Seguimiento Neuroanatomical retrógrada frénico de neuronas de Motor en ratones

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para la identificación de las neuronas de motor frénicas en ratones después entrega intrapleural de fluoróforo conjugada beta de la subunidad de la toxina de cólera. Se comparan dos técnicas para inyectar en la cavidad pleural: transdiaphragmatic versus enfoques transtorácicos.

Resumen

Neuronas motoras frénicas son las neuronas de motor cervicales origina de C3 a C6 niveles en especies de mamíferos más. Proyecciones axonales convergen en nervios frénicos que inervan el diafragma respiratorio. En cortes de médula espinal, las neuronas de motor frénicas no puede ser identificadas desde otras neuronas del motor en criterios morfológicos o bioquímicos. Ofrecemos la descripción de procedimientos para la visualización de cuerpos celulares de neuronas motoras frénicas en ratones, siguiente inyección intrapleural de cólera toxina subunidad beta (CTB) conjugado con un fluoróforo. Este trazador fluorescente neuroanatomical tiene la capacidad de ser cogido para arriba en la Unión neuromuscular del diafragma, retrogradely a lo largo de los axones frénicos y llegar a los cuerpos celulares frénicos. Se comparan los dos enfoques metodológicos de la entrega CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus inyecciones transtorácicas. Ambos métodos son exitosos y resultan en similar número de neuronas de motor frénicas CTB-labeled. En conclusión, estas técnicas pueden ser aplicadas para visualizar o cuantificar las neuronas motoras frénicas en varios estudios experimentales como los que se centra en los circuitos de frénico diafragma.

Introducción

El objetivo del estudio es presentar un método confiable para identificar las neuronas motoras frénicas (PhMN) en las secciones de la médula espinal de ratón. Inyección de un trazador fluorescente neuroanatómicas en la cavidad pleural fue elegida como el método de entrega para alcanzar las proyecciones neuromusculares frénicas hacia el diafragma y utilizar transporte retrógrado a lo largo de los axones frénicos a frénicos cuerpos celulares de la etiqueta. Se describen dos técnicas de entrega intrapleural: transdiaphragmatic versus transtorácico.

Frénico las neuronas motoras son las células espinales relé cuyos axones convergen en los nervios frénicos, que en última instancia inervan el diafragma. Estas son las neuronas motoras inferiores reciben la impulsión inspiratoria de los centros respiratorios bulbares y retransmisión a las uniones neuro-musculares del diafragma (NMJ). PhMN se estructuran en dos columnas motor, uno para cada hemicord, a lo largo de la mediados de-cervicales de la espina dorsal. En la mayoría de especies de mamíferos incluyendo a seres humanos, las columnas motor frénicas separada de niveles C3 a C6^1,2,3. Nosotros y otros hemos confirmado que PhMN concentrados en los niveles de C3-C5 en rata y ratón de la médula espinal^4,5,6,7,8. La distribución topográfica de las células frénicas no es al azar; las neuronas motoras que inervan la parte esternal del diafragma están distribuidas más densamente en la parte craneal de la piscina de motor frénica (C3), mientras que las neuronas motoras que inervan la parte crural son más caudal (C5)⁹. Además, PhMN se agrupan vario en el cuerno ventral gris materia. Nivel C3, los racimos de células frénicos se encuentran lateralmente, luego que se muevan en una dirección ventrolateral e iliacos se encuentran en la más caudal niveles^10,11.

Dado su papel vital durante la inspiración, es de suma importancia para identificar con precisión PhMN en la médula espinal sana pero también seguir su destino durante condiciones patológicas, tales como enfermedades degenerativas o lesiones traumáticas de la médula espinal. Desde PhMN no difieren morfológicamente de otras neuronas motoras cervicales, identificación de PhMN se basa en la entrega específica de neuroanatomical marcadores ya sea a nivel de centros respiratorios primarios⁸, o en el diafragma NMJ⁷ o en el nervio frénico⁴. El palpador es tomado por las fibras nerviosas y llevaron hasta el frénicos cuerpos celulares en la columna cervical, donde pueden visualizarse utilizando sistemas de detección directa o indirecta. Retrógrada o anterógrada trazadores son comercialmente disponibles con una amplia gama de conjugados. Notable, cada indicador está dotado no, bajas o altas capacidades seguimiento sináptica trans.

En el estudio actual, hemos elegido la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB) funcionalizada con Alexa Fluor 555 (en adelante denominado CTB-fluoróforo) como una etiqueta fluorescente, que permite una visualización directa de PhMN en secciones congeladas de la médula espinal. CTB se describe generalmente como un trazador monosynaptic, aunque datos experimentales tienden a mostrar un paso transneuronal de¹². CTB tiene la capacidad de enlazar el gangliósido GM1 en la membrana plasmática de la terminación nerviosa. CTB es internalizado a través clathrin-dependiente - independiente o mecanismos y transitan por la red trans-Golgi en el retículo endoplásmico en una manera retrógrada^13,14. La internalización y el transporte retrógrado parecen ser dependiente en el citoesqueleto de actina^15,16 , así como en la red de microtúbulos¹⁷.

Para demostrar la utilidad de la CTB como trazador neuroanatomical retrógrada etiquetado diafragma PhMN circuitos, CTB-fluoróforo entregaron intrapleural. CTB se administró dos técnicas: la primera de ellas incluye una laparotomía y múltiples inyecciones transdiaphragmatic; el segundo, menos invasiva, utiliza una única inyección transtorácica. Cuatro días más tarde, marcada con fluorescencia PhMNs fueron cuantificados en la médula espinal cervical, tanto de sanos y de animales (C4) spinally heridos.

Protocolo

El protocolo experimental se llevó a cabo en cumplimiento de las directivas de Consejo de las comunidades europeas para experimento de Animal (2010/63/UE, 86/609/CEE y 87-848/CEE) y fue aprobado por el Animal ética Comité de la Universidad de Namur (ética proyecto n ° 17-284 ). La figura 1 muestra los dos enfoques respectivos: transdiaphragmatic o inyecciones transtorácicas. Utilizar ratones C57bl/6J machos (n = 18), edad de 3 a 4 meses en el estudio.

1. preparación de solución de CTB

1. Para transdiaphragmatic inyecciones:
   1. Disolver el poder de la CTB en agua estéril a la concentración de 0.2% (p/v).
   2. Carga 7.5 μl de solución de CTB (0.2% w/v) en un 10-μl-microjeringa estéril con una aguja de calibre 33 fija (bisel embotado o corta) para cada ratón.
2. Para inyección transtorácica:
   1. Disolver el poder de la CTB en agua estéril a la concentración de 0.1% (p/v).
   2. Carga 20 μl de solución de CTB (0,1% p/v) en una jeringa estéril de 500 μl de insulina con una aguja de calibre 27 biselada para cada ratón.
      Nota: Asegúrese de usar agua destilado y estéril y disolver bien el polvo CTB. La solución puede conservarse a 4 ° C durante un mes (no congelar). Puede formar un precipitado después de pocos días. Llevar la solución a temperatura ambiente y mezclar con una pipeta antes de su uso.

2. preparación antes de la inyección Intrapleural

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos antes de la cirugía, uso de Esterilizador autoclave o bolas de cristal. Preparar una capa de banco limpio de realizar la cirugía y a disponer de las herramientas quirúrgicas.
   Nota: Cualquier material utilizado durante el procedimiento quirúrgico debe estar estéril. Instrumentos que no pueden ser esterilizados como la microjeringa debe limpiarse con un desinfectante (clorhexidina) o se debe usar una única. El cirujano debe lavar sus manos con un desinfectante (clorhexidina scrub) antes del comienzo de la cirugía. El cirujano debe usar guantes estériles, una máscara y una bata limpia.
2. Peso animal y administrar una dosis adecuada de anestesia: inyección intraperitoneal de anestésico cóctel (p. ej. ketamina 100 mg/kg y xilacina 5 mg/kg).
3. Pellizque el dedo del pie o Compruebe la pérdida de reflejo palpebral para determinar si el ratón correctamente está anestesiado. Aplique un ungüento veterinario para proteger la córnea.
4. Cepille con cuidado la piel ventral (para transdiaphragmatic procedimiento) o la derecha torácica piel (para procedimiento transtorácico), utilizando podadoras de pelo eléctricas. Cepille bien y suficientemente amplia para evitar que el pelo en el campo de la cirugía.
5. Asegurar condiciones de asepsia por aplicación tópica de solución de yodo 10% en el área depilado. Limpiar el sitio quirúrgico con solución de yodo, cuidando de limpiar desde el centro del sitio hacia la periferia.
6. Use una almohadilla homeotérmicos a lo largo de la cirugía para mantener la temperatura corporal del animal.

3. Intrapleural inyecciones usando acercamiento Transdiaphragmatic

1. Colocar el ratón anestesiado en posición supina sobre una almohadilla de calefacción. Colocar una gasa enrollada debajo del cuello del animal. Para un ratón adulto, utilice una gasa enrollada de 0,5 pulgadas de espesor. La cinta esta tecla a la Junta de cirugía para evitar el movimiento eventualmente.
2. Usando una hoja de bisturí, haga una incisión en la piel ventral a lo largo de la línea media: hacer una incisión desde el proceso xifoides a la región umbilical mientras estira la piel lateralmente con la otra mano para hacer la piel tensa. No aplique demasiada presión sobre la cuchilla para no dañar órganos subyacentes.
3. Con unas tijeras pequeñas, cuidadosamente separe la piel de los músculos abdominales alrededor de la incisión. Este procedimiento ayudará a coser los músculos y la piel aparte al final de la cirugía.
4. Realizar laparotomía con unas tijeras pequeñas. Abrir la cavidad abdominal mediante la realización de una incisión de ojal a nivel del ombligo. Haga una incisión en los músculos abdominales a lo largo de la línea blanca ("linea alba") hasta el proceso del xiphoid.
5. Para poder visualizar la superficie abdominal del diafragma, retraer músculos abdominales usando retractores comerciales o caseros.
   Nota: Estos retractores pueden hacerse de tamaño midi clips de papel en forma de gancho en L¹⁹.
6. Se extienden a ambos lados de la cinta hacia abajo de los retractores para la capa de banco y laparotomía. Optimizar la iluminación del campo de visión de modo que la superficie abdominal del diafragma no es más en la penumbra. El más de gran alcance dispositivo de iluminación para este propósito es una lámpara LED con un haz de luz orientable.
7. Con suaves pinzas en una mano, levante el apéndice de la xyphoid y tire hacia abajo de los lóbulos laterales del hígado (figura 2A). Con pequeñas tijeras en la otra mano, cuidadosamente cortado el ligamento suspensorio, sin dañar la vesícula biliar o el diafragma (figura 2B).
8. Con suaves pinzas en una mano, levante el apéndice de la xyphoid. Sujete la jeringa Hamilton en la otra mano. Objetivo tres sitios de la inyección en el hemidiaphragm correcto para cubrir respectivamente la esternal, la medial y las regiones crurales (Figura 3A, la inserción en la figura 3B).
9. Como el espesor de la membrana alrededor de 0,37 mm en ratones⁷, inserte la aguja no más de 1 o 2 mm más allá de la hoja del diafragma para evitar daños de pulmón durante la respiración. Entregar 2.5 μl de solución de CTB (0.2% w/v) a través del diafragma derecho en cada sitio (Figura 4B). Estabilización de la membrana no es necesario.
10. Repita este procedimiento para los tres sitios ipsolaterales de la inyección (figura 1A) y contralateral para un etiquetado bilateral de la piscina PhMN.
11. Para cerrar el sitio de laparotomía, la sutura los músculos abdominales con reabsorbible sutura 4-0. Uso interrumpidos puntadas espaciadas por 3 mm. piel de grapa cerrada con clips de 9,0 mm de la herida. Apretar las grapas para evitar que el animal tira de grapas. Espacio grapas aproximadamente 5 mm de separación. No apriete demasiado los clips de la herida, esto puede llevar a cicatrización deteriorada.
12. Limpieza micro jeringa con agua destilada para evitar impurezas. Poco a poco elaborar y expulsar a 2 - 3 veces. No introducir aire en la jeringa.

4. Intrapleural inyección usando acercamiento transtorácico

Nota: Este método está inspirado en el procedimiento descrito en ratas⁴ y fue adaptado al ratón.

1. Colocar el ratón anestesiado en posición de decúbito lateral, sobre un cojín de calefacción (Figura 4A) de la izquierda.
2. Identificar las costillas sexta y séptima en la región del codo mediante palpación manual (Figura 4B).
3. Mientras que un ayudante se extiende derecho delantero - y -extremidades posteriores (figura 5A), inserte la jeringa cranially y orientada tangencialmente en la sexta o la séptima costilla, 3 mm de profundidad de la piel con el bisel hacia abajo (figura 1B y figura 5B).
4. Elevar la aguja suavemente para confirmar, levantando las costillas, que está bien posicionada en la cavidad torácica (figura 5, inserciones en la figura 1B).
5. Estabilizar los movimientos del tórax la respiración aplicando ligera presión con dos dedos en la pared torácica.
6. Sosteniendo la jeringa en la otra mano, entregar 20 μl de solución de CTB (0,1% p/v) en una sola inyección.

5. postoperatorio cuidado

1. Inmediatamente después del procedimiento, coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho en una plataforma para la recuperación de homeotérmicos. Esto asegura el palpador para untar en la parte derecha de la cavidad pleural y permite la monitorización de la respiración del animal.
2. Administrar por vía subcutánea 1 mL de solución salina estéril intraperitoneal. Proporcionar seguimiento inyecciones si el animal aparece deshidratada y apática.
3. Administrar por vía subcutánea 0,1 mg/kg de buprenorfina, dos veces al día durante los primeros dos días después de la cirugía, para reducir al mínimo cualquier dolor potencial.
   Nota: Muchas instituciones recomendaría multimodal analgesia para procedimientos invasivos, como la laparotomía representado aquí. Esto puede incluir el uso de un no esteroides anti-inflamatorios (AINE) o un agente anestésico local en el sitio de la incisión. Estos medicamentos típicamente se entregan antes de la primera incisión para minimizar el dolor de la cuerda.
4. Seguimiento de animales todos los días hasta la eutanasia.

Resultados

Ratones C57bl/6J machos (n = 18), edad de 3 a 4 meses se incluyeron en el estudio. En el día 0 del experimento, 8 ratones experimentaron una contusión unilateral de C4, lado derecho, según el protocolo publicado^7,18. Como procedimiento simulado, 10 ratones experimentaron un laminectomy encima de C4 sin contusión. En el día 3, ratones fueron preparados para la inyección intrapleural de CTB-fluoróforo según los dos procedimi...

Discusión

El protocolo descrito en este documento puede aplicarse a cualquier cepa de ratones adultos o a cualquier paradigma experimental en el que se debe evaluar la integridad de los circuitos de diafragma PhMN. Por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y lesión de la médula espinal cervical (cSCI) son condiciones asociadas con pérdida de PhMN, degeneración anterógrada de axones frénicos y posterior compromiso respiratorio. Modelos animales de ELA o cSCI mímico histopatológicos y funcionales respiratorios défi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm