Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Resumen

Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.

Resumen

Opciones actuales de tratamiento para avanzados y recurrente de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) incluyen enfoques de quimio-radiación con o sin cirugía y radiación. Mientras que los regímenes de quimioterapia basados en platino actualmente representan el estándar de oro en cuanto a eficacia y en la mayoría de los casos, nuevos regímenes de quimioterapia, es decir, la inmunoterapia están surgiendo. Sin embargo, las tasas de respuesta y mecanismos de resistencia de la terapia para cualquier régimen de quimioterapia son difíciles de predecir y permanecen insuficientemente entendido. Amplias variaciones de mecanismos de resistencia de radiación y quimio son conocidas hasta la fecha. Este estudio describe el desarrollo de un análisis estandarizado, de alto rendimiento en vitro para evaluar la respuesta de la línea celular HNSCC a varios regímenes de tratamiento y ojalá en células primarias de pacientes individuales como una futura herramienta para tumor personalizada terapia. El ensayo está diseñado para ser integrado en el algoritmo estándar de control de calidad para los pacientes HNSCC en nuestro centro de atención terciaria; sin embargo, esto será tema de futuros estudios. Viabilidad técnica parece prometedora de células primarias de las biopsias tumorales de pacientes reales. Las muestras se transfieren en el laboratorio. Las biopsias se separan mecánicamente seguido por digestión enzimática. Las células son luego cultivadas en ultra baja de la adherencia de la célula los frascos de cultivo que promueven la formación de conglomerados de células tridimensionales en forma de esferoide, reproducible, estandarizada y espontánea. Esferoides son entonces listos para ser expuestos a protocolos de quimio-radiación y protocolos de inmunoterapia según sea necesario. El tamaño de la célula final viabilidad y esferoide son indicadores de susceptibilidad de la terapia y por lo tanto se pueden sacar en cuenta en el futuro para evaluar respuesta a terapia probablemente los pacientes. Este modelo podría ser una herramienta valiosa y rentable hacia una terapia personalizada para el cáncer de cabeza y cuello.

Introducción

Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo con una creciente incidencia de mucosa virus del papiloma humano (VPH) asociada a infección patogenia, junto a una mayoría de casos causada por el alcohol y la nicotina excesiva consumo ^1,2. Mientras que tumores más pequeños y las etapas pre-invasivas son generalmente bien tratables con la supresión quirúrgica, generalmente combinada con la disección del nodo de linfa cervical, tratamiento para HNSCC estadio avanzado y recurrente sigue siendo difícil debido a la invasión de tumor agresivo con diseminación metastásica y resistencia a la radiación y la quimioterapia protocolos^3,4,5,6,7,8. Estudios recientes sugieren una alta variabilidad del fenotipo celular y sub-caracterización de la circulación y las células del tumor diseminado ha empezado^9,10. La creencia anterior de un tumor sólido, uniforme masa tuvo que ser revisada a la luz de estudios recientes en el pasado años^11,12,13,14. Enfoques actuales para la caracterización del tumor y la identificación de mutaciones claves podrían identificar varios genes que parecen estar asociados con la resistencia de la terapia, pero siguen un enfoque de coste-intensivo. Por otra parte, el conocimiento del genotipo no permite necesariamente una predicción confiable de fenotipo y su respuesta al tratamiento.

Ha habido pocos avances en mejorar la supervivencia general y libre de enfermedad para la enfermedad de estadio avanzado y recurrente. Para nicotina así como carcinoma asociado a virus, opciones actuales de tratamiento además de cirugía incluyen radiación agresivo y los regímenes de quimioterapia basados en platino. Ha habido implicaciones para las tasas de respuesta diferente entre carcinoma VPH negativos y positivo; sin embargo, esto todavía no conducen a un cambio en general pautas de la terapia. Resistencia a la radiación y la quimioterapia es un fenómeno generalizado en todas las etapas de tumor y existe para quimioterapia con platino, así como para la terapia dirigida (Anti-EGFR; receptor de factor de crecimiento epidérmico) y recientemente de la inhibición de control¹⁵. Quimioterapia y radioterapia ineficaces vienen a un costo alto de morbosidad paciente significativa en cuanto a la disfagia, mucositis, boca seca y el riesgo de disminución de la función renal o cardíaca, entre otros. Predecir a antes de la terapia respuesta la decisión de un concepto general de la terapia para cada paciente parece ser el objetivo fundamental, prevenir conceptos innecesarios del tratamiento, efectos secundarios y los costos.

Se buscó establecer un modelo para probar susceptibilidad de tratamiento de cada paciente hacia la actual quimio-radiación estándar que podría integrarse en el algoritmo de tratamiento oncológico regular y control de calidad desde un punto técnico permanente. El lejano objetivo era utilizar el modelo sin usar líneas celulares muy alterada y envejecida, como mal que representan células del tumor humano real sin su variabilidad y heterogeneidad como sabemos ahora, al establecimiento del Protocolo se realizó en varias líneas celulares. Para ser independiente sólo desde líneas celulares disponibles en el mercado, nos recientemente con éxito genera una línea intermedia de la célula llamada "PiCa" de las células primarias de HNSCC de muestras tumorales humanas con marcadores celulares conservados en sus pasajes superficiales y limitadas ¹⁶. línea de celular esta PiCa debe servir como una preparación para el desarrollo del modelo en el camino para más adelante siguiendo los ensayos con células de cáncer humanas frescas procedentes de biopsias de tumor. Se ha demostrado que las células en la célula tridimensional las culturas reaccionan de manera diferente y más en vivo-como a la administración de fármacos contra el cáncer que crecen en monocapas^{17,18,19,20 ,21}, debido principalmente a la conservación de migratorias y diferenciación de las propiedades de ciertos subconjuntos de células^22,23,24. Aquí, describimos el protocolo de un modelo tridimensional, basado en el esferoide de líneas de células intermedias y formas y células de carcinoma de célula squamous humanos primario Cómo integran este modelo en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello cirujano y oncólogo ( Figura 1).

Protocolo

Todos los estudios que se muestra en este manuscrito, es decir, el uso de muestras de tumores humanos, están protegidos bajo consentimiento con anteriores decisiones de la Universidad de medicina de Maguncia/Universidad del Comité de ética médica de centro de Munich. Pacientes han dado consentimiento según las disposiciones legales nacionales de acuerdo al uso científico de exceso de material biológico que se obtuvo en el curso de su tratamiento. Investigación se ha realizado en cumplimiento de todas las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano.

1. tomar una biopsia del Tumor de cabeza y Carcinoma de célula Squamous Heck

1. Realizar infiltración local (ultracaine 2%, adrenalina) o general (propofol o sevoflurano, agente relajante muscular) superficie (Xilocaína) anestesia en la sala de operaciones u Otorrinolaringología silla de examen. Visualizar la masa tumoral en orales cavidad/faringe/laringe/otras partes del tracto digestivo y respiratorio superior con instrumentos de funcionamiento estándar y, si es necesario, bajo el microscopio.
2. Tomar una biopsia de tumor fresco de la periferia de la lesión cancerosa con instrumentos romos o corte. Evitar el centro de la lesión debido a la necrosis abundante en esta zona. Poner el tejido obtenido a un recipiente estéril con solución de cloruro de sodio isotónica.
3. Después de la biopsia, realizar hemostasia según se necesite, por ej., con un dispositivo de coagulación bipolar o monopolar, además del uso de sustancias vasoconstrictoras.
4. Traer la biopsia del tumor destinada a ser utilizado para experimentos de cultivo celular directamente a la zona de laboratorio adyacente. Enviar otras biopsias de tumor para el patólogo como de costumbre para descartar un cáncer.
5. Asegúrese que un técnico de laboratorio está preparado para procesar a la muestra directamente.

2. procesamiento de la muestra de Tumor

1. Coloque al espécimen del tumor en una superficie adecuada y estéril y cortar bien con un bisturí estéril de un solo uso en piezas lo menos posibles.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la situación de las enfermedades infecciosas y transmitidas por la sangre está bien documentada y es el técnico en atención de las instituciones estándar protocolos para evitar que la aguja corte lesiones potencialmente material paciente biohazard o palo y de la protocolos a seguir después de lesiones.
2. Después de suficiente separación mecánica de los tejidos primarios, ponga el tejido en un frasco que contienen colagenasa I / II e incubar 1 h a 37 ° C. Tamiz a través de un tamiz de célula de halcón μm 70 y lavar la suspensión con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS).
3. Tras exitosa separación y posterior lavado, coloque la suspensión que contiene 1-2 x 10⁶ células en un frascos de cultivo de célula T75 (75 cm²) para crecer a sub-confluencia a 5% CO₂ y temperatura de 37 ° C. Este paso puede tardar hasta 10 días.
   1. Utilizar medio de cultivo de queratinocitos especial que consiste en lo siguiente: 125 mL de Dulbecco de modificado medio de águilas (DMEM), 250 mL de Keratinocyte complementado medio (complementa consisten en 500 mL de medio de SF de queratinocitos, 15 mg de hipófisis bovina Extracto (BPE), 2,5 mL de penicilina/estreptomicina 150 ng recombinante humano epitelial factor del crecimiento (EGF), 516 μl 300 mm CaCl₂, mezcla acción a preparar con antelación), 125 mL de la mezcla de nutrientes F12, 10 mg de BPE (0,75 mL), EGF humano recombinante de 75 ng (2 μL) , 3,75 mL de 200 mM L-Alanil-L-Glutamin-dipéptido (tabla de materiales).

3. siembra las células en placas ultra baja de la adherencia de la célula

1. Confirman el crecimiento de la célula del tumor bajo un microscopio. Contar las células en cultivo (primaria o célula cultura) y 5.000 células del tumor primario o 1.000-2.000 células de la línea intermedia de la célula de la semilla / la otra línea celular en 200-300 μL de medios (paso 3.2.) en una placa de adherencia muy bajas con cóncavo, redonda fondos (96 pocillos).
2. Cultura las celdas de 5% CO₂ a 37 ° C y en medio de partes iguales DMEM y vía aérea célula epitelial (BEGM), suero bovino fetal 10%, 1% de penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio 1%, los de aminoácidos no esenciales 1%, 1% L-glutamina (paso 2.3.). Si se utilizan líneas celulares, medios de comunicación sobre la base de DMEM son suficiente.
   1. Realizar cambios de los medios de comunicación todos los días. Prestar atención no a aspirar el esferoide con la pipeta durante los cambios de los medios de comunicación. Cultura los esferoides hasta el nivel de crecimiento como describen en 3.3 se alcanza (aproximadamente 7-10 días).
3. Confirmar la formación esferoide espontánea bajo el microscopio en busca de conglomerados de células tridimensionales, en forma de esferoide. Excluir los pozos con irregular o la formación múltiple del esferoide de más investigación.
   Nota: Esferoides deben ser visibles a simple vista, también, facilitar el tratamiento posterior y cambios de los medios de comunicación como se describe a continuación.

4. exposición de esferoides a la terapia Multimodal Tumor estándar o Experimental

1. Elegir un régimen de terapia deseada. Diseño de grupos de control lo suficientemente grande que permiten comparaciones de tratamientos esferoides o esferoides reciben sólo parcial regímenes, por ejemplo. radiación sola. El tamaño de los grupos de control depende del diseño del grupo experimental y no se puede definir universalmente.
2. Intercambio de los medios de comunicación a medios con aditivos, medios de comunicación de significado con quimioterapia o anticuerpos monoclonales en las concentraciones deseadas. Agregar cisplatino en las concentraciones de 2,5/5/10 μm o 5-fluoruracil (5FU) en 30 μm.
   Nota: Para experimentos de alto rendimiento o grupo grande tamaños grandes número de grupos, uno puede utilizar un robot de pipeteo automatizado como estamos estableciendo aún más en los experimentos.
3. Por otra parte, irradian las placas de cultura de célula con esferoides en 2 Gy usando una facilidad conveniente de la radiación.
   PRECAUCIÓN: Respetar los protocolos de la institución en materia de prevención de exposición a la radiación perjudicial de los empleados. Trabajar sólo con técnicos capacitados y designados según las directrices de protección de radiación. Si se desea, agregar quimioterapia como se describe en 4.2. luego.
4. Incube las células durante 24 h en condiciones de cultivo previamente descritos (37 ° C, paso 3.2).
5. Después de la incubación, continuar el cultivo celular de al menos 6 días con los cambios de los medios de comunicación cada día.

5. evaluación del tamaño del esferoide y el grado de proliferación celular para lectura de ensayo

1. Medir el tamaño del esferoide en términos de área después de la documentación digital de la foto el día 6 (día 10, día 16) con un software gráfico (parámetro 1).
2. Después de la centrifugación a 520 x g durante 2,5 min de la placa, retirar el sobrenadante. Lavar las células con suficiente cantidad de 1 x PBS y centrifugar la placa otra vez como se describe, seguida por retirar el sobrenadante (PBS).
3. Añada 100 μl de solución de separación enzimática de la célula a cada frasco para permitir que los esferoides a disolver. Incube la placa durante 8 min a 37 ° C.
4. Compruebe la disolución acertada de la esferoide bajo el microscopio. Añada 100 μl de DMEM. Centrifugar la placa a x 520 g 2,5 min retirar el sobrenadante y suspender las células en 100 μl de DMEM.
5. Realizar un ensayo de proliferación colorimétricos disponibles comercialmente, en ensayo WST-8 de ejemplo en cada frasco de acuerdo con las instrucciones^{25 el fabricante}. Leer el ensayo en un lector de ensayo (ELISA) de enzima-ligado del inmunosorbente (parámetro 2).

Resultados

Hemos sido capaces de generar reproducible esferoides de suspensiones de la célula, primero de diferentes líneas celulares incluyendo la propia línea de celular de PiCa, más adelante de cáncer primario en humanos en células de biopsias de tumor fresco como se describe en Hagemann et al. . ²⁶. se evaluaron dos métodos establecidos para la generación de esferoide; las dos son el supuesto ahorcamiento drop (HD) método y el método de adherencia muy b...

Discusión

Hemos sido capaces de establecer un protocolo para generar esferoides reproducibles a partir de suspensiones celulares, para ambas líneas celulares y, en experimentos preliminares, las células humanas del tumor primario. Primero evaluaron dos métodos anteriormente descritos e identificó el ULA-método, un método donde se utilizan placas con superficies de adherencia muy bajas, para ser la más segura y más confiable para la generación de esferoides tridimensionales uniforme. Mediante la combinación de dos método...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350