células de Stbl3 con 2 μl de la reacción de ligadura. Plato en un plato de agar caldo (LB) Lisogenia con 100 ampicilina μg/mL e incubar durante una noche a 37 ° C.
3. Escoja 3 colonias e inocular en una cultura mini-prep.
4. Validar oligo correcta inserción
   1. Realizar una miniprep para cada cultura y de la secuencia a través del sitio de inserción de oligo a partir de una cartilla en el promotor U6 utilizando un kit comercial.
   2. Realizar una preparación de midi o un maxi-preparación de la cultura secuencia verificada.

5. generación de celular lLines estable SpCas9 expresando

Nota: Este protocolo consiste en la entrega de pLX_TRC311-Cas9 plásmido por infección lentivirales. Este protocolo se describe en detalle para murino interleucina-3 (mIL-3) dependiente pro-B (Ba/F3) las células, una línea de células de suspensión y podría adaptarse a otros tipos celulares mediante las condiciones de cultivo preferido para cada tipo de célula. El medio de cultivo para células de Ba/F3 consiste en RPMI suplementado con suero bovino fetal 10%, 1% de penicilina/estreptomicina/L-glutamina y 10 ng/mL de murino interleukin 3.

1. Transfectar las células HEK-293T
   1. 3 x 10⁶ HEK-293T células por placa de cultivo de tejidos de 10 cm de la semilla. Mantener las células sembradas durante la noche antes de la transfección.
      Nota: Las células HEK-293T son una línea de células adherentes y se utilizan habitualmente para la producción de virus. Las células se mantienen en DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina/estreptomicina/L-glutamina 1%. Células deben ser 80% confluente en el tiempo de la transfección.
   2. Pre-caliente reducido suero medios (Opti-MEM) y medio de crecimiento.
   3. Añadir 500 μl de medio reducido suero, 7 μg de pLX_TRC311-Cas9 construir, 4 μg de plásmido de embalaje lentivirales pCMV-VSV-G y 4 μg de plásmido de embalaje lentivirales psPAX2 en un tubo de
      Nota: El ADN Total por caja de 10 cm de células 293T es 15 μg.
   4. Mezcla bien el ADN y añadir 45 μl de reactivo de transfección. Mezclar suavemente y dejar reposar 20 minutos.
      Nota: Es importante utilizar los medios suero reducido porque suero inhibirá la formación de complejos entre el reactivo de transfección y el ADN plásmido.
   5. Aspire el medio vieja la placa 293T y añadir 5 mL de medio de cultivo nuevo.
   6. Añadir la mezcla de reactivo de ADN y transfección de una manera sabia de gota a la placa 293T. Girelo suavemente e incubar a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 24 h.
   7. Coseche el sobrenadante viral en 24 y 48 h post transfección. Pasar por un 0,22 μm filtro y alícuota en un tubo de cryovial (1,6 mL/tubo y voluntad de 1.5 mL se utiliza para la infección).
   8. Guarde el sobrenadante viral a-80 ° C.
      Nota: lentivirales sobrenadante puede utilizarse dentro de 6 meses. Si es posible, transducciones spinfection deben realizarse con virus fresco).
2. Lentivirales infección de células Ba/F3
   1. Descongelar el sobrenadante viral en el hielo, si se congela.
   2. Centrifugar las células a 300 x g durante 4 minutos.
   3. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células a una concentración de 3 x 10⁶ células/mL.
   4. Añadir 500 μl de células resuspendidas, 1,5 mL de sobrenadante viral, 4 μL de polibreno (stock: 2 mg/mL) y 10 ng/mL de m-IL3 en una placa de cultivo de tejidos bien 6. Asegúrese de incluir un no infectado con 1,5 mL de medio en lugar de sobrenadante viral como control.
      Nota: La cantidad de sobrenadante viral agregado debe corresponder a una multiplicidad de infección (MOI) < 1.
   5. Centrifugar la placa a 440 x g durante 120 min a 37 ° C.
   6. Quite la placa de la centrífuga y en 37 ° C y 5% CO₂ incubadora y permiten para crecer durante la noche.
   7. Desactivación de las células después de 24 h y resuspender con 5 mL de medio caliente fresco en una placa de 6 pozos.
3. Selección de las células infectadas Cas9
   1. Desactivación de las células y resuspender con dulces calientes medios suplementados con 5 μg/mL de blasticidin, 48 h post spinfection.
   2. Seleccione las celdas de 9 días con blasticidin o hasta que las células no infectadas control (negativo) están muertas.
   3. Una vez completada la selección, transferencia de las células resistentes al medio con menor concentración de blasticidin.

6. ponente ensayo para Cas9 actividad¹⁵

1. Transducir células parentales y estable expresando Cas9 con pXPR-011 infección lentivirales (ver pasos 5.1-5.2).
   Nota: Este vector contiene una guía dirigida a GFP y GFP. Las células que contienen activos Cas9 resultará en una reducción de GFP (figura 2).
2. Seleccione las celdas para 3 días con 2 μg/mL de puromicina, 48 h post spinfection.
3. Análisis de las muestras para la expresión de GFP por citometría de flujo.
   Nota: Una reducción del 50% o más del GFP representa actividad Cas9 óptima. Una mayor concentración de la selección de blasticidin podría utilizarse para aumentar la actividad de Cas9 si inferior se observa una reducción del 50%. No todas las líneas celulares pueden tolerar blasticidin selección. En este caso, el uso de vectores Cas9 con otras cintas de selección puede ser necesario. Además, no todas las líneas celulares pueden tolerar la expresión estable de Cas9. En este caso, pueden utilizarse transitorios de la transfección de Cas9.

7. Spinfection de sgRNAs en células de expresión Cas9

1. Siga los pasos 5.1-5.2 lentivirales infección de sgRNAs en las células de interés.
   Nota: En paso 5.1.3, reemplace Cas9 pLX_TRC311 construcción con la construcción de lentiGuide Puro validada de la sección 4.
2. 48 h post spinfection, seleccione las celdas para 3 días con 2 μg/mL de puromicina.
3. Transferir las células resistentes a medio con menor concentración de antibióticos y continúe la selección por otros 4 días permitir la edición suficiente.

8. transformación celular Ba/F3 y selección positiva mediante retiro de m-IL3

Nota: Este ensayo se describe para las células Ba/F3 dependiente 3 mIL pero podría aplicarse a cualquier línea celular dependiente de citocinas.

1. Girar por crecimiento exponencial las células Ba/F3 expresar ectópicamente Cas9 y lo sgRNA de interés.
2. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 5 mL de fosfato tampón salino (PBS).
3. Desactivación de las células y repetir el lavado en 8.2 cuatro veces (este paso asegura que los medios de comunicación está libre de IL-3).
4. Aspirar el PBS y resuspender las células en 5 mL de medio fresco sin IL-3.
5. Contar las células usando un hemocitómetro o un analizador de viabilidad celular.
6. Semilla de las células por triplicado en una placa de la pozo 6 cultivo de tejidos en una concentración de 1 x 10⁵ células/mL en un volumen total de 2 mL de medio fresco sin IL-3.
7. Controlar y contar las células cada 2 días para un total de 8 días.
   Nota: Las células Ba/F3 falta IL-3 por lo general mueren 2 días post hambre IL-3. Es importante incluir un control negativo en el ensayo (normalmente una guía dirigida a no se utiliza como control).

9. detección de CRISPR edición en blanco

1. Diseño CRISPR cartillas aguas arriba y aguas abajo del sitio de clivaje sgRNA de detección
   Nota: uso de cartillas al menos 100 bp desde el sitio de la hendidura prevista para no afectaría la detección por un gran inserción o canceladura (indel) en el sitio de destino sgRNA.
2. Aislar ADN genómico (gDNA) de las células transformadas (en el final de la curva de crecimiento) y de retiro de pre-citocinas de las células.
   Nota: Siempre incluyen células overexpressing el guía no metas como un control para la edición de genes. Aislar gDNA de células antes y después de transformación será identificar clones seleccionados positivamente para y tienen una ventaja proliferativa.
3. Montar una PCR de 50 μL con los siguientes componentes: 25 μl de mezcla de x PCR 2, 1 μl de cebador forward (10 μm), 1 μl de cebador reverso (10 μm), 50-100 ng de gDNA y H₂O hasta 50 μl.
   Nota: Pueden utilizarse numerosas polimerasas de alta fidelidad en paso 9.3.
4. Ejecutar ejemplos en un termociclador usando los siguientes parámetros: 95° C por 1 min, 30 ciclos de (94 ° C por 1 min, 52 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) y 72 ° C durante 10 minutos. Esta PCR está optimizado para los iniciadores de inserción aparece en la tabla 3. Optimizar las condiciones PCR para el par de la cartilla diseñada en el paso 9.1 basado en pruebas en gDNA.
5. Ejecutar 5 μl de las muestras en un gel de agarosa al 2% a 10 V/cm utilizando tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE) de x 1. Examinar las muestras de la presencia / ausencia de una banda amplificada correspondiente en tamaño para el gen de interés.
6. Utilizar el resto de la reacción de PCR (45 μL) para realizar una purificación de la polimerización en cadena.
7. Clon de los amplicones con una PCR kit de clonación en un vector plásmido. Por ejemplo, se suelen utilizar vectores de pGEM T fácil.
8. Transformar el plásmido en las células Stbl3 u otras células compatibles y placa a placas con agar LB con el antibiótico pertinente. Seleccione 10-20 colonias, mini-prep cada uno y someter a cada clon a Sanger secuenciación para caracterizar los indels creado a partir de CRISPR/Cas9 edición.
   Nota: Si lo desea, única célula fluorescencia activada (FACS) clasificación podría realizarse en la mayor parte editada población para aislar un clon con un indel específico. Por otra parte, generación siguiente secuenciación métodos (NGS) puede utilizarse para cuantificar más robusta en meta editar con profunda secuenciación de amplicones de PCR que abarca la región de destino sgRNA. Por ejemplo, seguimiento de Indels en descomposición o marea puede utilizarse en lugar de subcloning precisamente determinar el espectro y la frecuencia de mutaciones específicas generadas en un conjunto de células (https://tide.nki.nl/#about)¹⁶.

Resultados

Utilizando el método descrito aquí, el objetivo de este experimento es estudiar los efectos funcionales de la introducción de mutaciones indel para el locus endógeno de inserción sobre la transformación de células hematopoyéticas. El sistema CRISPR/Cas9 se utiliza como una herramienta para crear mutaciones de inserción endógenas en las células Ba/F3. Dos sgRNAs fueron elegidos a exón 9 de inserción (figura 1), en la reg...

Discusión

Aquí se demuestra el uso de CRISPR/Cas9 gene edición para estudiar la función biológica de las mutaciones de inserción en las células hematopoyéticas. El éxito de este protocolo depende de múltiples factores. En primer lugar, es importante saber qué tipos de mutaciones pueden ser responsables del fenotipo deseado. En el presente Protocolo, la lectura es la transformación de células Ba/F3 a la independencia de 3 mIL y los tipos de mutaciones son indels en el exón 9 de inserción. Sin embargo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsmBI	New England Biolabs	R0580L
Blasticidin	Sigma Aldrich	15025
Puromycin	Life Technologies	A1113803
Stbl3 cells	Life Technologies	C737303
TransIT-LT1	Thermo Fisher Scientific	MIR2300
Opti-MEM	Life Technologies	51985034
RPMI	Thermo Fisher Scientific	MT10040CV
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Omega Scientific	FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Life Technologies	10378016
mIL-3	Peprotech	213-13
psPAX2	Addgene	N/A
pCMV-VSV-G	Addgene	N/A
pLX_TRC311-Cas9	Addgene	N/A
polybrene	Sigma Aldrich	H9268
pXPR-011	Addgene	N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Genessee Scientific	25-507
TAE buffer	Thermo Fisher Scientific	FERB49
LentiGuide-Puro	Addgene	Plasmid #52963
PNK	New England Biolabs	M0201S
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104