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Resumen

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Resumen

Caracterización de los clusters, regularmente otro, corto, palindrómico repetir (CRISPR) sistema de Streptococcus pyogenes ha permitido el desarrollo de una plataforma personalizable para rápidamente generar modificaciones gen en una amplia variedad de organismos, incluyendo peces cebra. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza a una guía única RNA (sgRNA) a una endonucleasa CRISPR-asociado (Cas) a un objetivo de ADN (gDNA) genómica de interés, donde la endonucleasa Cas genera una rotura de doble cadena (DSB). Reparación de distritales por mecanismos errores conducen a inserciones y/o deleciones (indels). Esto puede causar mutaciones del mutágeno ' frameshift ' que a menudo introduce un codón de parada prematuro dentro de la secuencia de codificación, creando así un alelo nulo de proteínas. Ingeniería basada en CRISPR genoma requiere sólo unos pocos componentes moleculares y se introduce fácilmente en embriones de pez cebra por microinyección. Este protocolo describe los métodos utilizados para generar reactivos CRISPR para microinyección de pez cebra y para identificar los peces que transmisión del germline de los genes modificados CRISPR. Estos métodos incluyen la transcripción in vitro de sgRNAs, microinyección de reactivos CRISPR, identificación de indels inducida en el sitio de destino utilizando un método polimerización en cadena-basado llamado un ensayo de movilidad del heterodúplex (HMA) y caracterización de los indels con un rendimiento bajo y un potente secuenciación de próxima generación (NGS)-basado en el enfoque que puede analizar varios productos de PCR de peces heterocigotos. Este protocolo se optimiza para minimizar la cantidad de peces necesaria y el tipo de equipo necesitado para realizar los análisis. Además, este protocolo está diseñado para ser susceptibles de uso por personal de laboratorio de todos los niveles de experiencia incluyendo a estudiantes, lo que permite esta poderosa herramienta económicamente ser empleado por cualquier grupo de investigación interesado en la realización de base de CRISPR modificación genómica en pez cebra.

Introducción

La conservación de la maquinaria molecular en eucariontes es la base de la potencia del uso de organismos modelo para la investigación. Muchos de estos sistemas modelo facilitan el uso de enfoques genética reversa como knockouts de genes específicos para caracterizar la contribución de un producto del gene a un proceso biológico o enfermedad de interés. Técnicas de interrupción de genes en organismos como el pez cebra han dependido históricamente de introducción dirigida de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' que resultan de reparación imprecisa de distritales1,2. Cuando un DSB se introduce en el genoma, la lesión del ADN se repara a través de dos vías que están universalmente presentes en casi todos los tipos de células y organismos: no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) y dirigido por homología reparación (HDR)3,4 . La naturaleza imprecisa de la maquinaria NHEJ con frecuencia produce indels de varias longitudes5,6,7,8,9. Introducción de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' en la secuencia de codificación de un gen puede producir un codón de parada prematuro, que a menudo hace que el gen no funcional.

Principios estrategias de ingeniería de genoma en el pez cebra para promover indels incluyen meganucleases, las nucleasas de dedos de zinc y nucleasas de efectoras como activador de transcripción, que utiliza las interacciones DNA proteína para una nucleasa para un específico de la genómica destino donde introdujo un DSB10,11,12,13,14,15. Sin embargo, estas tecnologías son a menudo difíciles de aplicar debido a la ingeniería laboriosa y complejo, necesaria para generar una nucleasa que dirige la secuencia de ADN de interés. A diferencia de estrategias anteriores, edición basada en CRISPR gene no depende de las interacciones DNA proteína para apuntar. En cambio, la endonucleasa CRISPR-asociado (Cas) se dirige a través de una guía de RNA que utiliza la base de interacciones de apareamiento de nucleótidos a un sitio de genómico de interés16,17,18,19 ,20,21. Debido a la simplicidad del diseño de un RNA guía con la base deseada vinculación interacciones para apuntarlo es relativamente fácil tratar la endonucleasa de Cas para el locus deseado. El tipo sistema de II CRISPR en particular ha sido ampliamente desarrollado para aplicaciones de edición de genoma debido a varias características ventajosas incluyendo el uso de una sola multidominio Cas nucleasa (Cas9) que requiere la interacción con el ADN para estimular la actividad de endonucleasa y uso de un guía única RNA (sgRNA) dirigirse al cognado de secuencia de ADN18. Los requisitos de la secuencia necesarios para atacar lo sgRNA cognado son bien entendido19y lo sgRNA deseada se genera fácilmente por en vitro de la transcripción. La sencillez y la solidez del enfoque CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificación genética dirigida en pez cebra y una amplia variedad de otros organismos.

La mayor capacidad a llevar a cabo la edición del genoma específica en el pez cebra como resultado de la elaboración de reactivos basados en CRISPR tiene significativamente mayor la oportunidad de estudiar procesos emblemáticos de organismos vertebrados tales como el desarrollo de la central nerviosa sistema. El genoma del pez cebra contiene ortólogos del 70% de los genes de codificación de la proteína encontrados el genoma humano así como el 84% de los genes asociados con enfermedades en los seres humanos22. Desarrollo del pez cebra presenta varias cualidades claves que potencian su uso en estudios genéticos reversos: los embriones se colocan en grandes garras, desarrollar desde el exterior de la madre lo que los hace susceptibles de genética manipulación por microinyección y pez cebra adulto sexualmente maduros por 3 meses de edad, lo que permite la propagación rápida de líneas deseada23.

Existen numerosos protocolos que describen una variedad de enfoques para generar e identificar derivados CRISPR indels en pez cebra24,25,26,27,28,29 ,30,31. Sin embargo, muchos de estos procedimientos son tiempo intensivo, requieren el acceso a equipos costosos y pueden ser un desafío para los laboratorios con limitados conocimientos. Los pasos descritos proporcionan una sencilla, robusta y económica CRISPR/Cas9 estrategia Ingeniero pez cebra nocaut líneas. Este protocolo describe el uso de un equipo altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleótidos de DNA (oligos), similar a otros enfoques que han sido descritas32. El protocolo descrito incluye dos pasos en particular que simplifican grandemente el análisis de líneas CRISPR-transformado: paso a paso uso de HMA basada polimerización en cadena33 para determinar fácilmente la presencia de modificaciones del genoma y el análisis de la secuencia de pez cebra heterozigótico para rápida y fácilmente determinar la naturaleza de indels múltiples de una manera económica. Además, instrucciones paso a paso se incluyen para selección robusto, producción confiable y la inyección de guía RNAs. Los pasos indicados aquí son un ejemplo de un protocolo robusto, relativamente barato que permite que el personal de laboratorio con una gama de conocimientos contribuir a la identificación de los knockouts de genes en el pez cebra.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud. El protocolo fue aprobado por el cuidado de animales de Purdue y uso (número de PACUC 31/08/11).

1. diseño de Oligos específicos de la plantilla para la producción de guía ARN

  1. Seleccione la región de destino de interés a ser modificados en la región codificante del gen. Esto debe ser cerca del extremo 5' del gen genera una proteína truncada, pero no tan cerca que un codón de inicio en el marco posterior permite la producción de una proteína con un modesto truncamiento N-terminal.
    Nota: Una manera de impedir esta posibilidad es explorar la región aguas abajo la codificación del gene para un marco en comienzo codon. Además, utilizando a una guía de ARN que dirige el centro de un exón grande, puede ayudar a identificar cartillas de la polimerización en cadena para posterior calificación de indel resultante.
  2. Identificar sitios potenciales de la guía de la región genómica de interés usando una guía de selección de RNA (véase Tabla de materiales)34,35,36del programa. Configurar los datos del navegador al Danio rerio y la secuencia del motivo adyacente (PAM) de protospacer a 5'-NGG-3 '.
    Nota: GRNA Ideal secuencias contienen un 5-G en la primera posición de la gRNA T7 eficiente en vitro la transcripción. Si no hay guía aceptable se encuentra con una G en la posición 5, la base 5 de la guía de otro puede ser alterada a una G o una G se puede Agregar en el extremo 5′ de la guía de RNA, pero esto puede reducir la eficiencia de corte37. Para maximizar la eficacia del corte, una secuencia óptima guía tiene 40-80% de contenido de GC (mayor es mejor) y contiene una G enla posición 20, adyacente al PAM, pero no es necesario38. Un ejemplo de una secuencia de segmentación ideal: 5 - G (N)18 G-3′ - NGG (NGG es el PAM). Además de examinar los resultados del programa de selección de RNA guía para identificar la óptima guía RNAs como se describió anteriormente, se debe tener cuidado para evitar guía RNAs con fuertes efectos previstos de objetivo que complicar grandemente análisis aguas abajo. En particular, guía RNAs con efectos off-target previstos que entran dentro de las regiones de codificación debe ser excluido, y deben reducirse al mínimo los sitios objetivo total previstos.
  3. De la salida de la herramienta de diseño de guía RNA, excluir la secuencia de PAM (NGG 5′-3′); no se utiliza para apuntar pero comprende la secuencia de reconocimiento para Cas9 escote.
  4. A los restantes 20 nucleótidos (nts), agregue la secuencia de promotor de T7 y la secuencia de superposición (región complementaria a un oligo de andamio utilizado para sintetizar sgRNAs longitud total suministrado en el kit de transcripción recomendada en vitro ) en el orden indicado a continuación para obtener un oligo de nt 54: secuencia de promotor de T7: TTCTAATACGACTCACTATA 5′-3′; Guía de RNA secuencia 5′ - G (N)18 G-3 '; Secuencia de traslape: GTTTTAGAGCTAGA 5′-3′
  5. Identificar iniciadores PCR que flanquean el sitio de corte previsto (Cas9 hiende 3 nt aguas arriba de la secuencia de PAM) a una distancia de 50 – 150 pares de bases (PB) cada del corte mediante software basado en web (véase Tabla de materiales).
    Nota: Estos se utilizará en un paso posterior para la medición de la eficiencia de corte. Si no adecuados primers se identifican con estas limitaciones, otro sitio de RNA de la guía puede necesitar ser considerado.
  6. Orden 54 oligonucleótidos de nt para producir a la guía de cebadores de RNA y PCR para el análisis de los sitios de destino (véase Tabla de materiales).
    Nota: Como opcional control positivo, puede ser útil producir un sgRNA dirigido a un gen necesario para la producción de pigmento para comprobar el rendimiento de este protocolo utilizando un fenotipo fácilmente anotó visual (vea la figura 1 para obtener resultados representativos). Un objetivo común es el gen tirosinasa, usando el oligo (guía secuencia de ARN es subrayada)39: 5′-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3 '

2. preparación de reactivos CRISPR para microinyección de embriones

  1. Orden proteína Cas9 comercialmente disponible (véase tabla de materiales).
    Nota: La inyección de mRNA de Cas9 puede también utilizarse para generar indels en pez cebra40,41, sin embargo microinyección de embriones de pez cebra con proteína Cas9 ha demostrado ser más eficaz32,42.
    1. Suspender la proteína Cas9 en el tampón suministrado para generar una solución de 1 mg/mL. Almacenar la solución en inyección-listo alícuotas en tubos de PCR a-80 ° C para reducir el número de ciclos hielo-deshielo. Para generar una solución de inyección 5 μl, 2 μl de 1 mg/mL Cas9 solución se utiliza, por lo tanto la Cas9 puede alícuotas en 2 alícuotas de μl PCR tira-tubos.
  2. Sintetizar lo sgRNA usando la sgRNA en vitro transcripción kit (véase Tabla de materiales). Realizar la transcripción en vitro según las instrucciones del fabricante.
    Nota: Mantener libre de Rnasa técnica durante pasos todos de preparación de solución de síntesis, limpieza y la inyección. Por ejemplo, usar guantes desechables y cambiarlos con frecuencia, utilizar tubos y puntas que están certificadas libres de RNasa y limpiamos superficies y pipetas disponibles en el mercado soluciones para descontaminar el material de laboratorio (véase Tabla de materiales).
  3. Purificar lo sgRNA sintetizada mediante una precipitación de acetato de amonio utilizando técnica libre de Rnasa.
    Nota: Como alternativa, sgRNAs puede ser purificado usando una variedad de RNA base de columna disponible comercialmente limpiar kits para un costo relativamente modesto.
    1. Añada 25 μl de acetato de amonio de 5 M y agitar para mezclar bien.
      Nota: Solución de acetato de amonio está disponible en el mercado (véase Tabla de materiales), o una solución de 5 M puede ser hecha en casa añadiendo 1 mL de agua libre de ARNasa 385,4 mg de acetato de amonio grado molecular y almacenada a-20 ° C.
    2. Añadir 150 μL de etanol de prueba de 200 libre de nucleasas para cada muestra. Lugar la reacción en un congelador de-80 ° C durante un mínimo de 20 minutos.
      Nota: Las muestras pueden almacenarse durante la noche a-80 ° C, pero no aumentará significativamente la producción de RNA total.
    3. Centrifugar las muestras a la máxima velocidad (> 16.000 x g) en una microcentrífuga de 4 ° C por 20 min.
    4. Retire con cuidado el sobrenadante transfiriendo poco a poco el líquido, asegurando que el pellet de RNA no se disturba.
    5. Añadir 1 mL de etanol al 70% (creado por diluir etanol libre de nucleasas en agua libre de ARNasa) y mezclar suavemente el tubo invirtiéndolo varias veces para lavar la sal residual del tubo.
    6. Repetir la centrifugación por 7 min.
    7. Quite el sobrenadante mediante pipeteo primera la mayoría de la solución con una pipeta P1000, entonces utilice una pipeta P200 para quitar tanta solución como sea posible sin perturbar el pellet. Secar el pellet de RNA en un espacio limpio, como una campana de flujo laminar o una mesa, teniendo cuidado de evitar la contaminación de la Rnasa, durante 15 minutos o hasta que el líquido no más gotas son visibles en el tubo.
    8. Resuspender el precipitado en 30 μl de agua libre de ARNasa, cuantificar el producto (por ejemplo utilizando un espectrofotómetro) y la parte alícuota de la solución para el almacenamiento a largo plazo en un congelador de-80 ° C.
      Nota: Concentraciones típicas entre 800 – 2.500 ng/μl.
  4. (OPCIONAL) Verificar que se ha generado largo RNA utilizando urea/página. Alternativamente, utilice un gel de agarosa para verificar que el ARN está intacto.
    Nota: Sin embargo, si se utiliza un gel de agarosa mayor cantidad de gRNA se debe ejecutar para visualizar el ARN, y la longitud no puede ser determinada con precisión. Al analizar la eficiencia de corte de destino después de la inyección de los reactivos en los peces, si hay corte no o poco presentes lo sgRNA debe medirse para su degradación.
    1. Echa un gel de poliacrilamida al 8% en TBE con 8 M urea mediante técnica libre de Rnasa para las soluciones y equipos de43y 40% poliacrilamida (19:1).
      Nota: Los materiales comercialmente disponibles se pueden utilizar para limpiar el equipo (véase Tabla de materiales).
    2. Después de que el gel ha solidificado completamente (aproximadamente 30 min), equilibre el gel colocándolo en TBE buffer de ejecución y realizar la electroforesis durante 30 min a 5 V/cm.
    3. Mezcla de 300 a 500 ng de sgRNA con un volumen igual de 2 x carga de RNA gel colorante (véase Tabla de materiales). Usando una P1000, claro los pozos de cualquier residuo mediante pipeteo corriente buffer en cada bien varias veces. Las soluciones de carga y correr el gel a 10 V/cm durante 2,5 horas.
      Nota: Un carril marcador aquí es útil para visualizar la longitud del ARN pero no es necesario; generalmente es evidente si completo longitud RNA ha sido sintetizada (figura 2).
    4. Visualizar las bandas usando un ácido nucleico de la mancha (véase Tabla de materiales).
      Nota: sgRNA bandas deben aparecer como una sola banda, mientras que manchas indica degradación de RNA (figura 2).

3. microinyección de CRISPR-componentes en embriones de pez cebra

  1. Instalar tanques de cría la noche antes de la inyección colocando la cantidad deseados hombres y mujeres (típicamente 2 hembras y machos de 1 o 2) en un tanque de cría con un divisor en el lugar44.
  2. Preparar una placa de microinyección con agarosa al 1,5% en los medios de x E3 1 (véase Tabla de materiales) con azul de metileno 0,01% (un fungicida) vierte 35 mL de la agarosa fundida en una placa de Petri de 10 cm y Coloque suavemente un molde plástico para crear canales en forma de cuña en la solución, golpear ligeramente el molde para eliminar las burbujas de aire.
  3. Permite la agarosa, y almacenar el plato con una pequeña cantidad de los medios de comunicación y envuelto en película de parafina para evitar que la placa se seque a 4 ° C.
    Nota: Las placas de inyección son reutilizables para varias semanas, hasta que los pozos se deforme o seco, o la placa comienza a crecer moho.
  4. En la mañana de inyectar, descongelar sgRNA purificada y proteína Cas9 en hielo. Recuerde manejar todos los materiales con los guantes para evitar la contaminación de la Rnasa y utilizar tubos y puntas libres de Rnasa.
  5. Generar una solución de inyección 5 μl combinando proteína Cas9 y lo sgRNA en una proporción de 2:1 de Cas9:sgRNA para obtener concentraciones finales de 400 pg/nL Cas9 proteína y 200 pg/nL sgRNA. Incubar la solución Cas9/sgRNA a temperatura ambiente durante 5 min permitir la Cas9 y sgRNA formar un complejo de ribonucleoproteína. Añadir 0,5 μl de solución de rojo de fenol 2,5% wt/vol (véase la Tabla de materiales), y libre de Rnasa de agua hasta un volumen final de 5 μl.
    Nota: La fuerza iónica de la solución se ha demostrado para afectar la solubilidad de lo complejo, por lo tanto la adición de KCl puede aumentar la eficacia del corte de sgRNAs que presentan baja indel formación28Cas9/sgRNA.
  6. Hacer una aguja tirando un vaso de 1,0 mm capilar utilizando un extractor de la micropipeta. Cortar la punta de la aguja recién hechos con una nueva hoja de afeitar o pinzas para obtener una apertura angular que fácilmente penetrarán en el corion y saco vitelino.
  7. Coloque la aguja en un micromanipulador unido a un microinyector con la fuente de aire encendida. Bajo un microscopio de luz con el aumento conveniente de la calibración determinada por el aparato especial, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja constantemente expulsa una 1 solución de nL en una placa Petri con aceite mineral.
    Nota: La calidad de la aguja es crítica. Práctica produce una aguja de inyectar en el saco vitelino de los embriones hasta que esta habilidad se domina antes de intentar otros experimentos45.
  8. Saque el divisor y los peces para reproducirse durante aproximadamente 15 minutos.
    Nota: Tiempo de cría se producen más embriones, sin embargo la inyección debe ser realizada mientras que los embriones en la etapa 1-célula para maximizar la posibilidad de corte Cas9 ocurrirá temprano y por lo tanto disminución del mosaicism genético. Embriones se pueden inyectar en etapas posteriores (2 a 4 etapas de la célula), pero posiblemente esto puede disminuir la tasa de transmisión del germline del alelo modificado.
  9. Recoger los huevos utilizando un colador y enjuáguelos en una placa de Petri con medios de x E3 1 0,0001% azul de metileno de 10 cm. Examinar la salud de los huevos bajo el microscopio óptico, eliminando desechos y huevos no fertilizados.
  10. Dejar reposar 10 – 15 embriones como control uninjected en una placa Petri separadas, rotulado.
  11. Usando una pipeta, línea suavemente los huevos en la placa de inyección calentada a la temperatura ambiente.
  12. Bajo un microscopio de disección con 2,5 aumentos, inyectar 1 nL de la solución en el saco de la yema de cada embrión para inyectar un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de sgRNA.
    Nota: Para aumentar el corte si es necesario o deseado, aumentar la concentración final de proteína Cas9 para 800 pg/nL y de sgRNA a 400 pg/nL en la solución de la inyección; sin embargo, esto también puede cortar fuera del objetivo de aumentar o disminuir la salud del embrión. También puede aumentar la eficiencia de corte por inyección directamente en la celda46. Sin embargo, la inyección en el saco de yema de huevo es técnicamente menos exigente y da corte suficiente para producir peces con transmisión del germline alta (> 70% de crías que contiene un alelo modificado).
  13. Devolver los embriones inyectados a un plato de Petri debidamente etiquetados, cubrir con 1 medios de x E3 con azul de metileno y ponerlos en una incubadora de embriones a 28 ° C.
  14. A las 24 h post fertilización (hpf), inspeccionar la salud de los embriones inyectados, eliminación de individuos muertos o anormal desarrollo y cambiar los medios de comunicación (ver figura 3). Compruebe la tasa de supervivencia contra el control uninjected.
    Nota: Cuando dirigido a un gen no esencial, a menos de 10% de mortalidad se espera que en relación con el control uninjected. Si se observan niveles elevados de mortalidad en las poblaciones de guía de inyección en comparación con el control de uninjected, puede indicar que el gen objetivo es esencial para el desarrollo, o efectos off-target están conduciendo al desarrollo fallido. Puede que sea necesario reducir la cantidad de reactivos de CRISPR inyectados o generación de un nuevo sgRNA con reducidos efectos off-target puede ser necesario.
  15. Vuelva los embriones a la incubadora y seguir creciendo a los embriones a 72 hpf, cambiando los medios de comunicación todos los días para mantener la salud del embrión.

4. Análisis de eficiencia de formación de Indel usando una HMA

  1. Recoge dos conjuntos de cinco embriones de las placas inyectadas a 72 hpf en tubos de microcentrífuga y recoger un conjunto de cinco embriones de un control uninjected.
  2. Anestesiar los embriones mediante la adición de 0.004% MS-222 (Metanosulfonato) y esperar 2 minutos.
  3. Para extraer el gDNA, pipetear los medios de comunicación de cada conjunto de embrión y añadir 45 μl de NaOH de 50 mM. Incubar los embriones a 95 ° C durante 10 minutos.
  4. Eliminar embriones de la fuente de calor y enfriar a temperatura ambiente. Añadir 5 μl de 1 M Tris-HCl, pH = 8 y agitar las muestras vigorosamente (5-10 s). Centrifugue la solución a la velocidad máxima (> 16.000 x g) en una microcentrífuga de temperatura durante 3 minutos, transferir el sobrenadante a un tubo limpio y rotulado y almacenar gDNA a-20 ° C ADN hasta por 6 meses.
    Nota: Fragmentos de ADN de aproximadamente 900 PB y más pequeño generado a través del uso de este protocolo.
  5. Establecer una reacción de PCR de 50 μL con 2 μl de la gDNA preparado de cada muestra (incluyendo un control uninjected) por las instrucciones incluidas con la polimerasa, usando los cebadores previamente diseñados que flanquean el sitio de corte previsto.
  6. Purificar el PCR usando un PCR de limpieza kit (véase Tabla de materiales), eluir las muestras en 30 μl de tampón de agua o elución y cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro.
  7. Reanneal todos 30 μl de cada producto PCR purificado mediante la colocación de los tubos en un rack flotante en un baño de agua hirviendo (aproximadamente 150 mL en un vaso de precipitados de 500 mL). Después de 3 minutos, apague la fuente de calor y que las soluciones se enfríe a temperatura ambiente, aproximadamente 1 h.
    Nota: Este paso primero desnaturaliza el DNA y entonces permite que las hebras a reanneal al azar para generar bandas del heterodúplex posible, o no coinciden los ADN de doble cadena que contiene polimorfismos crearon por mutagénesis CRISPR y por lo tanto tienen una alteración movilidad electroforética frente a homoduplexes. El último ciclo de PCR o rampa-programa en el termociclador puede utilizarse también para reanneal productos47,48, pero uso el baño hirviendo puede producir resolución mejorada de los productos del heterodúplex.
  8. Añadir 5 μl de 6 x carga colorante (véase Tabla de materiales) a las soluciones reannealed de la polimerización en cadena.
  9. La fundición de un gel de poliacrilamida/TBE de 15% con 30% de poliacrilamida (29: 1). Después el gel, colóquelo en un aparato de electroforesis con TBE buffer de corriente. Usando una P1000, limpiar los pozos de todos los desechos como sales residuales o gel fragmentos que pueden obstruir los pozos transfiriendo suavemente buffer hacia arriba y hacia abajo en los pocillos varias veces.
  10. Carga 500 ng de la reannealed productos de la PCR y la carga un control (ejemplo de peces uninjected) al lado de cada conjunto de muestras sgRNA. Correr el gel a 150 V durante 2,5 horas o hasta que el frente de tinte es en la parte inferior del gel.
  11. Visualizar las bandas mediante una tinción de ácidos nucleicos (p. ej., bromuro de etidio o SYBR green (véase Tabla de materiales)).
  12. Examinar el patrón de banda para cada control y piscina CRISPR-inyectado de embriones.
    Nota: La aparición de múltiples bandas que se ejecutan más lentamente en el inyectado versus uninjected carriles indica formación de productos de la novela del heterodúplex (figura 4). La presencia de la novela del heterodúplex ADN indica que indels fueron generados por CRISPR-inyección. Reducción en la intensidad de banda homoduplex en las soluciones de inyección de aproximadamente el 50% o más es suficiente para causar suficiente transmisión del germline. Además, bandas extras a veces se identifican en los peces uninjected y no deben considerarse como bandas del heterodúplex cuando la observa en los peces inyectados.
  13. Elegir las inyecciones con mayor eficiencia de corte con respecto al control uninjected de cada destino; los embriones de estas inyecciones pueden utilizarse para cultivar peces para buscar indels causando codones de parada prematura.
    Nota: Para el corte altamente eficiente (reducción en la banda homoduplex por aproximadamente > 50% de intensidad), detección de peces adultos de 20 a 30 debe ser suficiente para obtener la transmisión de la línea germinal.
    Para sgRNAs que generan menos corte, peces más adultos pueden ser necesaria para aumentar la probabilidad de identificación de peces que presentan transmisión del germline de alelos modificadas que contiene un codón de parada prematuro. Si no se observa formación de indel puede ser necesario rediseñar lo sgRNA a una región diferente del gen. Si no se observa la formación del heterodúplex, lo sgRNA puede han degradado, y la calidad de sgRNA debe verificarse utilizando un gel de urea de las páginas.

5. identificación y propagación de líneas de Knock-out

  1. Para identificar un posible pez de padre fundador, realizar clips de cola de los peces adultos de F0 (crecidos a aproximadamente 2,5 – 3 meses) para identificar presencia de indels. Anestesiar a los peces Metanosulfonato de 0,62 mM (véase Tabla de materiales), luego use una cuchilla limpia y afilada para quitar aproximadamente 1/2-3/4 de la aleta caudal.
  2. Coloque la cola en 45 μl de NaOH de 50 mM y devolver el pez a un tanque de recuperación. Realizar la extracción del gDNA como descritos (pasos 4.2-4.4). Una vez que el pescado reanuda comportamiento de natación normal, coloque el pescado en fluir agua del sistema hasta que se identifica la naturaleza de la indel.
    Nota: Es crítico para asegurar que cada pez es identificables y puede combinarse adecuadamente los resultados de los clips de cola.
  3. Como se ha descrito (medidas 4.5-4.9), realizar una HMA en la cola clip gDNA para determinar si el pescado fue modificado por la inyección de CRISPR (figura 5). Para identificar un pescado del fundador, se crían a los adultos que exhiben bandas del heterodúplex gDNA cola pescado salvaje. Recoger los embriones y cultivarlas a 72 hpf.
  4. En 72 hpf, recoger 10 embriones y cada embrión en un tubo individual. Realizar una extracción gDNA como se describe anteriormente (pasos 4.2-4.4) con 11,25 μl de NaOH de 50 mM y 1.25 μl de Tris 1 M pH = 8.
  5. Repita el PCR y electroforesis para identificar bandas del heterodúplex como se describió anteriormente (pasos 4.7 – 4.13) para determinar si indel alelos se han pasado esta generación (figura 6).
  6. Basado en la transmisión por ciento observada en embriones solo usando el HMA, crecen un promedio de 20 a 30 embriones obtenidos por la Cruz para cada CRISPR-líneas de interés para la edad adulta.
    Nota: Este número puede ser aumentado o disminuido dependiendo de la frecuencia de transmisión de línea germinal.
  7. Realizar clips de cola de los peces adultos de F1 para identificar presencia de indels como descritos (pasos 5.1 – 5.2). Como se ha descrito (medidas 4.5 – 4.11), realizar una HMA en la cola clip gDNA para determinar si el pescado lleva un indel (figura 7).
  8. Para los pescados que contienen una banda del heterodúplex, preparar la DNA que ordenaba análisis.
    1. Realizar PCR usando las cartillas nuevas para amplificar un producto PCR de bp 300 – 600 centrada alrededor del sitio de corte.
    2. Uso un kit PCR purificación para limpiar el ADN y procederá a la elución en 30 μl. examinar el ADN en un gel de agarosa para una sola banda esté presente.
      Nota: Algunas bandas del heterodúplex pueden estar presentes en el gel de agarosa y aparecen como un pequeño borrón de transferencia o doble banda justo por encima del producto PCR del tamaño esperado.
  9. Si se analizan los indels de uno a tres, la secuencia de los productos PCR usando Sanger secuenciación y determinar la secuencia de indel utilizando una herramienta bioinformática del49. De lo contrario, la determinación de la secuencia de varios productos de PCR usando análisis NGS (véase Tabla de materiales) es más económico.
  10. Determinar si un codón de parada prematuro se ha realizado mediante el análisis de la secuencia usando una herramienta Bioinformática (véase Tabla de materiales).
  11. Coloque el pescado que contiene el alelo del mutante deseado en un nuevo tanque con etiquetas apropiadas.
  12. Diseño de cartillas de la polimerización en cadena para alelos específicos indel para genotipificación futuras necesidades. Estos cebadores deben abarcar la secuencia mutada y no amplificar la secuencia wild type.
  13. En la Cruz pez cebra heterozigótico para generar una población segregante que contiene líneas de knock-out 25%.

Resultados

Los enfoques experimentales descritos en este protocolo se permiten para la producción eficiente y rentable de pez cebra líneas de knock-out CRISPR/Cas9 tecnología. Las figuras siguientes se han incluido en este artículo para facilitar la interpretación y solución de problemas de los resultados obtenidos utilizando este protocolo. Después de éxito de la producción y microinyección de CRISPR-reactivos, los embriones de pez cebra pueden ser analizados para fenotipos abiertos y para formación de indel con HMA. Un control útil para visualizar el éxito del experimento CRISPR es el uso de lo sgRNA descrito en paso 1.5 al gen productor de pigmento tirosinasa. Formación de indel Cas9-inducida en tirosinasa resulta en la pérdida de la pigmentación y se anotó fácilmente por 48 hpf (figura 1). Otro control útil para asegurar que la preparación de los reactivos CRISPR para inyección ha sido exitosa, es verificar que integral (120 nt) sgRNA ha sido sintetizado mediante un desnaturalización gel de poliacrilamida (figura 2, carril 1 y 2). Si ha sido degrado el ARN puede aparecer como un borrón de transferencia, por ejemplo carril de 3 (figura 2) muestra RNA degradado que no es conveniente para la inyección.

Para analizar la frecuencia de formación de indel de genes dirigidos por CRISPR Cas9 que no den lugar a fenotipos abiertos como tirosinasa, análisis HMA es un método simple y confiable. sgRNA/Cas9 embriones inyectados analizados resultados HMA en la formación de bandas del heterodúplex y reducción de la intensidad de la banda homoduplex (figura 4). La presencia de bandas del heterodúplex es más utilizada en este protocolo para identificar potenciales fundador de peces de los embriones microinyectados y como adultos (figura 4 y figura 5), para analizar la eficacia de transmisión de línea germinal de un fundador ( Figura 6) y para verificar la presencia de un indel en un pez heterocigoto de la F1 (figura 7). Los peces heterocigotos que contienen un indel son candidatos para NGS para identificar la naturaleza de la indel y para determinar si un codón de parada prematuro está presente en la región codificante del gen objetivo.

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Figura 1 : Embriones de pez cebra presentan un defecto de pigmento cuando se inyecta con un sgRNA contra tirosinasa en la etapa de una célula. (A) tipo de salvaje, uninjected embrión en 48 hpf y (B) inyección de embrión en 48 hpf. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : Transcripción in vitro de sgRNA usando síntesis kit. Oligos se sintetizaron mediante transcripción en vitro de acuerdo con las instrucciones del kit sgRNA síntesis. 500 ng de ARN se ejecute en un gel de urea de las páginas como se describe. sgRNA cargado en los carriles 1 y 2 muestra una banda correspondiente a la longitud completa, intacta 120 nt RNA. Lo sgRNA en carril 3 muestra un ejemplo de RNA degradado que no es conveniente para la inyección.

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Figura 3 : Comparación de la salud de embriones hpf inyectado 24. Un embrión vivo (A) se convirtió a 24 hpf, se distingue fácilmente de un embrión que ha abortado desarrollo (B). Embriones que se asemejan a (B) o drásticamente alteración funciones para (A), tales como curvatura espinal o alteración cabeza y desarrollo del ojo debe ser quitada del plato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de Cas9 sgRNA microinyectados embriones de pez cebra. Piscinas de 5 embriones por cada muestra se colectaron en 72 hpf y gDNA fue extraído. El análisis del heterodúplex fue realizado como se describe, las muestras fueron cargadas igualmente con 500 ng de ADN. Carriles: M = marcador de bp 100; 1 = control uninjected; 2 = muestra inyección 1; 3 = muestra de inyección 2. Espera que el tamaño de banda = 98 bp.

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Figura 5 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de gDNA extraído de la cola de un pez cebra adulto inyectado CRISPR. Embriones que fueron inyectados con un sgRNA y proteína Cas9 crecieron hasta la adultez (3 meses). Pez B y C exhiben bandas del heterodúplex y posteriormente fueron criados para identificar indels germinales transmitidas; peces A no fue utilizado en el análisis posterior porque no exhibe una banda positiva del heterodúplex. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado A; 3 = pescado B; 4 = pescado C. espera banda tamaño = 98 BP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de solo embriones generados por la cría de un pez cebra F0 CRISPR inyectado a un pez de tipo salvaje para identificar del germline transmitido indels. Pez cebra fueron apareadas y se colectaron los embriones F1 de embriones solo 72 h. y el análisis del heterodúplex realizado como se describe. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2-10 = un solo embrión de F1 por carril. Este gel muestra que 7 de cada 10 embriones muestran una banda positiva del heterodúplex, indicando una tasa de transmisión del germline del 70% de lo indel. Espera que el tamaño de banda = 98 BP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7 : Ensayo de movilidad del heterodúplex de clips de cola de pez cebra de F1 adultos. Peces adultos F1 fueron marcados por HMA para identificar indels. Peces que exhiben una banda positiva del heterodúplex fueron PCR amplificado y enviado para el análisis de la secuencia amplia para determinar la naturaleza de la mutación. Carriles (A): 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado una (4 bp canceladura, desajuste de bp 1). (B) estos F1 peces fueron identificados en el mismo fundador y aún Mostrar del heterodúplex diferentes patrones, lo que indica transmisión del germline de múltiples alelos modificados de un solo fundador. Carriles: 1 = control de tipo salvaje; 2 = pescado B (4 inserción de puntos de ebullición, desajuste de bp 7), 3 = pescado C (canceladura de 4 puntos, 4 desajuste de bp). Cada uno de estos indels crea un codón de parada prematuro en la secuencia de codificación del gene del destino, según lo determinado por NGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este protocolo describe la producción de knockouts de genes en el sistema de vertebrados modelo de pez cebra CRISPR Cas9 tecnología. Un número de protocolos se han descrito previamente para llevar a cabo la ingeniería del genoma mediada por CRISPR en pez cebra15,25,26,50,51,52. Este protocolo basa en esfuerzos anteriores por combinación de una serie de técnicas experimentales sencillo y reproducible consistentes, en particular HMA y NGS de múltiples peces heterozigótico, para crear un sencillo, económico y protocolo experimental robusto para CRISPR-mediada mutagénesis en el pez cebra es apropiado para laboratorios dotados de personal con una gama de formación y experiencia, así como laboratorios de enseñanza.

Recomendaciones para el diseño y síntesis de guía que RNAs se incluyen en este protocolo. Una consideración importante en la guía de diseño de RNA es la minimización de los efectos off-target. Varios algoritmos de predicción se han desarrollado para permitir a los usuarios de CRISPR acceder a herramientas de cómputo con interfaces gráficas fáciles de usar que predicen tanto la actividad de la guía en el destino y la posibilidad de efectos off-target34, 35,36. Una ventaja específica del sistema pez cebra es bajar las tasas de efectos off-target porque la Cas9 es inyectada en los embriones y por lo tanto la expresión es transitoria, que se ha demostrado en ratones para provocar disminución efectos off-target53. Sin embargo, se han demostrado efectos off-target en pez cebra54. Una forma de control para efectos off-target es fenotipo fundador pez cebra que han sido generados por dos RNAs guía independiente que el mismo gen, ya que estas guías sería muy probables que afectan a diferentes sitios de fuera de objetivo. Un método alternativo para reducir al mínimo efectos off-target que se describe en este protocolo es el uso de un Cas9 mutado que genera roturas de la hebra en el ADN, Diana que se reparan con alta eficiencia. Asociación ADN nicks cerca uno del otro que son complementarios al contrario filamentos resultados en indel eficaz de formación en el lugar deseado y minimiza los efectos off-target55,56.

Además de tener diferentes tipos de efectos off-target, sgRNAs diferentes pueden tener diferentes tipos de mutagénesis de la deseado57,58,59. Este protocolo utiliza HMA para analizar la eficiencia de mutagénesis de un sgRNA dado uso del heterodúplex banda formación33,40. Bandas del heterodúplex son creados por hibridación de los filamentos de la DNA generados por PCR que contienen uniones mal hechas y pueden resolverse fácilmente mediante electroforesis en gel. A diferencia de otros métodos comúnmente utilizados para medir formación indel, tales como la endonucleasa T7 análisis o alta resolución derretir análisis25,26, HMA no requiere la costosa enzima para cortar DNA no coinciden y no requiere complicada análisis de PCR se funden las curvas. Lo importante, también uso de HMA para verificar las altas tasas de formación de indel en la población inyectada permite el investigador minimizar la cantidad de pescado necesaria para posterior producción de líneas de knock-out, que reduce el coste de identificación de una mutación con la características deseadas.

La relativa facilidad de generar indels CRISPR base permite la creación de múltiples alelos de varios genes a la vez. Software basado en web está disponible para el análisis de mutaciones individuales de peces heterocigotos con Sanger secuenciación de productos PCR49. En el caso donde se analizan tres o más alelos mutados CRISPR, NGS para caracterizar la naturaleza de la indel es probable ser más costo efectiva para caracterizar la naturaleza de indel como este enfoque permite una piscina de hasta 50 alelos diferentes para caracterizar o na (véase Tabla de materiales)60,61,62. Tales economías de escala probablemente sería particularmente útil en un entorno de laboratorio pregrado.

En Resumen, este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar reproducible CRISPR-reactivos de alta calidad (en particular, sgRNA) que menos peces adultos necesitan ser creados y analizados para identificar con éxito los alelos mutantes de interés, que también reduce el tiempo y el costo de generar las líneas de la deseada. Lo importante, este protocolo se ha diseñado tal que se puede aplicar en laboratorios con recursos limitados para producir pez cebra mutante de una forma asequible. Además, hemos encontrado que este enfoque es adecuado para estudiantes y así, amplía las oportunidades de educación y formación de estudiantes de pregrado interesados en la experiencia práctica en la edición del genoma basado en CRISPR.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R21CA182197 a f), el Ralph W. y gracia M. Showalter investigación confianza y por la ciencia agrícola de Purdue y extensión para el programa de desarrollo económico (AgSEED). Datos de secuenciación de Sanger fueron adquiridos por la instalación de Purdue Genomics Core apoyada por CA023168 P30. Mary Witucki fue apoyado por el centro de la Universidad de Purdue para cáncer investigación verano pregrado programa de investigación apoyado por la Asociación de cáncer del Condado de Carroll. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio recolección de datos y análisis, publicación y preparación del manuscrito. Agradecemos a Benjamin Carter, Ellen Denning y Taylor Sabato para proporcionar retroalimentación crítica sobre el manuscrito. Agradecemos al Departamento de bioquímica para el soporte de este trabajo y el centro de investigación del pez cebra en la Purdue University por su dedicación en el cuidado y bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Finalmente, agradecemos a las instalaciones de base genómica de Purdue, y contribuciones de Phillip San Miguel con respecto a los servicios NGS.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CRISPORsgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-CassgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChopsgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free techniquehttp://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free waterAny brandSynthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanolAny brandMolecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 ProteinPNA BioCP01Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligosIntegrated DNA Technologies (IDT)Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut siteIntegrated DNA Technologies (IDT)Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut siteIntegrated DNA Technologies (IDT)Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis KitNew England BioLabsE3322In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBEThermo FisherB52RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load DyeNew England BioLabsB7025SLoading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetateThermo FisherAM9071Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free)Any brandClean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free WaterAny brandFor synthesis and purification of guide RNAs.
RNase awayThermo Fisher10328011Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bpNew England BioLabsN0467SMolecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kbNew England BioLabsN0552SMolecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA LadderNew England BioLabsN0364SSingle strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMEDThermo Fisher17919Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS)Sigma-AldrichA3678Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1)BioRad161-0154Casting denaturing polyacrylamide gel.
UreaSigma-AldrichU5378-100GCasting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo FisherR0641Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromideSigma-AldrichE1510-10MLVisualization of nucleic acids.
SYBER GreenThermo FisherS7563Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
MicrocentrifugeEppendorf5424RNA clean up, PCR purification.
MyTaq PolymeraseBiolineBIO-21105For amplification of DNA using PCR.
ThermocyclerAny brandPCR amplification.
SpectrophotometerAny brandNanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo mediaMade in houseMedia for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene BlueSigma-AldrichM9140Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dishThermo FisherFB0875711ZStore embryos, cast injection plate.
AgaroseDenvilleCA3510-8Casting injection plate, agarose gels.
Microinection moldAdaptive Science ToolsTU-1To create wells to hold embryos during injection.
Phenol RedSigma-AldrichP0290 Dye for visualization of injection.
Mineral OilSigma-AldrichM5904-5MLTo calibrate needle injection volume.
Transfer pipettesAny brandMoving embryos.
Razor bladeThermo Fisher11295-10Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
IncubatorAny brandMaintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette pullerDavid Kopf Instruments700CGeneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubesSutter InstrumentsBF100-58-10Geneate needles for injection.
Microloader tipsEppendorf930001007Load solution into injection needles.
MicroinjectorWorld Precision InstrumentsPV 820Injecting embryos.
Disecting microscopeLeicaInjecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1)BioRad161-0156Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine)Sigma-AldrichA-5040Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
MicrowaveAny brandCasting injection plate, agarose gels.
ScaleAny brandCasting injection plate, agarose gels.
GlovesAny brandFor all aspects of the protocol.
N2Any brandTo expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tipsAny brandFor all aspects of the protocol.
200 µL tipsAny brandFor all aspects of the protocol.
10 µL tipsAny brandFor all aspects of the protocol.
PCR strip tubesAny brandFor all aspects of the protocol.
MicropipettesAny brandFor all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: WideseqIf your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysisFor Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysisSnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.

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