Evaluación sistemática de bienestar en ratones para procedimientos con anestesia General

Resumen

Hemos desarrollado un protocolo para evaluar el bienestar en ratones durante procedimientos de anestesia general. Una serie de parámetros de comportamiento que indica los niveles de bienestar, así como se analizaron los metabolitos de glucocorticoides. El protocolo puede servir como una ayuda general para estimar el grado de severidad de una manera científica, centrada en el animal.

Resumen

En consonancia con el 3R principio (reemplazo, reducción y refinamiento) desarrollado por Russel y Burch, la investigación científica debe utilizar alternativas a la experimentación animal siempre que sea posible. Cuando no existe alternativa a la experimentación animal, el número total de animales de laboratorio utilizados debe ser el mínimo necesario para obtener datos valiosos. Por otra parte, deberían aplicarse medidas de refinamiento apropiado para minimizar el dolor, el sufrimiento y la angustia que acompaña el procedimiento experimental. Las categorías utilizadas para clasificar el grado de dolor, el sufrimiento y la angustia son recuperación, leve, moderada o grave (Directiva 2010/63). Para determinar qué categorías se aplican en casos individuales, es fundamental utilizar herramientas científicamente sólidas.

El protocolo de evaluación de bien ser presentado aquí está diseñado para procedimientos durante los cuales se utiliza anestesia general. El protocolo se centra en comportamientos de actividad del Mouse Grimace escala y lujo Casa jaula como madriguera o nido edificio comportamiento como indicadores de bienestar. También utiliza el paradigma exploratorio libre de comportamiento relacionadas con la ansiedad rasgo. Metabolitos de corticosterona fecal como indicadores de estrés agudo se miden durante el periodo post anestésico de 24 h.

El protocolo proporciona información científicamente sólida sobre el bienestar de los ratones después de anestesia general. Debido a su simplicidad, el protocolo puede fácilmente adaptado e integrado en un estudio planificado. Aunque no proporciona una escala para clasificar el peligro en categorías de acuerdo a la Directiva 2010/63, pueden ayudar a los investigadores estimar el grado de severidad de un procedimiento utilizando datos científicamente sólidos. Proporciona una manera de mejorar la evaluación del bienestar de una manera científica, centrada en el animal.

Introducción

UE Directiva 2010/63¹ establece que el principio 3R (reemplazo, reducción, refinamiento) desarrollado por Russel y Burch² debe ser aplicada siempre que los experimentos con animales es necesario. El objetivo final de la Directiva es eliminar gradualmente toda la experimentación con animales, pero la Directiva reconoce que, por el momento, algunos experimentos con animales son todavía necesarios para investigar que proteja la salud humana y animal. Así, si un experimento animal no puede ser reemplazado por cualquier otro método, sólo el número mínimo de animales de laboratorio es utilizado para obtener resultados fiables. Además, debe reducirse la cantidad de dolor, el sufrimiento y la angustia que acompaña a procedimientos experimentales utilizando medidas de refinamiento apropiado. UE Directiva 2010/63 establece que la severidad de un procedimiento debe ser clasificada por anticipado como recuperación, leve, moderada o grave¹. Como clasificación de gravedad se decide caso por caso, es importante tener herramientas científicamente sólidas para estimar la severidad de un procedimiento dado.

Hojas de puntuación propuesto por Morton y Griffith³ son una herramienta esencial en la detección de cualquier desviación del estado normal, incluyendo efectos negativos sobre el bienestar⁴. Hojas de resultados se utilizan para determinar retrospectivamente el dolor, sufrimiento, y angustia causados por un experimento en cambios visibles en el estado físico del animal individual (por ejemplo, peso corporal, piel, marcha). Aunque VIII anexo de la Directiva 2010/63 proporciona ejemplos de cada categoría de severidad, los investigadores todavía falta herramientas para estimar el grado de severidad de un procedimiento determinado científicamente con base de datos.

La ausencia de indicadores que demuestran bienestar negativo no es la única manera de determinar el estado del animal; la presencia de indicadores apuntando al bienestar positivo es también importante^5,6,7,8. Por ejemplo, animales Mostrar comportamientos de lujo como madrigueras y nidifican edificio comportamiento sólo cuando se cumplen todas sus necesidades esenciales. Si se reduce el bienestar, conductas de lujo son los primeros en rechazar^5,7. Protocolos a utilizar en la evaluación de bienestar deben incluir indicadores apuntando a los físicos, fisiológicos/bioquímicos y estados psicológicos de los animales para evaluar su bienestar en una forma detallada y completa⁹.

En el contexto de refinamiento, un protocolo fue desarrollado para cumplir estos requisitos y para evaluar los efectos de un procedimiento con anestesia general en el bienestar de ratones¹⁰. Al mismo tiempo, el objetivo era minimizar cualquier tensión adicional para permitir la fácil integración del protocolo en un experimento dado. El protocolo considera madriguera comportamiento, comportamiento de jaula casera como actividad, la ingestión de alimentos y nidificación y comportamiento relacionados con la ansiedad rasgo. Además, incluye la escala de mueca de ratón (MGS) y el análisis no invasivo de metabolitos de corticosterona en las heces. El protocolo está diseñado para facilitar la evaluación del bienestar de una manera científica y centrada en el animal y proporcionar información sobre bienestar compatible con la clasificación del grado de severidad. Además de hojas de calificación, puede proporcionar información útil para la clasificación de la severidad de un procedimiento. El protocolo es fácil de realizar y no requiere equipo extensa, puede integrarse en un experimento continuo sin influir en los resultados de un estudio. Cabe señalar que la investigación Animal: informes de en Vivo experimentos (llegar) pauta¹¹ debe ser observado en todos los estudios de experimentación animal, con el objetivo de mejorar el diseño, análisis y presentación de informes.

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Protocolo

El estudio se realizó según las directrices establecidas por la ley de Bienestar Animal y fue aprobado por la autoridad del estado de Berlín ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", permiso número: G0053/15).

Nota: El objetivo principal de este protocolo fue investigar el efecto de la anestesia repetida en metabolitos de glucocorticoides. Se realizó un cálculo de tamaño de muestra para determinar el número de animales a utilizar: n ≥ 2 × (s/μ₁- μ₂)² x (z_α + z_β)². μ₁- μ₂ es la diferencia entre medias de la población a que potencia y muestra se hacen cálculos de tamaño (α = 5%, β = 80%); z_α = 1.96 y z_β = 0.84 son los cuantiles de la distribución normal estándar. La figura 1 ilustra la línea de tiempo del presente Protocolo. Si un parámetro del protocolo muestra una diferencia con el nivel de control, el animal debe ser estrechamente vigilado, y el parámetro debe medirse otra vez después de un período adecuado. Por ejemplo, si comportamiento relacionadas con la ansiedad rasgo se incrementa, este comportamiento debe ser evaluado otra vez una semana más tarde, con el fin de ayudar a determinar el periodo hasta la recuperación completa. Momentos y periodos definidos en el presente Protocolo pueden ser adaptados para su uso con otros procedimientos. Al cambiar los puntos del tiempo, períodos de habituación deben mantenerse como se describe en el protocolo. Con el fin de reducir los factores que podrían influir en el comportamiento de los ratones, se deben realizar pruebas que requieran manipulación más después de pruebas que no perturban el normal comportamiento de los ratones. Figura 2 resume todas las pruebas del Protocolo con una hoja Resumen de puntuación. La figura 3 muestra simplificadas escalas del grado de bienestar, que dan una visión general de cómo interpretar los resultados de la prueba.

1. habituar ratones a manejo por experimentador

1. Permiten ratones a habituarse a un centro de animales de al menos 2 semanas después de que se han obtenido de otro servicio o proveedor.
2. Casa de ratones en los grupos y mantenerlos en condiciones normales (temperatura de 22 ± 2 ° C; humedad relativa 55 ± 10%) en un ciclo luz: oscuridad de 12:12 h.
3. Proporcionar a todos los grupos un nestlets túnel y algodón como enriquecimiento de la norma y proporcionar comida y agua ad libitum.
4. Habituarse a todos los ratones al túnel o taza de manejo por lo menos una semana antes de la prueba¹².
   Nota: Recoger ratones por la cola puede inducir estrés o ansiedad, que afecta a su vez bienestar y también tiene un impacto en los resultados de este protocolo¹².

2. preparación de la sala de pruebas conductual y aparatos

Nota: Proporcionar un cuarto separado para la prueba, idealmente cerca de la sala donde se guardan los animales. Transporte de los ratones en sus jaulas de inicio a la prueba sala al menos 60 min antes de que el procedimiento se lleva a cabo. Si es posible, llevar a cabo todas las pruebas del presente Protocolo en la misma sala de pruebas donde se realiza el procedimiento.

1. Preparar una jaula de observación para probar madriguera comportamiento⁸ y para tomar las fotografías para su uso en el MGS¹³ (figura 4).
   1. Utilice una caja de vidrio con una superficie de aproximadamente 220 mm × 290 mm y una altura de 390 mm.
   2. Cubrir el piso de esta caja con aproximadamente 0,5 cm de material del lecho.
   3. Esparcir un puñado de ropa de cama usados material de la caja de página sobre el nuevo material de ropa de cama para reducir la angustia causada por el nuevo entorno.
   4. Proporcionar alimentos, la misma clase que normalmente se suministra como dieta y agua.
      Nota: si posible, use botellas de agua, porque los ratones pueden llenar recipientes de agua con material del lecho.
2. Preparar una jaula (tipo III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) para el período de observación de 24 h, para que los ratones están alojados individualmente (figura 5).
   Nota: Para minimizar la duración de la vivienda individual, recoger datos para nido edificio comportamiento, jaula Inicio actividad, ingesta de alimentos y metabolitos de corticosterona fecal (FCM) durante este período.
   1. Lugar del lecho nuevo material en la jaula (aproximadamente 0,5 cm de profundidad) y la dispersión de un puñado de material de cama utilizado sin las heces de la jaula casera sobre el nuevo material, con el fin de reducir la angustia.
   2. Proporcionar un nestlet normalizados cuadrado de algodón de un peso definido, como enriquecimiento ambiental (ver tabla de materiales) sólo¹⁴.
      Nota: Nestlets comerciales pueden diferir en peso. Por ello, modificó el peso de la nestlet descrito por diácono y usa 2,0 g en lugar de 2,7 g¹⁴.
   3. Monte el sensor de infrarrojos en la parte superior de la jaula, cuando se utiliza un sensor infrarrojo para medir la actividad de hogar jaula (véase tabla de materiales).
   4. Proveer alimentos, el mismo tipo que normalmente se suministra como dieta y agua ad libitum.

3. Mouse Grimace escala

Nota: Las fotografías para el MGS se toman en la jaula de observación en tres momentos: (i) 2 días antes del procedimiento para registro inicial MGS niveles, (ii) 30 min después del procedimiento y (iii) 150 minutos después del procedimiento. Cuando se deteriora el bienestar de las personas, aumentan los puntajes de la MGS. Si mayor puntuaciones MGS se observan aún después de 150 min, tomar fotografías adicionales en una etapa posterior.

1. Utilizar una cámara de alta definición para la fotografía.
2. Transferir el ratón en la jaula de la observación y permiten el ratón para habituarse al nuevo ambiente durante al menos 30 minutos.
3. Tomar continuamente sobre 30-40 fotografías cada vez punto dentro de 1-2 minutos.
4. Ordenar todas las fotografías seleccionando las fotografías frontales o laterales afiladas y descartando fotografías borrosas o fotografías que muestran caras de ratón desde otras perspectivas que vista frontal o lateral.
5. Seleccione al azar una fotografía de cada momento, (es decir, 2 días antes del procedimiento, 30 minutos después del procedimiento y 150 minutos después del procedimiento) para cada ratón.
6. Recortar las fotografías para mostrar sólo la cabeza del ratón para que la posición del cuerpo no es visible¹³.
7. Crear un archivo de hoja de cálculo con una hoja para cada fotografía y agregar una tabla incluyendo las cinco unidades de acción facial de MGS a cada hoja.
   Nota: El archivo contiene fotografías de la línea de base, así como fotografías post procedimiento.
8. Aleatorizar el orden de las hojas.
9. Presentar el archivo en una pantalla de ordenador a tres personas independientes, que fueron previamente entrenadas para utilizar el MGS desarrollado por Langford et al. puntuación de las unidades de acción facial utilizando una escala de 3 puntos (0 = no presente, 1 = presente moderado, 2 = obviamente presente).
   Nota: Puntuación se basa siguiendo parámetros¹³: Orbital apretar ("estrechamiento de la zona orbital, con un párpado totalmente cerrado o un apretón de ojo"); abultamiento de la nariz ("redondeado extensión de piel visible en el puente de la nariz"); abultamiento de la mejilla "(apariencia convexa del de los músculos de la mejilla"); posición de la oreja ("oídos tirados aparte y detrás de su posición de línea de base o presenta estrías verticales que se forman debido a puntas de orejas siendo retirado"); cambio de barba ("movimiento de bigotes de su inicial posición ya sea hacia atrás, contra la cara o a la derecha, como si de pie en el extremo; los bigotes pueden también agruparse").
10. Analizar resultados, como sigue (adaptado de Langford et al. ¹³).
    1. Promedio de todas las unidades de acción facial para cada fotografía para generar la puntuación de MGS.
       Nota: Si una de las unidades de acción facial no podría ser anotada, promedio de las restantes unidades de acción facial.
    2. Restar la media de las fotografías de la base de la media para el procedimiento de post de fotografías obtener una puntuación de diferencia MGS para cada ratón.
    3. Prueba para las diferencias en las puntuaciones de diferencia MGS entre las personas (prueba no paramétrica para muestras relacionadas).
       Nota: Si hay una diferencia significativa (p < 0,05), determinar si las calificaciones de todas las fotografías o sólo decenas de unas fotografías difieren entre las personas. Si esto último es cierto, repetir puntuación de estas fotografías. De lo contrario, las personas deben repetir el entrenamiento de MGS y luego marcar las fotografías otra vez.
    4. Promedio MGS diferencia de puntajes obtenidos de los goleadores diferentes para cada ratón, si los resultados de todas las personas no difieren significativamente.
    5. Utilizar una prueba estadística no paramétrica para comparar las puntuaciones de diferencia MGS un promedio entre los grupos de estudio.

4. madriguera comportamiento^8,15,16

1. Preparar madrigueras mediante la colocación de 140 pellets de alimentación de 2 g ± normalmente suministrados como dieta en estándar botella de agua plástica opaca (250 mL, longitud de 150 mm, diámetro 55 mm, 45 mm de diámetro de cuello de la botella)⁸.
   Nota: Como los ratones prefieren tubos amplia, madrigueras con un diámetro de 68 mm pueden utilizarse como se describe por diácono¹⁶.
2. Lugar la madriguera llena de bolitas de comida en la jaula casa 5 días antes del procedimiento de aclimatación.
   Nota: La unidad regular de distribución de alimentos en la jaula no debe vaciarse pero también debe permanecer llenada de bolitas de comida, como ratones se utilizan para esto.
3. Realizar la prueba dos veces, 2 días antes del procedimiento (línea base); llevar a cabo el pasado 30 min post procedimiento así.
   1. Deja el ratón habituarse por lo menos 30 minutos en la jaula de observación donde se tomaron fotografías para el MGS.
   2. Coloque la botella de agua plástica llenada de pelotillas de alimentos paralelos a la pared posterior de la jaula de observación.
   3. Pesar pellets de alimento (g) queda en la madriguera después de 2 h.
4. Calcular el peso de pellets de alimento extraído de la madriguera de ratones en relación con el peso inicial (%).

5. 24 h período de observación

Nota: Ratones se alojan individualmente, como se describe en 2.2. (Figura 5), para un período de 24 horas, para medir alimentos ingesta, actividad de inicio de jaula, nido comportamiento del edificio y los niveles de la FCM. La observación de 24 h lleva a cabo dos veces: (i) 2 días antes del procedimiento para niveles iniciales, (ii) en el día del procedimiento.

1. Ingestión de alimentos
   1. Pesan los ratones a intervalos regulares (por ejemplo 2 días antes de la anestesia, inmediatamente antes de la anestesia, dos días después de la anestesia y a la semana después de la anestesia), con el fin de evaluar los cambios en el peso corporal (parte de la hoja de puntuación).
      Nota: El peso corporal es necesaria para calcular la ingestión de alimentos por gramo de peso corporal. La ingesta de agua también puede ser medida durante el período de observación de 24 h. Si se reduce el consumo de alimentos, bienestar, puede reducirse.
   2. Determinar el peso inicial de dieta estándar (gramos) en la unidad de alimentos de la jaula (aproximadamente 100 g).
   3. Determinar el peso de la dieta estándar al final del período de observación de 24 h.
   4. Analizar el lado de la jaula debajo de la unidad de comida cuidadosamente para derrame de alimentos y agregar cualquier pellets de alimento adicional encontradas que el peso de los pellets de alimento restante en la unidad de alimentos.
   5. Calcular el consumo de alimentos por unidad de peso de cuerpo.
2. Actividad de jaula casa
   Nota: Las siguientes instrucciones se refieren al uso de un sensor de infrarrojos (véase tabla de materiales), pero la actividad de hogar jaula también puede ser evaluada con programas alternativos. Desviación de la actividad de la casa jaula de niveles de control (por ejemplo, hipoactividad, hiperactividad) puede ser un signo de bienestar deteriorada.
   1. Inicie el programa.
   2. Elija un intervalo de muestreo de 1 min y un tiempo de adquisición de 24 h, lo que significa que los impulsos se registran cada minuto durante 24 h.
      Nota: Si el experimentador entra en la habitación varias veces después de que comenzó la grabación, utilice únicamente datos de épocas, cuando los ratones no fueron disturbados (es decir, durante el periodo oscuro).
   3. Resumen intervalos de 10 minutos de los impulsos.
   4. Calcular el área bajo la curva de tiempo (impulsos x minuto).
3. Comportamiento de construcción de nido
   Nota: Jerarquías complejas y de altos pueden servir como un indicador de bienestar.
   1. Coloque un cuadrado de algodón nestlet (véase Tabla de materiales) con un peso definido (por ejemplo, 2.0 g) en medio de la jaula.
   2. Puntuación del nido en una escala de 5 puntos (véase abajo) según diácono¹⁴ a la mañana siguiente, aproximadamente 2 horas después de que la luz se enciende. Pesar cualquier parte nestlet que esté por lo menos el 5% del peso inicial nestlet. Marcar los nidos de la siguiente manera¹⁴
      1. Asignar la puntuación de "1" si el 90% de la nestlet intacto.
      2. Asignar la puntuación de "2" si es del 50-90% intacto.
      3. Asignar puntuación "3" si es rallado 50-90% de la nestlet.
      4. Asignar puntuación «4» si es destruir más del 90%, pero nido es plano, y menos del 50% de su circunferencia es mayor que la altura del cuerpo del ratón cuando se acurrucó.
      5. Asignar puntuación "5" si más de 90% nestlet es triturado y nido es alta, y más del 50% de su circunferencia es mayor que la altura del cuerpo de un ratón encrespado para arriba.
4. Metabolitos de corticosterona fecal
   Nota: Aumentos del FCM por encima del nivel de control reflejan los niveles de estrés agudo durante el período de postanesthetic 24 h.
   1. Recopilar todos secos pellets fecales de la jaula con unas pinzas al final del período de observación de 24 h y eliminar pellets húmedos contaminados con orina.
   2. Extracto de la FCM según Palme et al. ¹⁷, como sigue.
      1. Muestras fecales secas a una temperatura de 60-70 ° C.
      2. Homogeneizar las muestras fecales utilizando un mortero.
      3. Agite una alícuota de 0,05 g con 1 mL de metanol al 80% en un tubo de centrífuga por 30 min en un vórtice múltiple.
      4. Centrifugar las muestras a 2500 x g durante 15 minutos.
      5. Pipetear 0.5 mL del sobrenadante en otro tubo de centrífuga.
      6. Almacenar muestras de heces (y extractos) un mínimo de-18 ° C.
      7. Analizar FCM usando un 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzima inmunoensayo (EIA)^18,19 u otro EIA completamente validado.
   3. Calcular el porcentaje de cambio de las concentraciones de la FCM en relación con las concentraciones de FCM basal.

6. libre paradigma exploratorio

1. Tomar la casa jaula fuera de la parrilla y coloque en una superficie de la mesa al final del período de observación de 24 h.
2. Coloque una jaula cuadriculada (sin comida ni botellas de agua) en la jaula en un ángulo de 45° hacia el lado más largo de la jaula.
   Nota: No destruir el nido, que sirve como escondite para el ratón, pero Coloque la jaula diagonalmente sobre el nido.
3. Monitor o registro de video los ratones durante 10 min a una distancia de aproximadamente 1,5 m.
   1. Iniciar el temporizador.
   2. Tenga en cuenta todas las veces cuando el ratón sube a la parte superior de la jaula (con los cuatro patas en la parte superior de la jaula) o se deja la parte superior de la jaula (con una o más patas en el piso de la jaula).
      Nota: Algunos ratones pueden subir por la parte superior de la jaula y dejarlo para caminar por el borde de la jaula. Algunos ratones también trasera en la parte superior de la jaula. Tratar estos casos como si los ratones estaban todavía en la parte superior de la jaula.
4. Evaluar parámetros después de Bert et al. ²⁰.
   1. Analizar la latencia a la primera exploración (en segundos).
   2. Analizar el número de exploraciones.
   3. Analizar la duración total (segundos) de exploración.
      Nota: Una alta latencia a la primera exploración, un bajo número de exploraciones y una baja duración total de la exploración puede indicar niveles más altos de ansiedad rasgo.

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Resultados

Este protocolo fue desarrollado originalmente para evaluar el bienestar de ratones C57BL/6JRj después de una experiencia única de la anestesia isoflurano (una sesión de 45min anestesia, n = 13 hembras) o anestesia isoflurano repetidas (seis 45min anestesia sesiones con 3-4 días entre las sesiones de anestesia, números = 13 hembras) comparada con el bienestar de los ratones control (n = 6 hembras)¹⁰, que no recibió anestesia pero fueron probados según las mis...

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Discusión

El protocolo fue desarrollado originalmente para evaluar el bienestar de ratones C57BL/6JRj que recibió un solo anestesia o anestesia isoflurano repetidas. Los resultados confirman las pruebas de comportamientos de lujo, así como otras medidas (por ejemplo, el paradigma exploratorio libre, MGS, escarban la ingestión de alimentos) fueron métodos sensibles para evaluar el bienestar. Anestesia isoflurano repetidos causados a corto plazo efectos de comportamiento relacionadas con la ansiedad de rasgo, el MGS y e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon