Identificación de OTX1 y OTX2 como dos posibles marcadores moleculares para los Carcinomas Sinonasal y Neuroblastomas olfatorios

Resumen

Homeobox genes son genes reguladores, a menudo asociados con tumores en los organismos adultos. Investigamos su expresión comparativa por inmunohistoquímica y análisis PCR en tiempo real, en normal e inflamatoria de la mucosa nasal y en neoplasmas de sinonasal para utilizarlas como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas.

Resumen

Los genes homeobox (HB) OTX se expresan durante la morfogénesis embrionaria y durante el desarrollo del epitelio olfativo en organismos adultos. Las mutaciones en estos genes suelen relacionarse con la tumorigénesis en humanos. No hay datos están disponibles en la actualidad respecto a la posible correlación entre los genes OTX y tumores de la cavidad nasal. El objetivo de este trabajo es entender si OTX1 y OTX2 pueden considerarse como marcadores moleculares en el desarrollo de tumores nasales. Se seleccionaron los adenocarcinomas nasales y sinonasal para investigar la expresión de los genes OTX1 y OTX2 mediante inmunohistoquímica y análisis PCR en tiempo real. OTX1 y OTX2 estuvieron ausentes en todas las muestras de sinonasal Adenocarcinomas de tipo Intestinal (ITACs). OTX1 mRNA fue identificado solamente en los Adenocarcinomas de tipo Intestinal no (NITACs) mientras que el mRNA de OTX2 fue expresado solamente en Neuroblastomas olfatorios (ONs). Hemos demostrado que la expresión génica diferencial de los genes OTX1 y OTX2 podría ser un marcador molecular útil para distinguir los diferentes tipos de tumores sinonasal.

Introducción

OTX Los genes de la HB son el homólogo vertebrado de los genes de orthodenticle de Drosophila (otd) codifican para factores de transcripción que se expresan normalmente durante la morfogénesis embrionaria, y puede expresarse también en el organismo adulto con diversas funciones . Durante el desarrollo embrionario que controlan la especificación de identidad celular, diferenciación celular y la colocación de la axis¹ del cuerpo. La familia OTX incluye genes OTX1 y OTX2 que muestran diversas funciones. OTX1 participa en el cerebro y el desarrollo del órgano sensorial. En el organismo adulto, que se expresa en órganos sensoriales y se transcribe en niveles bajos en el lóbulo anterior de la hipófisis²; también desempeña un papel en la hematopoyesis, se expresa en hematopoyéticas pluripotenciales y progenitoras de las células³. OTX2 participa en el desarrollo de la cabeza rostral y sus actos de proteína traducida como un morfógeno porque genera un gradiente a través de qué otros genes activados o reprimidos de manera espacio-temporal, contribuyendo así a la célula proliferación y diferenciación. En el organismo adulto, OTX2 se encuentra exclusivamente en la glándula pineal y plexo coroideo⁴.

Mutaciones en genes OTX suelen relacionarse con la aparición de defectos congénitos, somáticas o metabólicos humanos. Ganancia o pérdida de mutaciones en genes OTX podrían promover tumorigenesis si no son capaces de controlar adecuadamente el crecimiento y diferenciación celular⁵. En leucemias y linfomas, así como en muchos tumores sólidos (e.g., meduloblastomas⁶, linfomas no Hodgkin agresivos², carcinomas de mama⁷, cánceres colorrectales⁸y retinoblastoma⁹), la expresión desregulada de OTX HB genes es bien documentado¹⁰. Además, se han demostrado mutaciones de OTX2 en casos de anophthalmia y microphtalmia¹¹ debido al papel crucial de este gen en el control del desarrollo del ojo.

En el contexto de neoplasias sólidas, el descubrimiento de marcadores moleculares y fenotípicos es un reto importante para el diagnóstico, clasificación y tratamiento de varios tipos de tumor¹¹, los que se originan en la cavidad nasal y paranasal incluidos senos paranasales. De hecho, a pesar de estas áreas ocupan sólo un modesto espacio anatómico, epitelio de la mucosa, glándulas, tejidos blandos, hueso, cartílago o neural/neuroectodermal y hematolymphoid células pueden ser a menudo el sitio del origen del complejo e histológicamente diferentes grupos de tumores. Diferentes tipos de tumores que involucran el tracto sinonasal presentan una variedad de características que superan lo que se ve generalmente en la zona aerodigestive superior o incluso a través de la mayoría de las partes del cuerpo¹². Malignidades de sinonasal son raras y presentan una incidencia anual de 1: 100.000 habitantes en todo el mundo, y así que esto evita que los estudios sobre las vías implicadas en la tumorigénesis y la prueba de estrategias de tratamiento alternativas. A pesar de ello, los avances en proyección de imagen técnicas, abordajes quirúrgicos y radioterapia han mejorado el manejo clínico de cáncer sinonasal. Por otra parte, el desarrollo de líneas celulares, así como modelos animales y perfiles genéticos de cáncer actualmente constituyen la base para las futuras terapias contra el cáncer dirigidas a¹³. Hasta la fecha, no hay ningún informe sobre expresión OTX1 y OTX2 , en neoplasias de la cavidad nasal, senos paranasales y nasofaringe. Ya anteriormente hemos observado que OTX1 y OTX2 están implicados en el cáncer de mama⁷, nos preguntamos si estos genes podrían estar presentes no sólo en la mucosa nasal normal sino en tumores de la cavidad nasal. Para lograr este objetivo que hemos obtenidos del Departamento de patología de la «Ospedale di Circolo"en muestras de Varese de mucosa normal y adenocarcinomas nasales y sinonasal 1985 para 2012 y se clasifican según la Organización Mundial de la salud (OMS) clasificación de tumores de cabeza y cuello. Elegimos analizar a través de análisis en tiempo real de PCR e inmunohistoquímica y evaluamos la expresión OTX1 y OTX2 para determinar si pueden considerarse marcadores moleculares para estos tipos de tumores.

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Protocolo

Todos los estudios fueron realizados según la declaración de Helsinki (1975) con el consentimiento informado por escrito y aprobado por el Comité de ética de la Universidad de Insubria en Varese.

1. recolección de las muestras

1. Recoger y todas las muestras humanas de Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) se dividen en diferentes subgrupos según la clasificación del WHO de tumores de cabeza y cuello¹⁴.
   Nota: Aquí utilizamos las siguientes muestras: mucosa sinonasal Normal como control (10 muestras); Papiloma invertido (PI, código de la CIE-O 8121/1); ITAC Sinonasal (ICD-O code 8144/3, 32 muestras); NITAC (código de la CIE-O 8140/3, 12 muestras); Carcinoma enquistado adenoideo (ACC, código 8200/3 de la CIE-O); Adenoma Pleomórfico (PA, código 8941/3 de la CIE-O); (Código de la CIE-O 9522/3, 13 muestras); Poco diferenciado Carcinoma del Neuroendocrine (PDNEC, código de la CIE-O 8041/3, 19 muestras); Tumor neuroendocrino (neto, código de la CIE-O 8041/3).

2. inmunoquímica

1. Parafina y rehidratación de secciones
   1. Calentar los portaobjetos de la muestra en un horno a 60 ° C por 30 min y rehidratar 3 μm espesor secciones FFPE usando una serie de alcohol al agua.
   2. Lave el portaobjetos en xileno durante 10 minutos y repita este paso; lavar los portaobjetos durante 5 minutos en alcohol al 100% y repita este paso con alcohol 95%, 85% y 75% en serie. Enjuague los portaobjetos durante 5 minutos en agua destilada.
2. Bloqueando la actividad endógena
   1. Bloquear la actividad endógena mediante la colocación de las diapositivas en 3% peróxido de hidrógeno acuoso durante 12 minutos.
3. Recuperación de antígeno
   1. Tratar con 10 mM de tampón de citrato (pH 6) por 10 min en un tratamiento de microondas para realizar recuperación de antígeno.
4. Incubación con el anticuerpo primario
   1. Lavar los cortes en tampón TBS (pH 7.4) y luego añadir solución de bloqueo durante 10 minutos.
   2. Lavar los cortes en tampón TBS (pH 7.4) y luego añadir 0,2% Tritón X.
   3. Incubar durante una noche a 4 ° C con cabra anti-humano OTX2 anticuerpo diluido 1: 100.
5. Incubación con el anticuerpo secundario
   1. Incubar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con biotinilado conejo anticuerpo secundario de anti-cabra diluido 1: 200 seguido de ABC peroxidasa complejo (véase Tablas de materiales).
6. Desarrollar el immunoreaction
   1. Desarrollar el immunoreaction con 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidina y contratinción los núcleos con Harris Hematoxylin.
7. Montaje y proyección de imagen
   1. Deshidratan las secciones utilizando una escala creciente de alcohol y aclarar a través de una sustancia de limpieza de origen terpeno (véase Tabla de materiales). Insertar secciones en medio de montaje, coloque las secciones en un portaobjetos de microscopio y observar las secciones a través de un microscopio óptico.

3. ARN extracción y reverso-transcripción

1. Extracción de RNA
   1. Extracto de RNA de las secciones por realizar el primer paso del Protocolo de inmunoprecipitación (ver sección 2.1) y mantener los portaobjetos en agua destilada. Sobreponga las secciones sin manchas con la hematoxylin-eosina correspondiente secciones manchada para identificar fragmentos de interés.
   2. Realizar la extracción de RNA utilizando un kit comercial de extracción de RNA para muestras FFPE (véase Tabla de materiales) y siguiente las instrucciones.
2. Reverso-transcripción del RNA
   1. Utilice un kit comercial para retro-transcribir RNA en cDNA (véase Tabla de materiales) siguiendo el protocolo. Retro-transcribir por lo menos 1.000 ng de RNA total para llevar a cabo varios análisis.

4. en tiempo real PCR y análisis de datos

1. PCR en tiempo real
   1. Realizar análisis PCR en tiempo real cuantitativos (qRT-PCR) con tecnología de punta de prueba (véase Tabla de materiales) y un termociclador.
2. Preparación de la mezcla de reacción de PCR
   1. Preparar la mezcla de reacción de PCR usando 12,5 μl de la mezcla principal basada en sondeos, 1.25 μl de OTX1 y OTX2 ACTB sondas (véase Tabla de materiales), 50 ng del cDNA y libre de nucleasas hasta 25 μl de volumen total de agua.
   2. Llevar a cabo todas las reacciones por triplicado utilizando el gen ACTB como control endógeno para normalizar los niveles de expresión génica.
   3. Centrifugar la placa a 1.109 x g durante 3 min y guardar la placa protegida de la luz a 4 ° C hasta que el experimento.
3. Ajuste el termociclador
   1. Conjunto el perfil de Termociclador con un caliente inicio ciclo a 50 ° C por 2 min y 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C por 15 s y un ciclo final a 60 ° C durante 1 minuto.
4. Análisis nivel de expresión génica
   1. Normalizar los niveles de expresión génica mediante el método de umbral (ΔCt) ciclo comparativo utilizando el gen ACTB como control endógeno.
   2. Evaluar los niveles de expresión génica utilizando el método 2^-ΔCt y trazar los resultados.
5. Análisis estadísticos
   1. Realizar análisis estadísticos usando de Student t-Test, considerando los resultados estadísticamente significativos con p < 0.05.

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Resultados

En la mucosa normal se observó reactividad nuclear fuerte y homogénea para los genes OTX en el epitelio seudoestratificado ciliado de tipo respiratorio y en las células glandulares submucosas (figura 1A). Encontramos expresión nuclear para OTX1 en todas NITACs las muestras (figura 1B), mientras que poco o ausente immunoreactivity fue destacada en ITACs (figura 1). Immunoreactivity intenso estuvo ...

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Discusión

Este estudio muestra por primera vez que, a niveles del mRNA, se expresan los genes de la HB OTX1 y OTX2 sinonasal normal mucosa y las glándulas submucosal, pólipos inflamatorios, papilomas de Schneiderian sinonasal y en las distintas epiteliales y neuroectodérmicos Neoplasias, incluyendo epidermoide sinonasal adenocarcinomas de tipo no-intestinales, tumores tipo glándula salival, neoplasias neuroendocrinas y ONs.

Modificaciones y resolución de problemas:

Para evi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799