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Resumen

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Resumen

La incorporación genética de aminoácidos no-canónico (ncAAs) vía supresión de codón de parada ámbar es una técnica poderosa para instalar sondas artificiales y partes de reactivos a las proteínas directamente en la célula viva. Cada ncAA se incorpora por un dedicado par ortogonal de (AARS) supresor-tRNA/amino-acil-tRNA-sintetasa que es importado en el organismo del anfitrión. La eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs grandemente puede diferir y ser insatisfactoria en algunos casos. Pares orthogonal pueden mejorarse mediante la manipulación de la AARS o el tRNA. Sin embargo, evolución dirigida de tRNA o AARS con grandes bibliotecas y métodos de selección muertos/vivos no son factibles en células de mamíferos. Aquí, se presenta un análisis basado en la fluorescencia fácil y robusto para evaluar la eficacia de pares orthogonal en células de mamíferos. El ensayo permite detección de decenas a cientos de variantes AARS/ARNt con un esfuerzo moderado y en un plazo razonable. Uso de este ensayo para generar nuevo tRNAs que mejoran significativamente el rendimiento del sistema ortogonal pyrrolysine es descrito, junto con la solicitud de ncAAs al estudio de la proteína G unida a receptores (GPCRs), que son un reto objetos por ncAA mutagénesis. En primer lugar, incorporando sistemáticamente un ncAA foto-reticulación a lo largo de la superficie extracelular de un receptor, sitios de unión de ligandos diferentes en el receptor intacto se asignan directamente en la célula viva. Segundo, mediante la incorporación de última generación ncAAs en un GPCR, ultrarrápido receptor catalizador-libre de etiquetado con un colorante fluorescente se demuestra, que explota bioorthogonal promovido por la tensión inversa del aliso de Diels cicloadición (SPIEDAC) en la célula viva. Como ncAAs puede aplicarse generalmente a cualquier proteína independientemente de su tamaño, el método es de interés general para un número de aplicaciones. Además, la incorporación de la ncAA no requiere ningún equipo especial y se realiza fácilmente en los laboratorios de bioquímica estándar.

Introducción

La incorporación genética de sondas químicas a las proteínas es un método poderoso para facilitar la investigación de los aspectos estructurales y dinámicos de la función de la proteína directamente en el contexto natural de la célula viva. Hoy en día, cientos de no-canónico aminoácidos (ncAAs) equipados con los más dispares grupos químicos pueden site-specifically incorporados a proteínas por biosíntesis1,2,3,4. Entre ellos, uno encuentra ncAAs fotosensibles tales como foto-reticulantes5, Foto enjaulado6,7,8,9 y foto conmutable aminoácidos10, 11, aminoácidos, teniendo tensas alquenos y alquinos para bioorthogonal libre de catalizador química2,12,13,14,15,16 ,17, aminoácidos con dansilo18, cumarina9,19y21 fluoróforos de prodan20,y aminoácidos equipados con otros sondeos biofísicas como así como con post traslacional modificaciones1,2,3,4,22,23,24,25.

La codificación genética de un ncAA está habilitada por una dedicada amino-acil-tRNA-sintetasa (AARS) junto a un cognado supresor-tRNA, que incorpora la ncAA en respuesta a un codón ámbar durante la síntesis ribosomal regular. pares de ncAARS/tRNA están diseñados para ser ortogonales en el organismo del anfitrión, es decir, no interferencia con los pares endógenos. La técnica está bien establecida tanto en hosts de procariotas y eucariotas y las células fácilmente aplicables a mamíferos. Pares para la incorporación de la ncAA en células de mamífero se basan en tres sistemas ortogonales principales: el sistema de Tirosil, que combina la TyrRS de e. coli26 con un supresor de Tirosil ámbar de B. stearothermophilus27 (CE TyrRS /Bstpar de ñame), la e. coli leucina sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 y el sistema de pyrrolysyl de archaeal (PylRS/tRNA Pyl par)3, por el que el tRNAPyl es un supresor natural de color ámbar. En general, cada ncAA es reconocido por un ncAARS especializado. Dependiendo de la estructura de la ncAA, la ncAARS se obtiene mediante evolución dirigida TyrRS, LeuRS o PylRS, aunque algunos sintetasas pueden aceptar más de un ncAA.

El par orthogonal se importa dentro de las células utilizando simplemente un vector plásmido. Más común y eficientes plásmidos son bicistronic y codifican para la sintetasa y el ARNt formando el par orthogonal29. Un segundo plásmido de codificación para la proteína de interés con un codón ámbar en el sitio señalado para la modificación es co transfected. La ncAA se agrega simplemente al medio de crecimiento de la célula. Sin embargo, diferentes grupos especializados utilizan diversas variantes del plásmido construcciones incluso para la incorporación de la ncAA mismo. Construcciones difieren en el arreglo de los genes en el vector, tipo de la sintetasa, uso del codón en el gene de la ligasa, uso de promotor, variante del tRNA y el número de casetes de expresión tRNA. Por otra parte, la eficacia de la incorporación de diferentes ncAAs puede variar drásticamente debido a la diferente eficacia catalítica de las sintetasas diferentes, la calidad de los tRNA y otros factores30. Por lo tanto, es importante disponer de un método rápido y confiable para evaluar la eficacia de un par orthogonal, elegir el sistema más adecuado para una aplicación deseada y realizar algunas medidas de optimización que mejoran la expresión de la proteína total rendimientos.

Hemos establecido un análisis simple y robusto basada en fluorescencia, para evaluar la eficiencia de pares orthogonal29 (figura 1). En el ensayo, las células son co transfected con el plásmido de codificación para el par orthogonal, junto con un plásmido de reportero bicistronic de codificación para la proteína verde fluorescente con un codón ámbar en una posición permisiva (EGFPetiqueta) y la mCherry gene. Fluorescencia roja y verde de Lisados celulares se leen en canales separados en un lector de placas en una placa de 96 pocillos. La intensidad de la fluorescencia verde se correlaciona directamente con la eficacia de la supresión de ámbar, mientras que la intensidad de fluorescencia roja da una estimación directa del tamaño de la muestra medida y la eficiencia de transfección. Con respecto a ensayos similares basados en fluorescencia celular asistida clasificación (FACS) leer31,32, el ensayo da una evaluación inmediata y completa de expresión de la proteína en la población de células enteras, que es más representativo de las condiciones experimentales usuales y ofrece una fácil adquisición de datos y procesamiento con software estándar. En general, la principal ventaja del ensayo es que un medio a un gran número de muestras puede analizarse en paralelo. Usando este análisis, hemos defendido una biblioteca racionalmente diseñada de supresor-tRNAs para mejorar la eficiencia de la Pyl sistema ortogonal30. Este trabajo describe el protocolo experimental para realizar este análisis y mostrar ejemplos de su aplicación, incluyendo la optimización del par ortogonal para la incorporación de la foto-reticulación ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) y la comparación de eficacia de la incorporación de aminoácidos diferentes (figura 2).

En los últimos años, herramientas de la ncAA se han demostrado muy potentes para investigar estructurales y aspectos funcionales de la proteína G acoplada a los receptores (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. en los seres humanos, GPCRs forman una gran familia de receptores de membrana (800 miembros) y representan los principales objetivos para las drogas terapéuticas. Caracterización directa de los GPCRs es todavía un reto y métodos bioquímicos complementarios son muy necesarios para su investigación. Hemos sido pionero en el uso de foto-reticulación ncAAs superficies GPCR y descubrir ligando vinculante bolsillos34. Utilizando nuestro sistema optimizado para la incorporación de Azi, incorporamos sistemáticamente Azi en todo el dominio del juxtamembrane entero de un GPCR directamente en células de mamífero vivo. Sobre la irradiación UV, Azi forma una especie de nitrene altamente reactivo que captura covalentemente moléculas vecinas. Cuando el ligando se agrega al sistema, Azi sirve como sonda de proximidad para revelar qué posiciones del receptor se acercan al ligand encuadernado. De esta manera, el modo de unión de la hormona neuropéptido Urocortin tipo I (Ucn1) en el receptor de la clase B GPCR corticotropin-lanzar-factor 1 (CRF1R)33 primero se dio a conocer. Últimamente, hemos revelado patrones de enlace distinto de agonistas y antagonistas sobre el receptor mismo38. Un enfoque similar se ha aplicado por otros orthosteric y sitios de Unión alostérica de otros péptidos y pequeñas moléculas ligandos de otros GPCRs39,40,41,42. Este manuscrito describe el protocolo experimental aplicado en nuestro laboratorio para la foto-reticulación asignación de superficies GPCR. El método es relativamente rápido, sencillo y no requiere ningún equipo especial, por lo que es aplicable en los laboratorios de bioquímica estándar. Lo importante es el enfoque proporciona una herramienta valiosa no sólo para identificar sitios de unión del ligando donde escasean los datos estructurales 3D, pero también para complementar en vitro los datos existentes con información de receptores completamente postraduccional modificados en el entorno fisiológico de la célula viva.

El reciente desarrollo de novela ncAAs cojinete en el lado cadena grupos químicos adecuados para la química ultrarrápida catalizador-libre bioorthogonal ha abierto la posibilidad de instalar fluoróforos de última generación para la proyección de imagen de súper-resolución en proteínas directamente en la vida de las células2,43. Tales anclajes químicos incluyen cyclooctyne filtrada en SCOK14, nonyne de bicyclo [6.1.0] en BCNK12,17y trans-cyclooctenes en TCO * K13,15,17 entre otros ncAAs albergar un norbornene16,17,44 o cyclopropene45,parte de la46 . NcAAs voluminosos para bioorthogonal química se incorporan por una variante de la PylRS generalmente se denota como PylRSAF (indicando que la mutación Y271A y Y349F en PylRS de Methanosarcina M. ), así como por otras ad hoc evolucionado ncAARSs17 , 44. las anclas de bioorthogonal reaccionan con reactivos de tetrazina47 través de cicloadición de Diels-Alder de demanda electrónica inversa para dar altos rendimientos Etiquetadoras dentro de unos minutos43,48. Sin embargo, aplicación de este enfoque poderoso sello GPCRs ha estado desafiando debido a una baja eficiencia global del sistema de incorporación de ncAA ortogonal. Utilizando nuestro sistema mejorado de Pyl, recientemente hemos demostrado alto rendimiento incorporación de tales aminoácidos GPCRs y ultrarrápida etiquetado GPCR en la superficie de células de mamífero vivo30. Receptores etiquetados fueron todavía funcionales, ya que fisiológicamente internalizado al activar el receptor con un agonista. El protocolo experimental para la incorporación de bioorthogonal anclajes en GPCRs y aquí se describen los siguientes pasos de etiquetado. Equipar a GPCRs con fluoróforos brillante pequeño, es el primer paso fundamental para el estudio de la dinámica estructural de GPCR en la célula viva mediante técnicas de microscopía avanzada.

Protocolo

1. fluorescencia basada en la proyección de las eficiencias de incorporación (figura 1)

  1. Mantener las células HEK293 en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; alta glucosa, glutamina 4 mM, piruvato) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2.
  2. Las células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células por pocillo de placas de 6 pozos en medio de cultivo completo de 2 mL en semilla 6.0 x 105 HEK293. Preparar tantos pozos como el número de muestras y dos pozos adicionales para la EGFP de tipo salvaje y una muestra de mock-transfected, respectivamente.
  3. Control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio. Transfectar las células en la confluencia de ~ 70% utilizando reactivo polietilamina (PEI).
    1. 1h antes de la transfección, añadir la cantidad apropiada de solución stock de ncAA recién preparada en todos los pocillos para una concentración final de la ncAA de 0.25-0.5 mM. Añadir la ncAA a todos los pozos, incluyendo el control positivo de tipo salvaje y las células transfected mock, para evitar que las diferencias en las señales de fluorescencia que pueden ser causadas por efectos de la ncAA en el crecimiento celular.
      Nota: Para preparar las soluciones madre, disuelve la ncAA a 0.1-0.5 M utilizando 0.2-0.5 M NaOH. Sin embargo, algunos ncAAs requieran inicial solubilidad en DMSO o neutralización por cuatro volúmenes de 1 M HEPES (pH 7,4) antes de su uso. Comúnmente, el fabricante recomienda un protocolo para preparar una solución madre.
    2. En un tubo de microcentrífuga, mezcle 1 μg de plásmido ADN codificación para que el par de ncAARS/tRNA a probar con 1 μg de plásmido reportero ADN (EGFP pcDNA3.0183TAG- mCherry). En tubos separados, preparar una transfección idéntica con la referencia de tipo salvaje EGFP y una transfección falsa.
      Nota: Número de copias del cassette de tRNA en el plásmido de codificación para el par de ncAARS/ARNt depende de la aplicación. Para facilitar la clonación, 1 copia de tRNA se recomienda cribado tRNAs diferentes, mientras que 4 copias se recomiendan (aunque no es estrictamente necesaria) cuando ncAARS diferentes pruebas o la incorporación de ncAAs diferentes por el mismo par orthogonal.
    3. A cada tubo que contiene el ADN añadir 100 μl del lactato solución salina tamponada (LBS) que contiene lactato de sodio 20 mM pH 4.0 y 150 mm NaCl. Mezclar brevemente.
    4. A cada tubo que contiene el ADN en libras añadir 6 μl de 1 μg/μl PEI en libras (relación PEI ADN = 3/1 w/w) y agitar inmediatamente. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
    5. 400 μL de medio celular de cada bien y añadir a la mezcla de ADN-PEI para neutralizar el pH. Gotear la mezcla de ADN en las células.
      Nota: DMEM generalmente contiene rojo de fenol como indicador de pH. Durante la etapa de neutralización del color de la mezcla en el tubo cambiará de amarillo (ácido) a rojo (neutro). Aunque formando los complejos ADN en libras en pH ácido da el más alto de la transfección rendimientos50, complejos ADN-PEI como alternativa se pueden formar directamente a pH 7.4 (por ejemplo en DMEM libre de suero). Si usa DMEM para formar complejos de ADN, omita el paso de la neutralización 1.3.5. En cualquier caso, es esencial que no suero está presente en la mezcla cuando se forman los complejos.
  4. Cosecha de la transfección de células 48 h.
    1. Aspire el medio y enjuague las celdas una vez con 2 mL de PBS precalentado (37 ° C). Añadir 800 μl de PBS suplementado con 0,5 mM EDTA e incubar por 20 min a 37 ° C. Soltar y suspender las células mediante pipeteo arriba y abajo.
    2. Transferir la suspensión a tubos de 1,5 mL conteniendo 200 de μl PBS suplementado con 5 mM de MgCl2.
    3. Centrifugar durante 2 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
      Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. En este caso, flash-congela los pellets en líquido N2 y conservarlo a-80 ° C hasta un mes. Utilice siempre gafas de protección ocular.
  5. Añadir 100 μl de tampón de lisis Tris (50 mM Tris-HCl de pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 1 mM EDTA y PMSF recién agregado) a los pellets de células e incubar en hielo durante 30 minutos. Para facilitar la lisis, vortex cada 5 min.
  6. Desactivación de los restos celulares por 10 min a 4 ° C y 14.000 x g y transferir 90 μl del sobrenadante en negro placas de 96 pocillos. Medida de fluorescencia EGFP y mCherry usando un lector de placa equipado con un módulo de fluorescencia.
    Nota: Utilizar filtros de excitación y de emisión adecuados para la EGFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) y mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Valores medidos de EGFP desarrollará en un rango entre el valor mínimo Obtenido de células transfectadas falsa y un valor máximo, que se obtiene generalmente de tipo salvaje EGFP. Tenga cuidado de establecer la ventana correcta para la medición en el instrumento.
  7. La eficacia de la incorporación de la ncAA se calcula como el cociente de la fluorescencia de la muestra y la fluorescencia obtenida de expresión de EGFP de tipo salvaje. Todos los valores se normalizan a mCherry fluorescencia.
    figure-protocol-5915

2. genética incorporación de ncAAs GPCRs para foto-reticulación mapeo de ligando GPCR interacciones (figura 3)

  1. Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2(v/v).
  2. Células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo arriba y abajo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células por pocillo en medio de cultivo completo de 2 mL en placas de 6 pocillos en semilla 5.0 x 105 293T. Para que cada posición que se proyectarán, preparar 1 bien por ligando más bien por el obligatorio control33,38. Puede incluirse un pozo extra para ser transfectadas con el receptor de tipo salvaje (wt) para verificar el nivel de expresión de los mutantes.
  3. Al día siguiente, control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio. Transfectar células en ~ 70% confluencia con PEI.
    1. 1h antes de la transfección, añadir Azi a todos los pozos a una concentración final de 0,5 mM.
      1. Preparar una solución de 0,5 M de Azi. Por placa de 6 pozos, pesan 1,2 mg Azi en un tubo y disolver en 15 μl 0.5 M NaOH. Diluir la solución en medio completo de 1,2 mL y añadir 200 μL de la mezcla a cada pocillo.
        Nota: Preparar una solución fresca de Azi para cada experimento. La molécula de azida tiene una vida media corta en soluciones acuosas, especialmente en pH básico, y el AziRS incorpora intacto sino también la forma degradada.
    2. Transfectar una cantidad total de ADN de 2 μg por pozo: 1 μg de plásmido de codificación para el GPCR tagged bandera teniendo un codón de etiqueta en la posición deseada y 1 μg de la codificación del plásmido para la pareja ortogonal dedicada a Azi (E2AziRS51 y 4 copias del cognado ARNt supresor BstYam)33,38.
      Nota: Cuando se incluye una comparación de la wt para verificar los niveles de expresión, transfectar una menor cantidad de ADN de plásmido para el receptor wt. Dependiendo de lo GPCR, 0.2-0.5 μg de plásmido codificación el peso del receptor similar rentabilidades como 1,0 μg de plásmido mutante. Transfectar la misma cantidad de ADN en todos los pocillos, llenando el ADN que falta con un mock (por ejemplo un vector vacío).
    3. Proceder como se describe en 1.3.3-1.3.5.
    4. transfección después de 48 horas, proceda con el paso 2.4 para la foto-reticulación de los ligandos o vaya al paso 2.5 para la cosecha directa y análisis para verificar la expresión del receptor.
  4. Foto-reticulación del ligand.
    1. Preparar una solución madre de 1.000 x ligando. Disolver el ligando péptidos en una concentración de 100 μm en DMSO.
      Nota: La concentración de ligando depende de la constante de disociación KD de la interacción de ligando GPCR. Una concentración final de 100 x KD es recomendable. Si el ligando de péptido es una sal de ácido trifluoroacético (TFA), considerar el peso de TFA al calcular el peso molecular (1 x TFA por base del aminoácido en el péptido). Asimismo, considere que los péptidos son en general higroscópico. Evitar congelar repetido de polvo péptido y nunca abra un contenedor de péptido hasta que no alcance temperatura ambiente.
    2. Diluir el ligando solución 1:1,000 en tampón de Unión compuesto por BSA 0.1%, 0.01% Triton-X 100, 5 mM MgCl2 en solución tampón HEPES disociación (HDB) 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES)-HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl y 5 mM KCl. Prepare 1 mL por mutante Azi GPCR. Reemplazar el medio celular con 1 mL de la solución del ligando. Incubar por 10 min a TA.
      Nota: Ajustar el tiempo de incubación para el GPCR específico, responsables de internalización de la cinética y del receptor del ligand. Prolongando el tiempo de incubación no mejora los rendimientos de reticulación.
    3. Irradiar las muestras durante 20 min en un crosslinker UV a 365 nm con 5 x 8 W tubos y ~ 5 cm de distancia a las células. Separar las células mediante pipeteo y transferirlos a un tubo de reacción de 1,5 mL. Sedimenten las células por 3 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
    4. Disolver una tableta de inhibidor de la proteasa (PI) en 1 mL 25 mM EDTA/H2O para hacer una solución madre de 50 x. Alícuota del PI solución de stock y almacenar a-20 ° C. Diluir la acción 50 x 1:25 en HDB y resuspender el pellet celular en 50 μl de 2 x PI en HDB. Flash-congela las células en el líquido N2.
      Nota: Gafas de protección ocular. En este punto, las muestras pueden conservarse a-80 ° C hasta un mes. Continúe con el paso 2.6.
  5. Cosecha directa de la célula.
    1. Aspire el medio. Añadir 800 μl de EDTA 0,5 mM en HDB. Incubar por 10 min a temperatura ambiente o en el hielo.
    2. Separar las células mediante pipeteo arriba y abajo y transferirlos a un tubo de reacción de 1,5 mL. Añadir 200 μL de 5 mM MgCl2 en HDB. Sedimenten las células por 3 min a 800 XG y descartar el sobrenadante.
    3. Resuspender el pellet celular en 50 μl de 2 x PI en HDB y flash freeze en líquido N2. Gafas de protección ocular.
      Nota: En este punto, las muestras pueden almacenarse a-80 ° C durante 1 mes.
  6. Lisis de la célula.
    1. Descongelar las células en un baño de agua a 37 ° C durante 30-45 s y agitar brevemente. Mantener las muestras frías de ahora en adelante. Membranas de pellets a 2.500 x g y 4 ° C durante 10 minutos eliminar el sobrenadante, que contiene la mayor parte de proteínas citosólicas.
    2. Resuspender el pellet en buffer de lisis HEPES 50 μl que contenía 50 mM HEPES-ácido clorhídrico de pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Tritón X-100, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM TDT y recién añadido 2 Cóctel de PI. Mezclar bien. Lyse las células 30 min en hielo y agitar cada 5 min.
    3. Desactivación de los restos celulares por 10 minutos a 14.000 x g a 4 ° C. Inmediatamente transferir el sobrenadante a un tubo de reacción fresca.
      Nota: Proceder con el análisis inmediato. Los lisados pueden almacenarse a-20 ° C, sin embargo, cada ciclo de hielo-deshielo deteriora la calidad de los resultados.
  7. Análisis de Western blot.
    1. Para preparar la muestra, tomar 3-5 μl lisado y llenarlo hasta 7 μl con H2O. Añadir 2 μL 1 M TDT y buffer de muestra 4 x 3 μl que contiene 63 mM Tris-HCl de pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol y bromofenol 0.04% azul. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
    2. Cuando el GPCR es glucosilada y bandas débiles o manchados son un problema, deglycosylate las muestras con PNGasa F para aumentar la intensidad de la señal y afilar las bandas. Utilizar 3-5 μl lisado y deglycosylate en un volumen total de 10 μl, siguiendo el protocolo del proveedor. Agregar 3 μl 4 x el tampón de muestra.
      Nota: Proteínas de membrana son a menudo glicosiladas en varios sitios y Estados, que deteriora la calidad de la resolución en análisis de SDS-PAGE. Sin embargo, no no deglycosylate las muestras para el análisis del nivel de expresión de los mutantes de GPCR Azi usando los anticuerpos de anti-FLAG porque es relevante evaluar la porción de completamente glucosilada, madura del receptor en la superficie celular.
    3. Resolver las muestras via estándar SDS-PAGE y luego transferencia de proteínas a una membrana PVDF.
      PRECAUCIÓN: La acrilamida es neurotóxica. Use guantes y protección para los ojos.
    4. Bloquear la membrana de 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C en 5% de leche descremada en TBS-T que contiene 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, NaCl 0,15 M y 0,1% Tween 20.
    5. Sonda de la membrana con un anticuerpo anti-ligando, seguido por el anticuerpo secundario conjugado con HRP. En el medio de lavado con TBS-T. Para detectar el nivel de expresión de lo GPCR Azi, sonda de membrana con un anticuerpo comercial de HRP (véase Tabla de materiales).
    6. Realizar la reacción de quimioluminiscencia mejorada (ECL) utilizando reactivos caseros de ECL y detectar señales de 5 min en la oscuridad.

3. ultrarrápido Bioorthogonal etiquetado de GPCRs en células mamíferas vivas

Nota: El protocolo está optimizado para cubreobjetos cámaras 4 pozos (zona bien = 2,2 cm2). Para tamaños bien distintos, el protocolo debe adaptarse en consecuencia.

  1. Revestimiento de la superficie del portaobjetos. Llevar a cabo todo el procedimiento bajo una campana de estéril.
    1. Preparar un bromhidrato de poly-D-lisina (MW = 500-550 kDa) solución (PDL) en una concentración de 1 mg/mL en tampón de borato de 50 mM (pH 8.5). Almacenar a 4 ° C hasta por 6 meses. No congelar.
    2. Diluir solución stock 1:40 de la PDL en agua ultra puro estéril a una concentración final de 25 μg/mL (solución de trabajo), a continuación, filtrar la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm.
      Nota: La solución de trabajo puede guardarse a 4 ° C hasta por 3 meses.
    3. Cubrir completamente el fondo de cada pozo del portaobjetos de microscopía con 500 μl de solución de trabajo de PDL. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y aspirar la solución de trabajo de PDL.
      Nota: La solución de trabajo de PDL puede usarse hasta tres veces. Si la solución tiene que ser reutilizado, transferir la solución de los portaobjetos recubiertos a un tubo estéril fresco y por consiguiente la etiqueta del tubo. Nunca mezcle la solución reciclada con solución fresca.
    4. Enjuague cada bien 3 x con ~ 700 μl de agua ultra pura estéril y deje secar durante al menos 1 h.
      Nota: Es muy importante lavar los pocillos con precisión, como residuos de la solución PDL son tóxicos para las células. Los portaobjetos recubiertos pueden utilizarse inmediatamente para microscopía o almacenados hasta por una semana a 4 ° C.
  2. Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C, 95% de humedad y 5% CO2(v/v).
  3. Células de la semilla la transfección de víspera.
    1. Separar las células durante 5 minutos a 37 ° C en 0.05% tripsina/PBS suplementado con 0,5 mM de EDTA. Use 1 mL de tripsina/EDTA para un plato de 10 cm. Saciar con 10 volúmenes de medio completo y resuspender las células mediante pipeteo. Contar el número de células en la suspensión usando un hemocitómetro49.
    2. Células de semilla 1.0 x 105 HEK293T por pozo (área de 2,2 cm²) en 600 μl DMEM completo libre de tinte.
      Nota: Para propósitos de la proyección de imagen, es muy conveniente trabajar desde el principio en un medio que no contiene ningún colorante. Formulaciones de DMEM libres de tinte están comercialmente disponibles.
  4. Control de confluencia (área ocupada por las células) bajo un microscopio y transfectar las células en confluencia de ~ 70% utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos.
    1. 1 h antes de la transfección, prepare una solución fresca de 100 mM de TCO * K en 0,2 M NaOH y DMSO 15% (v/v).
    2. Por pocillo, mezclar 3 μl de la TCO * solución madre de K con 12 μl de pH HEPES de 1 M 7.4. Añadir suavemente la solución a los pozos con un TCO final * concentración de K de 0,5 mM.
    3. Preparar un total de 500 ng de ADN por pozo. En un tubo de microcentrífuga, diluir 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de plásmido de codificación para la MbPylRSAF/tRNA par orthogonalPyl (cuatro cassettes de tRNAM15) y 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plásmido en 50 μl de medio (tinte libre, libre de suero, antibiótico libre).
      Nota: En general, la transfección del Arrestin no es necesaria observar la internalización de GPCR. Sin embargo, Arrestin3 transferencia Co acelera la internalización de la CRF1R, que es muy conveniente cuando se analiza la internalización de los muchos mutantes.
    4. Diluir 1.25 μl de reactivo de transfección basada en lípidos (2,5 μL 1 μg de ADN) en 50 μl de medio (tinte libre, libre de suero, antibiótico libre) y añadir la solución a la mezcla de ADN. Inmediatamente Vortex e incubar 5-10 min en complejos agregar RT. lípidos de ADN a las células.
      Nota: En nuestra experiencia, la morfología de las células transfectadas con transfección basada en lípidos parece más fisiológico en comparación con el de células transfectadas con el PEI. PEI proporciona una mayor eficiencia de transfección, PEI debería prefiere para los usos aguas abajo como el Western blot, considerando que la base de lípidos la transfección es la mejor elección para transfectar las células para experimentos de imagen.
  5. etiqueta de la transfección, la 24 h el receptor con tintes fluorescentes.
    1. Preparar una solución madre del colorante tetrazina 0,5 mM en DMSO y a 10 mg/mL de ADN tinción colorante solución ultra pura de H2O.
    2. Transferir 100 μl de medio de cada bien en un tubo de reacción de 1,5 mL. Agregue 1.8 μl de la solución stock de colorante tetrazina y 0,3 μl del ADN tinción colorante solución. Transferir el medio que contiene los tintes hacia el pozo e incubar 5 min a 37 ° C.
      Nota: Tetrazina-naranja-fluorescente tinte tiene una concentración final de 1,5 μm.
    3. Aspire el medio y lavar suavemente las células dos veces con PBS para eliminar exceso de colorante. Añadir 600 μl de tinte completo medio de crecimiento libre precalentado a 37 ° C.
  6. Internalización de la microscopia y el receptor de la fluorescencia.
    1. Visualizar los receptores etiquetados bajo 63 x (o similar) aumento el uso de filtros apropiados para GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), tinte naranja fluorescente (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) y ADN tinción colorante (λ ABS: 350 nm; Λem: 461 nm). Tome una foto con cada filtro antes de activar el receptor.
    2. Promover la internalización del receptor con 200 nM de Ucn1.
      1. Preparar una solución madre de 1.000 x Ucn1 de 200 μm en DMSO.
        Nota: Dependiendo de la solubilidad del péptido, puede ser capaz de preparar el caldo en agua pura o buffer.
      2. Transferir 100 μl de medio de un pozo en un tubo de reacción de 1,5 mL y añadir 0,6 μl de la solución madre de agonistas de péptidos. Transferencia al medio de nuevo en el pozo.
      3. Observar la internalización en el microscopio. Tomar fotos después de la ocurrencia claramente perceptible de la internalización (10-15 min a horas, según el receptor y la sobreexpresión de Arrestins) usando los filtros mencionados anteriormente.

Resultados

El contorno de la prueba de fluorescencia se representa en la figura 1. El ensayo se emplea en tres aplicaciones. En primer lugar, un número de variantes de tRNA para la incorporación de Lys(Boc) por el par de Pyl ortogonal es evaluado. Lys(BOC) es un aminoácido sterically similar a Pyl. Pyl no esté comercialmente disponible, Lys(Boc) se utiliza comúnmente como un substrato estándar para la PylRS. Los tRNAs seleccionados se basan en el tRNAPyl

Discusión

El protocolo describe un ensayo sencillo y fiable para evaluar la eficiencia de pares ortogonales para la incorporación de ncAAs proteínas expresadas en células de mamíferos. La principal ventaja de este método con respecto a ensayos ampliamente utilizados basado en FACS es que permite la realización simultánea y medición de un número mayor de muestras y proporciona datos que se analizan fácilmente utilizando un software normal. La disponibilidad de un método de mediano rendimiento para analizar pares orthogon...

Divulgaciones

Los autores no tienen ninguna conflictos para declarar.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido fundado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) en subvenciones CO822/2-1 (programa de Noether del Premio Emmy) y CO822/3-1 a I.C.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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