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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
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  • Discusión
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Resumen

RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.

Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.

Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 102 copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.

Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.

Introducción

Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos1,2,3 . Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray4 y la secuencia de RNA a partir de plataformas5. En general, expresión de miRNA se mide en relación con una muestra de referencia utilizando el método de ΔCq6. Este enfoque es apropiado para la investigación de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, la cuantificación relativa de miRNAs en circulación ha limitado utilidad debido a sus pequeñas cantidades. Además, la variación técnica hace difícil comparar los resultados de diferentes estudios, ya que diferentes laboratorios personalizar los protocolos experimentales de RT-qPCR diferentemente, que conduce a incompatibles o incluso contradictorios resultados de diferentes estudios7.

En vista de las preocupaciones mencionadas, cuantificación absoluta podría ser más adecuada para la evaluación de las cantidades pequeñas de miRNAs en los fluidos corporales. El método de cuantificación absoluta utiliza una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de oligonucleótidos sintéticos de RNA que son idénticas en secuencia para el correspondiente destino miRNA8. La salud y el Instituto de ciencias ambientales (HESI) Comité técnico de genómica recientemente llevado a cabo estudios exhaustivos para comparar los resultados de medidas absolutas de miRNAs de plasma, a través de múltiples sitios de prueba. Los resultados mostraron que utilizando un protocolo estándar para la cuantificación absoluta de miRNAs produjo resultados comparables a través de la prueba de múltiples sitios9. El método de ensayo de RT-qPCR que se describe en el presente estudio es casi idéntico al protocolo estándar de HESI, que incluye análisis multiplexado de múltiples objetivos de miRNA y la amplificación para la detección de baja expresión de miRNAs.

En este estudio, recoge un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50) fue utilizado10. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la preparación de las muestras de plasma, extracción de miRNA y RT-qPCR, incluyendo la amplificación. Lo más importante, información técnica adicional sobre el protocolo se ha incluido, por lo que la cantidad de miRNAs de blanco en las muestras puede ser validada en combinación con un proceso bien calificado. En primer lugar, la curva estándar de cada miRNA se validó su rango de detección individual, antes de su cuantificación en muestras biológicas. En segundo lugar, la calidad de la metodología actual se evaluó exhaustivamente mediante valores de Cq de un control externo (cel-miR-238). Por lo tanto, esta plataforma proporciona datos más informativos y confiables para comparar resultados de diferentes estudios o laboratorios.

Los perfiles de 8 miRNAs se han incluido en este informe como resultados representativos por el método de ensayo descrito aquí. Estos miRNAs se han propuesto como biomarcadores potenciales de seguridad asociaron con lesión del tejido del hígado (miR-122 y miR-192), corazón (miR-1, miR-208a, 208b miR y miR-499a) y músculo esquelético (miR-133a y miR-206) en roedores y seres humanos3, 11,12,13.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. preparación de la muestra

  1. Recoger la sangre (menos de 0,5 mL) de la vena femoral de monos cangrejeros en tubos con EDTA 2K que contiene.
    Nota: El citrato y heparina no son aceptables porque estos anticoagulantes inhiben la posterior PCR14,15.
  2. Coloque las muestras colectadas inmediatamente en hielo y proceso para el aislamiento del plasma dentro de 2 horas de la recolección.
  3. Centrifugar las muestras a 10.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
  4. Transferir el sobrenadante a un microtubo 2 mL, seguido de centrifugación a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min eliminar restos de células y plaquetas residuales.
    Nota: La cuantificación de miRNAs puede ser afectada significativamente por plaquetas contaminación16.
  5. Coloque 200 alícuotas μl del sobrenadante en frescos 2 mL-microtubos y almacenar a-80 ° C hasta su uso.
    Nota: Un volumen fijo de cada muestra se utiliza para la extracción de RNA; por lo tanto, el volumen de la alícuota debe ser exacto.

2. extracción de RNA

  1. Descongelar las muestras congeladas en el hielo (de paso 1.5).
    1. Mantener muestra frío en hielo durante la extracción de RNA. Enfriar el reactivo de lisis y cloroformo en antes hielo.
  2. Añadir 5 volúmenes (1000 μL) de reactivo de lisis, que contenga solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, a la muestra (200 μL) y mezcla vigorosamente con un vórtex durante 1 minuto.
  3. Añadir 5 μl de 5 nM sintético miRNA de Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Agregar 1 volumen (200 μL) de cloroformo y mezclar vigorosamente con Vortex durante 1 minuto.
  5. Mantener en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrifugar las muestras a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.
  6. Transferir la fase acuosa con cuidado a un nuevo microtubo.
    Nota: No transfieren de la fase orgánica (rojo) o interfase (blanco). El volumen de la fase acuosa recogido debe ser uniforme para evitar manejo de inconsistencia, que resulta en la mayor variación técnica. La cantidad habitual de fase acuosa transferido en este protocolo era 650 μl.
  7. Añadir 1,5 volúmenes (975 μL) de etanol y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.
  8. Transferir la muestra en una columna correspondiente y el adaptador, seguido del secado al vacío durante 3 minutos usando colectores de vacío. Si el volumen de muestra es de más de 700 μl, repita este paso para procesar la solución restante.
    Nota: Aislamiento de RNA base de columna es compatible con el método de vacío y centrifugación.
  9. Añadir 200 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.
  10. Añadir 800 μl de tampón de RCV a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.
  11. Añadir 800 μl de tampón RPE a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.
  12. Repita el paso 2.11.
  13. Añadir 300 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.
  14. Coloque la columna a un nuevo microtubo y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.
  15. La columna de la transferencia a un nuevo microtubo y añadir 50 μl de agua libre de nucleasa.
  16. Reposar a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 minutos y centrifugar a 8.000 × g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.
  17. Vuelva a aplicar el eluido de la columna.
  18. Repita el paso 2.16 y almacenar eluido a-80 ° C hasta su uso.

3. síntesis de cDNA

  1. Descongelar las muestras congeladas (de paso 2.18).
  2. Preparar una concentración conocida de oligonucleótidos sintéticos de RNA que corresponden al objetivo miRNAs.
    1. Uso de oligonucleótidos sintéticos de RNA para generar una curva estándar en qPCR. Solución madre de concentración de 1 x 108 copia/μl está preparado para propósitos de almacenamiento.
    2. Diluir la solución madre 10 veces para obtener 1 x 107 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o solución de trabajo de 1 x 105 copia/μl (muestras previamente amplificadas) como la concentración más alta para la construcción de la curva estándar. En general, un rango sugerido para las concentraciones de la curva estándar es 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas).
  3. Preparar piscina de cartilla de multiplex RT mezclando volúmenes iguales de 20 cartillas de RT x para destino miRNAs.
    Nota: Como se muestra en la figura 2, una piscina que contiene hasta 4 objetivo miRNAs se puede hacer mezclando los cebadores de RT 20 x de cada uno de los miRNAs en la piscina. Cel-miR-238 (control externo) debe ser incluido como uno de los miRNAs de destino en cada tubo. En caso de menos de 4 objetivo miRNAs, añadir volúmenes iguales de buffer TE de 1/10 en vez de 20 x RT la cartilla.
  4. Preparar la mezcla de reacción RT: 3 μl de cebador RT piscina (desde el paso 3.3), 0,15 μl de dNTPs 100 mM con dTTP, 1 μl de transcriptasa reversa (50 U/μL), 1,5 μl 10 x buffer de RT, 0.19 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL) y 4.16 μl de nucleasa-libre del agua.
  5. Mezclar 10 μl de la reacción de RT mezclar con 5 μl de la muestra de RNA (de paso 3.1) u oligonucleótidos (del paso 3.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.
  6. Ejecutar la reversa de la transcripción en un aparato termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguida por un paso de inactivación definitiva de la transcriptasa inversa a 85 ° C por 5 min muestras transcritas atrás de tienda a-80 ° C hasta su uso.

4. preamplificación (opcional)

Nota: Los miRNAs que muestran los valores de Cq por encima de 35 o más en qPCR posteriores son pre amplificados.

  1. Descongelar las muestras congeladas (del paso 3.6).
  2. Hacer diluciones seriadas 10 veces del producto de RT de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 10-5 a 1 x 100 copia/μL para generar la curva estándar.
  3. Preparar piscina de primer ensayo multiplex mezclando volúmenes iguales (5 μl) de 20 x cartillas análisis miRNAs de destino con la concentración final de cada cartilla de ensayo está diluyendo 200-fold de búfer en un volumen final de 1000 μl de TE.
    Nota: Los iniciadores de análisis cuyo objetivo miRNAs puede ser detectable en qPCR posterior sin la amplificación y los cel-miR-238 (control externo) no se incluyen en la piscina de la cartilla.
  4. Preparar la mezcla de reacción de amplificación previa: 12,5 μl de 2 x listo para su uso reactivo preamplification, 3,75 μl de piscina de primer ensayo (de paso 4.3) y 6,25 μl de agua libre de nucleasa.
  5. Mezcla 22,5 μl de la reacción de amplificación previa mezclar con 2,5 μl de muestra transcripción inversa (del paso 4.1) o de oligonucleótidos (del paso 4.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.
  6. Ejecutar la reacción en un aparato termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido de 12 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min. almacenan muestras previamente amplificadas a-80 ° C hasta su uso.

5. cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

  1. Descongelar las muestras congeladas (de paso 3.6 o paso 4.6).
  2. Diluir las muestras 5 veces con agua estéril.
  3. Preparar diluciones seriadas 10 veces del producto RT derivado de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas) para la generación de curvas estándar.
  4. Preparar la mezcla de reacción de qPCR: 10 μl de 2 x reactivo de amplificación listo para su uso, 1 μl de 20 x reactivo de ensayo, que contiene la cartilla de la polimerización en cadena y sonda correspondiente a miRNA blanco, avance/retroceso y 7 μl de agua libre de nucleasa.
  5. Transferencia 18 μL de la mezcla de reacción de qPCR para las placas de reacción de 96 pocillos rápido óptico y añadir 2 μl de muestras diluidas (de paso 5.2 o 5.3 de paso) en los pocillos.
    Nota: Las muestras y estándares para qPCR se configuran por duplicado.
  6. Selle la placa con la película adhesiva y centrifugar brevemente.
  7. Ejecutar la reacción en un termociclador en tiempo real: 95 ° C por 20 s, seguido por 45 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C por 20 s.

6. Análisis de datos

  1. Calcular el número de copia cruda de cada muestra utilizando el software de análisis de datos que trabaja con correspondiente termociclador en tiempo real.
    Nota: Línea de umbral se establece manualmente en "1.0" en todas las placas en el estudio, para confirmar la reproducibilidad en comparación con sus vales de Cq. Nivel de corte se fija en Cq > 40 ciclos.
  2. Calcule el promedio del número de copia cruda de cada muestra de duplicados.
  3. Calcular el factor de corrección dividiendo un número de copia del cel-miR-238 en cada muestra el promedio de número de copia del cel-miR-238 de todas las muestras en un tubo correspondiente.
    Nota: Como se muestra en la figura 2, cada tubo contiene hasta 4 miRNAs de destino incluyendo cel-miR-238 (control externo). Por lo tanto, el factor de corrección se calcula para cada tubo utilizando el correspondiente valor de la cel-miR-238.
  4. Calcular el número de copia ajustada al dividir el número de copia cruda promedio de cada muestra (de paso 6.2) por el factor de corrección (de paso 6.3) para cada muestra.
  5. Calcular el número de copia absoluto multiplicando el número de copia cruda ajustada de cada muestra (de paso 6.4) por el el factor de dilución para cada muestra.
    Nota: El factor de dilución es "5" en el presente Protocolo, que se deriva de paso 5.2.
  6. Calcular la eficiencia de amplificación por PCR de la pendiente de la parcela de los valores de Cq para cada dilución serial contra concentración de cDNA de registro.
    Nota: Fórmula para el cálculo de la eficiencia; E = (10(-1/pendiente) -1) x 100%.
  7. Calcular la variación técnica utilizando los valores de Cq de cel-miR-238 de todas las muestras mediante la fórmula E = (eficacia de la amplificación de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Nota: Los pasos 6.5 y 6.7 se utilizan para la evaluación de la calidad del procedimiento.

Resultados

Flujo de trabajo de análisis de miRNA por RT-qPCR y calidad assessment
La figura 1 muestra el flujo de trabajo de miRNA análisis de muestras de sangre usando qPCR10. La calidad de los experimentos puede ser verificada mediante la inclusión de cel-miR-238 como un control externo. Esto revelará las variaciones técnicas en la extracción de RNA y RT-qPCR posteriores procesos. En este estudio, la media ± ...

Discusión

Nuestra evaluación completa proporciona un análisis estadístico más riguroso de la amplitud de la gama dinámica, que indica claramente que la magnitud de la variación entre muestras individuales fue muy diferente entre los miRNAs probado. Aunque estas variaciones pueden atribuirse a sus pequeñas cantidades en los fluidos corporales, debe señalarse que estos datos reflejan no sólo las variaciones biológicas, sino también variaciones técnicas. La mayoría de la variación de la técnica puede ser evaluada media...

Divulgaciones

El autor no tiene ningún conflicto de interés que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de organismos de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Referencias

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