Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

Resumen

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Resumen

Como una plataforma de edición de genoma prometedora, el sistema CRISPR/Cas9 tiene gran potencial para la manipulación genética eficiente, especialmente para la integración dirigida de los transgenes. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de recombinación homóloga (HR) y las varias mutaciones indel de no homóloga se terminan uniendo (NHEJ)-basado en estrategias en las células no se dividen, en vivo genoma edición sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-sistema CRISPR/Cas9 eficiente en vivo precisa integración específica. En este sistema, el genoma de destino y el donante vector que contiene los brazos de homología (~ 800 bp) flanqueado por destino de RNA (sgRNA) solo guía secuencias son troceadas por CRISPR/Cas9. Esta estrategia basada en HMEJ logra integración eficiente del transgen en cigotos de ratón, así como en hepatocitos en vivo. Por otra parte, una estrategia basada en HMEJ ofrece un enfoque eficaz para la corrección del fumarylacetoacetate hidrolasa (Fah) mutación en los hepatocitos y rescata Fah-deficiencia inducida por ratones de insuficiencia hepática. Tomados en conjunto, centrándose en el objetivo integración, esta estrategia basada en la HMEJ proporciona una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones, incluyendo la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias genéticas específicas.

Introducción

La edición del genoma, precisa, específica es a menudo necesaria para la producción de modelos animales modificados genéticamente y tratamientos clínicos. Se ha realizado mucho esfuerzo para desarrollar diversas estrategias para el genoma objetivo eficiente de edición, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALENs) y sistemas de CRISPR/Cas9. Estas estrategias crean roturas de doble cadena DNA específicas (OSD) en el genoma y toman ventaja de intrínsecos sistemas de reparación del ADN, como la recombinación homóloga (HR)^1,2, microhomology-mediada se terminan uniendo (MMEJ)^{3 , 4 , 5}y no homólogas terminan uniendo (NHEJ)^6,7,8 para inducir la integración dirigida de los transgenes^1,9. La estrategia de recursos humanos es actualmente el más de uso general genoma edición de enfoque, que es muy eficiente en las líneas celulares, pero no fácilmente accesibles a las células no se dividen por su ocurrencia restringida en la fase tardía de la S/G2. Así, la estrategia de recursos humanos no es aplicable para en vivo la edición del genoma. Recientemente, la estrategia basada en NHEJ se desarrolló para eficaz de genes knock-en tejidos de ratón⁸. Sin embargo, el método basado en NHEJ usualmente presenta indels en las uniones, lo que es difícil generar la edición del genoma exacto, especialmente cuando se trata de construir en el marco de la fusión de genes⁸. Integración dirigida basada en MMEJ es capaz de la edición del genoma exacto. Sin embargo, sólo modestamente aumenta la eficiencia de integración específicas en informes anteriores⁵. Por lo tanto, mejorar la eficiencia de integración específicas precisa en vivo se necesita urgentemente para amplias aplicaciones terapéuticas³.

En un trabajo publicado recientemente, hemos demostrado una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-basado en la estrategia, que mostró la mayor eficiencia de integración específica en todo divulgado estrategias, tanto in vitro e in vivo¹⁰. Aquí, describimos un protocolo para el establecimiento del sistema HMEJ, y también la construcción de los vectores de RNA (sgRNA) solo guía al gen de interés y el donante vectores propios sitios de destino sgRNA y ~ 800 bp de brazos de homología (figura 1) . En este protocolo, también se describen los pasos detallados para la generación de ADN knock-en ratones y breves pasos de integración específica en tejidos en vivo. Por otra parte, un estudio de prueba de concepto de la estrategia basada en HMEJ demostrado su capacidad para corregir la mutación de la Fah y rescatar a Fah^{- / -} hígado insuficiencia ratones, que además revelaron su potencial terapéutico.

Protocolo

Todos los procedimientos incluyendo temas animales han sido aprobados por el Comité de ética de investigación biomédica en los institutos de Shangai para la ciencia biológica (CAS).

1. diseño de donante plásmidos

1. Selección de sgRNA
   1. Utilizar herramientas de diseño en línea CRISPR para predecir sgRNAs en la región de destino de^{12,11,13,14,15}. Para el locus Cdx2 , diseño seis sgRNAs diferentes (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) alrededor de la parada codon con mayor rango y menor potencial de-objetivos (figura 1A)¹⁶.
   2. Alinear 2 μg de vectores de expresión Cas9-CMV-EGFP y sgRNA por digestión BbsI (1 μl de BbsI por 2 h a 37 ° C a una concentración final de 1 U/μl de un volumen de 20 μl). Luego purificar el producto kit de purificación de gel con un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE 1 x.
   3. Mezcla un par de oligonucleótidos sgRNA en 10 μl de 1 × T4 ADN ligasa buffer una concentración final de 50 μm. Incubar la solución oligo utilizando un gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C con una tasa de cambio de temperatura de 5 ° C/5min (95 ° C durante 5 min. entonces de 90 ° C por 5 min, 85 º C por 5 min, etcetera.), que hibridan los oligos.
   4. Mezcle 4 μL de recocido producto, 2 μl del vector linearizado con 1 μl de T4 ADN ligasa en 10 μl de tampón de 1 × T4 DNA ligasa y luego ligar a 22 ° C durante 1-2 h (figura 1B).
2. Ensayo de nucleasa de topógrafo de sgRNA
   Nota: Se evaluó la eficacia dirigida a de sgRNA utilizado para el experimento de golpe por análisis de nucleasa de topógrafo (también conocido como endonucleasa T7 I (T7EI) ensayo)¹⁷. Seleccione lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y una baja distancia entre el sitio de corte sgRNA y el codón de parada.
   1. Transfectar vectores de expresión Cas9-sgRNA-EGFP en líneas de células N2a cultivadas en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 1% PSG y el 1% no esenciales aminoácidos por la transfección kit (véase Tabla de materiales). Incube las células transfected a 37 ° C en 5% CO₂.
   2. Después de 48 h de incubación, recoger 5.000 células transfected (GFP⁺) por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación usando las células transfectadas no como control.
   3. Digerir las células recogidas en 2-5 μl de tampón de oflysis (0,1% Tritón X-100, 0,1% Tween 20 y 100 μg/mL proteinasa K) a 56 ° C durante 30 minutos y luego calor inactivar la proteinasa K a 95 ° C durante 10 minutos.
   4. Amplificar la muestra por PCR anidada (tabla 1) utilizando el protocolo del fabricante. El tamaño de los productos PCR se establece en 300-500 bp.
      1. Mezclar 1 μl del producto de la lisis con polimerasa de la DNA y un par de cebadores externos reconociendo la secuencia alrededor del sitio de destino sgRNA (0,1 μm, concentración final) (tabla 1) y realizar la primaria PCR en un volumen de 20 μl.
      2. Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR primaria por 30 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 24 s (1 minuto/1 kb), con una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.
      3. Llevar a cabo la polimerización en cadena secundario usando 1 μl del producto PCR primario y un par de cebadores internos anidados.
   5. Desnaturalizar y volver a cocer 300-600 ng del producto PCR purificado en 20 μl de tampón de reacción T7EI (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl₂, 1 mM TDT pH 7.9) de × 1 utilizando un gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C con una tasa de 5 ° C/5min.
   6. Añadir 1 μl de enzima de T7EI a los productos de PCR recocidos y digerir a 37 ° C por 2 h. Luego ejecute el producto de la digestión en gel de agarosa al 2% en Tampón TAE de 1 × 120 V durante 40 minutos hasta que los fragmentos están separados (véase Tabla de materiales).
   7. Utilizar ImageJ para determinar las intensidades de la banda de corte y de la DNA sin cortar. Calcular la frecuencia de indel usando los métodos previamente registrados⁹ (figura 1C).
3. Construcción del vector de donantes
   Nota: Para generar vectores de donantes HMEJ de gen Cdx2 , construir un donante de ADN (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) flanqueado por 23 nt Cdx2-sgRNAs a la secuencia en ambos extremos (figura 1D yEde la figura 1). El PAM de la secuencia de destino estaba adyacente al extremo del brazo homólogo. Asamblea de Gibson se recomienda para donantes HMEJ clonación.
   1. Amplificar el brazo de homología izquierda bp 800 (HAL) con avance cartilla-1F (que contiene 15-20 nt superposición secuencia de vectores, 23 nt Cdx2-sgRNA secuencia dirigida a y cerca de 20 secuencia de nt de HAL) y cartilla-1R (contiene la secuencia de 15-20 bp superposición de p2A-mCherry y cerca de 20 secuencia de nt de HAL) en concentración final de 0.1 μm usando la DNA genomic de ratón a 200 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).
   2. Amplificar el fragmento de inserción p2A-mCherry con avance cartilla-2F (contiene 15-20 nt superposición secuencia de HAL y cerca de 20 secuencia de nt del fragmento de inserción) y revertir la cartilla-2R (contiene 15-20 nt superposición secuencia de HAR y secuencia de nt cerca de 20 de el fragmento de inserción) en concentración final de 0,1 μm utilizando genomic ADN o plásmido con secuencias de reportero a 100 ng/μl o 30 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).
   3. Amplificar el brazo de derecho homología bp 800 (HAR) con avance cartilla-3F (que contiene 15-20 nt superposición secuencia de vectores, 23 nt Cdx2-sgRNA secuencia dirigida a y cerca de 20 secuencia de nt de HAR) y cartilla-3R (contiene secuencia de superposición de nt de 15-20 de p2A-mCherry y cerca de 20 secuencia de nt de HAR) en concentración final de 0.1 μm usando la DNA genomic de ratón a 200 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).
   4. Ejecutar todos los productos PCR en gel de agarosa al 1% en Tampón TAE 1 x y purificar los productos PCR del tamaño esperado kit de extracción de gel, según las instrucciones del fabricante (tabla 1).
   5. Digerir el 50-100 ng de un vector de construcción con KpnI y XbaI. Mezcle 2 μl del vector linearizado en 30-40 ng/μl con tres PCR amplifica fragmentos (1 μl de cada uno, 100-200 ng/μL) en 2 x mezcla de Gibson. Agregar H₂O para ajustar el volumen final de 10 µL.Incubate la mezcla a 50 ° C durante 60 minutos.
   6. Competentes de e. coli de transformar las células con el producto ensamblado y extracto el plásmido construye por kit de extracción de ADN según las instrucciones del fabricante. Secuenciación de ADN para comprobar al donante HMEJ.

2. genoma edición en embriones de ratón utilizando el método basado en la HMEJ

1. Producción de mRNA de Cas9
   1. Para la preparación de Cas9 mRNA, agregue la secuencia de promotor de T7 a la Cas9 codificación región por amplificación por PCR utilizando el par de cartilla apropiados listado en la tabla 1. Añadir la cartilla Cas9 F/R en una concentración final de 0.1 μm y 20 ng de Cas9 expresando el vector 1 × alta fidelidad mezcla de ADN polimerasa. Ajustar el volumen final de 50 μL con H₂O.
   2. Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR para 36 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 68 ° C por 4 minutos (1 minuto/1 kb), con una extensión final a 68 ° C durante 10 minutos.
   3. Purificar el producto de PCR de Cas9 T7 en vitro transcripción (IVT) y luego transcribir 0.5-1 μg de ADN por kit de transcripción de mRNA a 37 ° C durante 8 horas en un volumen total de 20 μl, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
   4. Añadir 1 μl de DNasa a la mezcla para quitar la plantilla de ADN a 37 º C durante 15 minutos agregar una cola poly-A 45 min a 37 ° C y recuperar el mRNA Cas9 por kit de purificación de RNA, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
2. Producción de sgRNA
   1. Generar la plantilla sgRNA conducida por un promotor T7 con polimerasa de la DNA de la alta fidelidad como arriba. Elegir un andamio sgRNA que contienen vectores como plantilla. Los cebadores utilizados se enumeran en la tabla 1.
   2. Purificar el producto PCR de T7-sgRNA y utilizar 0.5-1 μg de DNA como plantilla para la transcripción en vitro de sgRNA usando un kit de transcripción de RNA corto a 37 ° C durante 6 h en un volumen total de 20 μl, según las instrucciones del fabricante (ver tabla de materiales de < / c11 >).
   3. Añadir 1 μl de DNasa a la mezcla y continuar la incubación a 37 ° C durante 15 min eliminar la plantilla de la DNA. Purificar el sgRNAs por kit de purificación de RNA, como anteriormente (véase Tabla de materiales).
   4. Diluir el sgRNA a 500 ng/μl de agua libre de ARNasa y almacenar las muestras en el ° C −80 hasta 3 meses.
      Nota: Ribonucleoproteínas CRISPR (RNPs) son una substitución de la alternativa con mejor corte eficiencia^18,19,20.
3. Cultivo de colección, microinyección y en vitro de embriones
   1. Superovulate femeninos B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) ratones (7-8 semanas) de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG), seguidos de gonadotropina coriónica humana (hCG) 48 h más tarde. Después de la inyección de hCG, mujeres de casa con los varones B6D2F1 durante la noche.
   2. Sacrificio de las hembras por anestesia de CO₂ , 24 h después de la inyección de hCG. Recogen los embriones fecundados de sus oviductos (con 30-50 embriones para cada mujer) en medio de M2.
   3. Lugar los embriones fertilizados (cerca de 300 huevos para la inyección de un día) en medio KSOM (5,55 g/L de NaCl, KCl, 0.05 g/L de KH₂PO₄, 0,05 G/l MgSO₄•7H₂O, 0.04 g/L glucosa, 1,12 g/L sodio de 0,19 g/L lactato, 2,1 g/L NaHCO₃ , piruvato de sodio 0.02 g/L, 0,25 g/L CaCl₂•2H₂O, 0,004 g/L de EDTA, 0,146 gr/L glutamina y 1 g/L albúmina de suero bovino) a 37 ° C en una incubadora con 5% CO₂.
   4. Mezcla Cas9 mRNA (100 ng/μL), sgRNA (50 ng/μL) y donantes HMEJ vector (100 ng/μL) y agregar H₂O para ajustar el volumen final de 10 μl. poner la mezcla en hielo.
   5. Tire las agujas capilares (diámetro externo de 1,0 mm, diámetro interno 0,78 mm con filamento) utilizando un extractor de micropipeta (parámetros: calor, 74, tirón, 60; velocidad, 80; retardo, 200 presión, 300. Véase tabla de materiales). Agujas comerciales sería una sustitución alternativa para la microinyección.
   6. Inyectar un volumen probable de la mezcla en el citoplasma de cigotos con pronúcleos definidas en una gota de medio de CZB HEPES que contiene 5 μg/mL citocalasina B utilizando un microinyector con constante flujo de configuración (figura 2A) (ver Tabla de materiales)²¹.
      Nota: Se debe inyectar cada grupo de cigotos dentro de 20-30 min Cytochalasin B podría aumentar la viabilidad del zigoto de ratón después de la inyección. Por otra parte, microinyección puede funcionar con el sistema piezoeléctrico, como se describió anteriormente²².
   7. La cultura los cigotos inyectados en medio KSOM a 37 ° C debajo del 5% de CO₂ hasta blastocisto etapa después de 3,5 días para observación de la fluorescencia (figuras 2B y 2C).
4. Transferencia de embriones y la generación de ratones
   1. Compañero de estros ratones hembras ICR con vasectomía ratones machos ICR en el mismo día de la inyección.
   2. La cultura los cigotos inyectados en la fase de 2 células a 37 ° C con 5% CO₂y embriones de 2 células de transferencia 25-30 en oviductos de las hembras ICR seudopreñadas en 0,5 días post coitum (dpc). Las madres beneficiarias entregan cachorros en dpc 19,5.
5. Genotipificación de ratón
   1. Extracto de ADN genómico de ratón de dedo del pie o cola muestras utilizando un kit de extracción de ADN, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
   2. Identificar a la Unión 5' y 3' de knock-eventos de uso de 200-400 ng de ADN genómico medido por espectrofotometría de UV/vis como plantilla para realizar la polimerización en cadena amplification.
      1. Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR para 38 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 1 minuto (1 min/1 kb), con una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Para el cruce de 5', use el primer avance en el upstream de la HAL, con el reverso en el fragmento de knock (p2A-mCherry). En cuanto a 3' cruce, utilice el primer avance en el fragmento de knock (p2A-mCherry), con el reverso en el abajo del HAR (tabla 1).
   3. Ejecutar 6 μl del producto PCR en gel de agarosa al 1% en 1 x TAE buffer y compruebe el tamaño del fragmento esperado. Luego verificar por secuencia (figura 2D) de la DNA.

3. HMEJ-basado en Vivo genoma edición en hepatocitos

1. Coloque el receptor ratón C57BL/6J (8 semanas) en un dispositivo de restricción y poner la cola a través de la ranura.
2. Mezcla de vectores donantes HMEJ (30 μg) y vectores de la expresión de la spCas9 (30 μg) en 2 mL de solución salina. Para el experimento control, suspender vectores donantes HMEJ (30 μg) en 2 mL de solución salina (figura 3A).
3. Limpiar la cola de ratón con etanol al 70%. Insertar la aguja en la cola de la vena e inyectar la solución de ADN de plásmido dentro de 5-7 s. Retire la aguja y suelte el ratón desde el dispositivo que refrena.
4. Sacrificio de ratones por CO₂ anestesia después de 5-9 días después de la inyección. Inundar lo ratones transcardially con solución salina al 0.9%, seguido de paraformaldehído al 4% utilizando una bomba peristáltica y fijar el hígado durante la noche a 4 ° C.
5. Deshidratar el tejido con sacarosa al 30% durante la noche, hasta que se hunde hasta el fondo del tubo.
6. Sección el tejido congelado en un espesor de 10 μm para las muestras de hígado.
7. Enjuague las secciones tres veces con tampón fosfato 0,1 M (PB) e incubar con el anticuerpo primario: conejo anti-mCherry (diluido en 5% NGS) durante la noche a 4 ° C.
8. Lávese las secciones tres veces en PB y luego los incubar con el anticuerpo secundario: Cy3-AffiniPure de cabra anti-conejo IgG por 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital.
9. Contratinción las secciones con DAPI por 20 min y montar con glicerina en portaobjetos de vidrio para mayor observación de fluorescencia (figura 3B).

Resultados

Edición del genoma basado en HMEJ en embriones de ratón: Para definir la eficiencia knock-in del método basado en la HMEJ de cigotos de ratón, entregamos Cas9 mRNA, sgRNA contra el gen Cdx2 y el donante HMEJ en cigotos de ratón, que fue diseñado para fundir un gen reportero de p2A-mCherry al codón de último de la Cdx2 gen (figura 2A). Los cigotos inyectados convirtieron en blastocistos en la cultura....

Discusión

Los pasos más críticos en la construcción de plásmidos de donantes HMEJ son: (1) selección de lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y baja distancia entre sgRNA corte y codón de parada y construcción (2) adecuada de donantes HMEJ. Escote CRISPR/Cas9-mediada en tanto vector de donante transgénico (contiene ~ 800 bp homología brazos y sitios de destino sgRNA) y genoma específica es necesario para la integración específica eficiente y precisa en vivo. Los pasos más críticos de generación de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pX330	Addgene	42230
pAAV vector	Addgene	37083
pX260	Addgene	42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40	Addgene	97307	AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA	Addgene	97308	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor	Addgene	97319	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technology	L3000015
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9930
Bbs I	New England Biolabs	R0539S
NEB Buffer 2	New England Biolabs	B7002S
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit	Qiagen	12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA	Life Technologies	AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS	Life Technologies	AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS	Life Technologies	AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97	Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass	Sutter Instrument	B100-78-10	type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)
FemtoJet microinjector	Eppendorf
Freezing microtome	Leica	CM1950-Cryostat	thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry	GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Gibco	10099141
NEAA	Gibco	11140050
Pen,Strep,Glutamine	Gibco	10378016
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02
FACS	BD AriaII
PMSG	Ningbo Sansheng Medicine	S141004
HCG	Ningbo Sansheng Medicine	B141002
Cytochalasin B	Sigma	CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red	Millipore	CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red	Millipore	CAT#MR-015-D
Mineral oil	Sigma