Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Resumen

Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.

Resumen

Virus-como partículas (VLPs) se han utilizado como nanocarriers para mostrar epítopos extranjeros y/o entregar pequeñas moléculas en la detección y tratamiento de diversas enfermedades. Esta aplicación se basa en la modificación genética, uno mismo-Asamblea y verbal de la cisteína para cumplir con la aplicación de metas de tumor de VLPs recombinantes en comparación con genética verbal solo, químicos de la modificación de péptidos extraños a VLPs ofrece una significativa ventaja ya que permite una variedad de entidades, tales como péptidos sintéticos u oligosacáridos, al ser conjugado con la superficie de VLPs de forma modular y flexible, sin alteración de la Asamblea VLP.

Aquí, nos muestran cómo utilizar la hepatitis E virus nanopartícula (HEVNP), una cápsula de teranosis modular, como un portador de múltiples funciones de la entrega. Funciones de HEVNPs incluyen metas de tejido, imágenes y entrega terapéutica. Basado en la investigación estructural bien establecida de HEVNP, los residuos estructuralmente independientes y superficie expuesta fueron seleccionados para el reemplazo de cisteína como Conjugación de grupos químicos maleimida vinculado mediante enlaces tiol-selectivo. Una particular cisteína-modificado HEVNP (un reemplazo de Cys de la asparragina en el 573 aa HEVNP - 573C) conjugado con un ligando de célula-específica de cáncer de mama, LXY30 y etiquetados con el infrarrojo cercano (NIR) fluorescencia tinte (Cy5.5), representación dirigida por el tumor HEVNPs como cápsulas diagnóstico eficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estrategias similares de ingeniería pueden ser empleados con otros complejos macromoleculares con estructuras atómicas conocidas para explorar posibles aplicaciones en la entrega de la teranosis.

Introducción

El desarrollo de vectores de tamaño nanométrico en entrega diagnóstica y terapéutica, conocidas como nanotheranostics, ha cambiado mucho el campo biomédico de tratamientos generalizados hacia entrega específicas¹. Entrega de nanotheranostic objetivo integra vectores de tamaño nanométrico (nanopartículas) con moléculas de teranosis para dirigir estable teranosis moléculas específicas del tejido enfermo o vía bioquímica^2,3,4 . Nanomedicina ha llegado a la vanguardia de entrega específica porque óptimo tamaño de nanopartículas tienen la capacidad para estabilizar la circulación de las moléculas de la teranosis y atacar selectivamente a moléculas de superficie celular en los tejidos enfermos. Muchas plataformas de nanotheranostic todavía sufren de captación pasiva celular, degradación de prematuro, toxicidad y escasa asociación con moléculas de teranosis. VLPs superan muchos de estos obstáculos en la entrega específica. Se han utilizado como nanocarriers para mostrar epítopos extranjeros y/o entregar moléculas pequeñas: un régimen que puede utilizarse para combatir muchas enfermedades¹. Esta aplicación se basa principalmente en la propiedad de uno mismo-Asamblea así como la facilidad de modificaciones genéticas, para cumplir con la aplicación diseñada para lo VLP dado. En comparación con la ingeniería genética, Conjugación química de péptidos extraños a VLP muestra una ventaja significativa ya que permite una gran variedad de entidades, como péptidos u oligosacáridos, al ser conjugado a la superficie de VLPs en un modulado y manera flexible sin alteración de montaje VLP.

HEVNPs, derivados de la proteína de cápside VHE recombinante, 2^nd abierto lectura marco (ORF2) no infecciosas, uno mismo-montaje de cápsida de unión a la célula y la entrada. Porque HEV evolucionado para la transmisión de la mucosa, la cápside ensamblada es igualmente estable en condiciones mucosa proteolíticas y ácido⁵. HEVNPs forma un hueco, T = 1 cápside icosaédrica, compuesto de 60 unidades idénticas^6,7 de ORF2, haciéndola muy estable tanto en almacenamiento como en duras condiciones fisiológicas. Falta de elementos genéticos virales, la producción eficiente, de alta producción se logra a través de sistema de expresión de baculovirus en células de los insectos. Debido a su estabilidad proteolítica, HEVNPs uno mismo-montado extraídos y purificados del sobrenadante de células, substancialmente reducir pasos de purificación necesaria. Además, HEVNPs poseen un dominio de superficie saliente expuestas (dominio P) conectado a través de una bisagra flexible a una estable base icosaédrica. El dominio de P forma picos superficie expuesta sobre la base de icosaédrica mientras la bisagra flexible permite modificar de manera significativa el dominio P sin comprometer la base estructura icosaédrica. Con 60 unidades repetidas, sola modificación específica resulta en 60 sitios simétricos para modulación de la química. Recientemente, hemos propuesto una plataforma de nano con HEVNP que puede químicamente conjugado ligandos o moléculas pequeñas para aplicaciones de teranosis. Esto se logró mediante la sustitución de un solo aminoácido con cisteína en el dominio de la saliente de HEV-VLP como un sitio de reacción con ligado de maleimida péptidos o moléculas. Basado en el anterior análisis estructural de HEV-VLP y epítopes inmunogénicos estudiados^8,9, los siguientes cinco HEV-VLP aminoácidos fueron reemplazados con cisteína como candidatos potenciales: Y485C, T489C, S533C, N573C y T586C ( Figura 1). Después de la expresión y purificación de células de los insectos, sus formaciones de VLP fueron confirmadas por la observación de la microscopia electrónica (TEM) de transmisión (figura 2), y los sitios de cisteína expuesta se analizaron por Western blot después de biotina maleimida-ligado verbal (figura 2). Entre los cinco mutantes, HEVNP - 573C muestran la señal más fuerte de la conjugación de maleimida-biotina (figura 2) y fue utilizado para seguimiento de demostración como el nanocarrier para la célula de cáncer de mama dirigido a⁴ (figura 3).

Este protocolo describe métodos de conjugación química para fijar moléculas dirigidas a tumor al HEVNPs a través de la conjugación de cisteína superficial. Detallamos la conjugación de moléculas de orientación y detección de tumor para la entrega de tumor con HEVNPs recombinantes que contiene cisteína en N573 (HEVNP - 573C). Nos enfocamos en un proceso de conjugación química de dos pasos haga clic en enlazar un tumor de cáncer de mama targeting peptide, LXY30¹⁰ a HEVNPs de forma LXY30-HEVNP (figura 4). Posteriormente, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 fueron conjugados en el sitio de Lys separado en HEVNPs para construir LXY30-HEVNP-Cy5.5 de detección fluorescente ambos en vitro (figura 5) y en vivo⁴.

Protocolo

1. HEVNP producción en células de los insectos

Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse en una campana de cultivo celular. Consulte nuestra publicación anterior para más HEVNP producción procedimientos¹¹.

1. Las células Sf9 en medios celulares de insectos (véase Tabla de materiales) a 50-75% confluencia en placas de 6 pocillos de cultivo.
2. Utilizando reactivos de transfección de células de insectos según los protocolos del fabricante, transfectar Bacmids con HEVNP - 573 C ORF2 en células Sf99 para producir baculovirus recombinante. Incube las células transfected a 27 ° C durante 3-6 días, dependiendo de la viabilidad de las células.
3. Recoger sobrenadante en 3-6 días post-infección (después de que las células transfected son lisis debido a la infección de baculovirus) baculovirus como P0.
4. Retire el medio de cultivo antes de aplicar 200 μL del stock de P0 a 50-75% las células Sf9 confluentes en un matraz de 25 cm² monocapa. Roca el frasco cada 15 minutos para asegurar la cobertura completa del inóculo. Repetir 4 veces, para un total de 60 minutos.
5. Añadir 2 mL de medio de cultivo celular de insectos en el matraz y mantener a 27 ° C durante 3-6 días, dependiendo de la viabilidad de las células, para amplificar baculovirus a un título mayor.
6. Llevar a cabo ensayos de placa para obtener el título de baculovirus lectura¹².
7. Cultura las suspensión Tn5 células de los insectos (Tabla de materiales) con 100 mL de medio de células de insecto en matraz de 250 mL y agitar en 27 ° C a 150 rpm a una concentración de 0,5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ para la inoculación.
8. Añadir baculovirus en una multiplicidad de infección (MOI) de las células de Tn5 de 5-10 a 100 mL en un matraz de 250 mL. Después de la inoculación, agitar de 27 ° C a 150 rpm durante 5-7 días.
9. Una vez que la mayoría de las células parece tener vesículas y 70-90% de las células están muertas bajo observación del microscopio óptico, recoger las células de Tn5 y transferir a tubos de ultracentrífuga de 33 mL. Colocar la ultracentrífuga tubos en balanceo de rotores de cubo, el equilibrio y el giro de la ruina de la célula y el baculovirus recombinante a 10.000 x g durante 90 minutos a 25 ° C.
10. Guarde el sobrenadante que contiene el HEVNPs lanzados a 4 ° C para la posterior purificación. Para el almacenaje extendido de baculovirus sobrenadante, agregar inhibidores de la proteasa.

2. HEVNP purificación

1. De pellets y aislar el HEVNPs utilizando gradiente separación de cesio cloruro (CsCl):
   1. Transferir el sobrenadante recogido (de paso 1.10) y añadir 20% NP-40 en cada tubo para hacer una concentración final de 0,5% NP-40 para disolver cualquier restante de la membrana celular. Mezclar mediante pipeteo suavemente e incubar durante al menos 30 minutos a 25 ° C.
   2. Ultracentrífuga HEVNPs 112.400 x g en balanceo de rotores de cubo por 2 h a 4 ° C para abajo las HEVNPs partir del sobrenadante de la pelotilla. Desechar el sobrenadante después de centrifugación y suavemente volver a suspender el sedimento crudo en 200 μL de 10 mM MES de tampón pH 6.2 en cada tubo durante la noche (O/N) a 4 ° C. Correr de SDS-PAGE (paso 3.1) para confirmar la presencia de ORF2 de HEVNP en el pellet crudo como una venda del kDa de 52.
   3. Preparar un gradiente de CsCl 38.5% (w/v) por mezcla 1,96 g CsCl, suspende de nuevo pellet crudo y ~ 4 mL de 0.01 M pH MES 6.2 en un tubo de ultracentrífuga de 5 mL. Equilibrar los tubos y coloque en un rotor que hace pivotar del cubo. Ultracentrífuga a 147.000 x g durante 16 horas a 4 ° C.
2. Recoger las fracciones después de gradiente de CsCl:
   1. Desechar la fracción superior de μl 500, que es principalmente restos de membrana de la célula de peso ligero. Recoger fracciones de 500 μl, a partir de la parte superior del tubo y consejos entre cada fracción de cambio. Coloque cada fracción en tubos numerados/etiquetado 1,5 mL.
      Nota: La presencia de ORF2 HEVNP en fracciones separadas de CsCl gradiente no puede ser detectado por correr de SDS PAGE geles debido a la alta concentración de CsCl. CsCl en cada fracción puede ser quitado o diluido siguiendo un procedimiento de limpieza de CsCl. Por otra parte, el gradiente de CsCl puede reemplazarse por un gradiente¹³ de 10-40% sacarosa para evitar CsCl residual.
   2. Transfiera cada fracción a un tubo de ultracentrífuga de 5 mL y diluir el CsCl con 4,5 mL de 10 mM MES, pH 6,2. Equilibrar los tubos y coloque en un rotor que hace pivotar del cubo. Ultracentrífuga a 147.000 x g durante 2 h a 4 ° C a la pelotilla abajo el HEVNPs.
   3. Deseche el sobrenadante y Resuspenda suavemente el HEVNPs en 100 μl de 10 mM MES pH 6.2 cada tubo. Cubrir los tubos para evitar la evaporación e incubar O/N a 4 ° C.
   4. Registrar la lectura A280 y A260/A280 relación de nm usando un espectrofotómetro. Determinar la concentración aproximada del ORF2 como:
      
      Cada ORF2 contendrá 1 sitio de Cys y 1 Lys para Conjugación química.
      Nota: El coeficiente de extinción molar de HEVNP ORF2 es 60.280, que equivale a 1,019 mg/mL × A280. Esto está tan cerca de 1:1 que la concentración de HEVNPs (en mg/mL) se puede aproximar por el A280 y por lo tanto, la concentración de ORF2 mediante la ecuación anterior. Por ejemplo, un HEVNP con una lectura A280 de 1 tendrá una concentración de 1 mg/mL, que equivale al 18,8 μm ORF2.
   5. Preparar un SDS-PAGE. Utilice una muestra de 6 μl de cada fracción para determinar las fracciones de proteína del kDa HEVNP ORF2 53.3 (paso 3.1). El HEVNPs deben encontrarse en fracciones 3-5, con una densidad de ~1.25 g/mL.
   6. Confirmar la presencia y la pureza de HEVNPs por la observación de TEM. Preparar o diluir las muestras HEVNP de 0.5 - 2.0 mg/mL para TEM. Los HEVNPs aparecen en TEM como proteínas icosaédricos vacías, ~ 27 nm de diámetro (figura 2). Algunos contaminantes de la proteína pueden permanecer en las fracciones y se observará en TEM (paso 3.2).
3. En el caso de que las impurezas están presentes bajo TEM, repita el paso 2.1.3 - 2.2.6 de la mejor pureza de las HEVNPs.
   Nota: Purificación adicional mediante gradiente de CsCl puede causar la pérdida de rendimiento de HEVNPs. Por otra parte, la purificación de gradiente de CsCl puede reemplazarse por un gradiente de sacarosa 10-40% para evitar residuales CsCl¹³.

3. HEVNP caracterización

1. Preparar SDS PAGE 4-12% Bis-Tris proteína geles, 1,0 mm, 17-wells (véase Tabla de materiales) según manual del usuario¹⁴:
   1. Añadir 2 μl de 4 x cargando buffer 6 μl de la muestra de proteína. Incubar la mezcla de la muestra en un bloque de calor durante 10 minutos a 100 ° C para desnaturalizar la proteína. Cargar las muestras de proteína en el gel.
   2. Ejecute el SDS-PAGE al establecer la fuente de alimentación DC a 100 V durante 10 min, luego 150 V durante 45 minutos hasta que las muestras de aproximadamente 1 cm por encima del fondo del gel.
   3. Tinción del gel de SDS PAGE con azul de Coomassie (0.25% (p/v) R250 azul brillante Coomassie, 30% (v/v) de metanol, ácido acético al 10% (v/v)), durante 1 hora.
   4. Después el procedimiento de tinción, quite la mancha azul de Coomassie y aplicar tampón de tinción (30% (v/v) de metanol, ácido acético al 10% (v/v)) en el gel proteínas para > 12 h a temperatura ambiente.
   5. Documento el gel bajo la luz blanca para confirmar la presencia de ORF2 de HEVNP en la banda de 52 kDa.
2. Observar las HEVNPs mediante TEM.
   1. Preparar o diluir las muestras HEVNP a 0.5 - 2 mg/mL, con 10 mM MES pH 6.2 proyección de imagen de TEM.
   2. Ionizar las rejillas recubiertas de carbón con 40 descarga del resplandor mA de 30 s para producir una superficie de carbón hidrofílico. El equipo de descarga del resplandor se describe en la Tabla de materiales.
      Nota: La superficie de carbono hidrofílica de las rejillas puede sólo última 30 min después de resplandor descarga tratamiento.
   3. Mantenga en pinzas y añadir 2 μl de la muestra HEVNP a la red, espere 15-30 s y secar con papel de filtro.
   4. Inmediatamente Lave la rejilla con ddH₂0 y blot con papel de filtro.
   5. Inmediatamente añadir 2 μl de acetato de uranilo 2% a la red, esperar 15 s, luego borrar con papel de filtro. Seco las rejillas muestra poniéndolos en un electrónico deshumidificación gabinete seco para O/N.
   6. Transferencia de la red en una imagen con un aumento 10-80k y TEM. HEVNPs aparecen en TEM como proteínas icosaédricos vacías ~ 27 nm de diámetro, debido a la ausencia de ARN viral.

4. química verbal de HEVNPs con biotina, cáncer dirigidos a ligando y fluoróforos

1. Realizar una conjugación de paso de HEVNPs y biotina maleimida vinculado.
   1. Cambio del almacenador intermediario: aplicar el HEVNPs en unidades de diálisis mini y dializo contra pH de PBS de 0,01 M 7.4 a temperatura ambiente durante 1 h según protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Transferir el HEVNPs a tubos de 1,5 mL y medir la concentración de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro.
   2. Mezclar el HEVNP a 1 mg/mL, que equivale al 18,8 μm de Cys reacción sitios (ver detalles en el paso 2.2.4), con una cantidad igual de maleimida-biotina (100 μm) en PBS de 0.01 M, pH 7.4, para hacer un cociente molar de 1:5; reaccionar O/N a 4 ° C. Quitar maleimida-biotina con un procedimiento de columna de 40 K MWCO Spin desalación según protocolo del fabricante (Tabla de materiales).
   3. Analizar las muestras a través de un estándar reducción de SDS-PAGE (paso 3.1).
   4. Empleando los procedimientos estándar, preparar una quimioluminiscencia mancha blanca /negra occidental usando Streptavidin HRP-ligado. Capturar la señal quimioluminiscente por la película de rayos X (figura 2).
2. Realizar dos pasos LXY30 verbal a la superficie expuesta de la cisteína en HEV NPs (figura 5).
   1. Intercambio de búfer: HEVNPs se aplican en unidades de diálisis mini y dializo contra pH 7.4 a temperatura ambiente por 1 h. traslado de las HEVNPs a tubos de 1,5 mL de PBS de 0,01 M y medir la concentración de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro.
   2. Añadir 650 μm maleimida-azida y 650 μm alquino LXY30¹⁰ 0.01 M PBS pH 7.4 con 200 μm CuSO₄ y 1 mM ascórbico ácido para formar LXY30 de maleimida-ligado (Mal LXY30) a 650 μm. Incubar la mezcla a 4 ° C O/N.
   3. Mezclar el HEVNP a 1 mg/mL, que equivale al 18,8 μm del sitio de la reacción de Cys (ver detalles en el paso 2.2.4), con cerca de 10% volumen de Mal LXY30 (650 μm) en pH de PBS de 0,01 M 7.4, para hacer un cociente molar de 1:3; reaccionar O/N a 4 ° C.
      Nota: Debido a la relativamente alta concentración de Mal LXY30, las concentraciones finales de los reactantes, como CuSO₄, se reducen cerca de 10 veces después de mezclar, para evitar su daño a HEVNPs. Otra opción es el Cu libre verbal método¹⁵.
   4. Quitar desatado maleimida-clic-LXY30 con una columna 40 K MWCO Spin desalación según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Mantener las HEVNPs de LXY30-ligado (LXY30-HEVNPs) a 4 ° C.
3. Realizar una conjugación de paso de la LXY30-HEVNPs y ester Cy5.5 NHS (NHS-Cy5.5)
   1. HEVNPs LXY30-ligado (LXY30-HEVNPs) a 1 mg/mL, que equivale al 18,8 μm del sitio de la reacción de Cys de la mezcla (ver detalles en el paso 2.2.4), con un volumen igual de NHS-Cy5.5 (100 μm) en pH de PBS de 0,01 M 7.4 hacer un cociente molar de 1:5; reaccionar O/N a 4 ° C.
   2. Quitar desatado Cy5.5 NHS con un procedimiento de columna MWCO Spin desalación de 40K según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Mantener el LXY30, HEVNPs Cy5.5-ligado (LXY30-HEVNP-Cy5.5) a 4 ° C.

5. HEVNP a y la internalización en las células de cáncer de mama MDA-MB231

1. Células de cáncer de mama semilla MDA-MB231 en un vaso de 35 mm inferior platos (5 x 10⁴ por plato) O/N en una gabinete de cultura de células de mamífero.
2. Para el experimento de Unión celular, preparar LXY30-HEVNP-Cy5.5 siguientes pasos 4.2-4.3. Diluir el LXY30-HEVNP-Cy5.5 0,01 mg/ml, que equivale a 0,188 μm de HEVNP ORF2 (consulte el paso 2.2.4), en 250 μl de 0 - 1% FBS/DMEM.
   1. Preparar la muestra control negativa en 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 siguiendo el paso 4.3 pero conjugado con NHS-Cy5.5 dye, (HEV-Cy5.5). Diluir la HEVNP-Cy5.5 0,01 mg/ml, que equivale a 0,188 μm de HEVNP ORF2 (consulte el paso 2.2.4), en 250 μl de 10% FBS complementado con DMEM.
3. Lavar las células una vez aplicando 250 μl de tampón PBS de 1 M, pH 7,4. Quitar el tampón PBS después del lavado, manteniendo algunos buffer en la placa de cultivo celular.
4. Aplicar 250 μl de LXY30-HEVNP-Cy5.5 10% FBS complementado con DMEM o HEVNP-Cy5.5 10% FBS complementado con DMEM a las células de cáncer de mama MDA-MB231 cultivadas. Protector de la célula cultivada platos de la luz con papel de aluminio.
5. Mantenga los platos de células cultivadas en un cultivo celular de 37 º C gabinete de 1 h para la internalización.
6. Lavar las células cultivadas en el hielo 3 veces, 5 minutos por lavado, con 250 μl de PBS de 1 M, pH 7,4.
7. Fijar las células en el 4% PFA en PBS de 1 M, pH 7,4 para 20 minutos y luego lave una vez con 250 μl de PBS de 1 M, pH 7,4.
   Nota: Las células ahora están listas para ser reflejada por el microscopio confocal. Datos representativos se muestran en la figura 5.

Resultados

Similar a HEV-VLPs, Cys todos modificado soluble cápsida icosaédrica formadas HEVNPs y no se agregan en la solución durante la producción o purificación. Antes y después de conjugación solo paso maleimida-biotina, cada una de las Cys modificado HEVNPs eran indistinguibles de HEV-VLPs en la tinción negativa de EM (figura 2). Eficiencia de conjugación de maleimida-biotina para Cys HEVNPs modificadas fue probaron con Western Blot mediante Unión quimiol...

Discusión

En contraste con el procedimiento de ingeniería genética desperdiciador de tiempo, que generalmente toma semanas, aquí demostramos dos simple pasos y procedimientos de química verbal un solo paso, que pueden terminar dentro de 3 días, de añadir el cáncer dirigidos a ligando o tinte de detección de fluorescencia a los sitios de Cys/Lys de HEVNPs. La técnica puede ser usada para detectar el mejor destino de ligando de un grupo de candidatos y así se aprovecha de los servicios de síntesis de pequeños péptidos d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger