Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la manipulación de genes específicos cardiacos en ratones. Bajo anestesia, los corazones de ratón fueron externalizados a través del cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación genes específicos fueron inyectados con una jeringa en el miocardio, seguido por la medida de expresión de la proteína vía proyección de imagen en vivo y Western blot análisis.

Resumen

Manipulación de genes en el corazón significativamente potenciar la investigación de los pathomechanisms de la enfermedad cardiaca y su potencial terapéutico. En vivo entrega de gene cardiaco específico se logra comúnmente por la entrega ya sea sistémica o local. Inyección sistémica vía vena de la cola es fácil y eficiente en la manipulación de expresión génica cardiaca mediante el uso de virus adeno-asociado recombinante 9 (AAV9). Sin embargo, este método requiere una cantidad relativamente alta de vector para la transducción eficiente y puede resultar en la transducción de genes órgano no-objetivo. Aquí, describimos un método simple, eficiente y ahorro de tiempo de inyección intramiocárdica de en vivo manipulación gene cardiaco específico en los ratones. Bajo anestesia (sin ventilación), sin rodeos se disecaron los músculos pectorales mayores y menores, y el corazón de ratón rápidamente fue expuesto por externalización manual a través de una pequeña incisión en el cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación de luciferasa (Luc) y del receptor de vitamina D (VDR) u horquilla corto RNA (shRNA) dirigidos a VDR, fue inyectada con una jeringa Hamilton en el miocardio. Posterior en vivo la proyección de imagen demostró que luciferasa fue exitosamente sobreexpresado en el corazón. Además, el análisis de Western blot confirman la sobreexpresión exitosa o silenciamiento de VDR en el corazón de ratón. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para la manipulación de genes, así como la inyección de las células u otros materiales como nanogels en el corazón de ratón.

Introducción

Enfermedad cardiaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo^1,2. La falta de estrategias terapéuticas eficaces para enfermedades del corazón potencialmente mortales incluyendo infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca atrae la exploración intensiva de pathomechanisms subyacentes y la identificación de nuevas opciones terapéuticas³. De estas exploraciones científicas, manipulación de genes cardíacos específicos es ampliamente utilizado^4,5. Manipulación genética cardiaca puede lograrse mediante la edición del genoma con la nucleasa de efectoras como activador de transcripción potente (TALEN) y agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) / CRISPR asociados proteína 9 (Cas9) herramientas, o por entrega de materiales genéticos ectópicas (p. ej., vectores de virus portadores de genes que codifican las proteínas de interés)⁶. Aunque la edición del genoma permite modificaciones del genoma exacto y espacio-temporales en ratones vivos, sigue siendo un desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva práctica⁶. Por otra parte, manipulación de genes cardíacos específicos al vector de virus o interferir pequeño entrega complejo RNA (siRNA) son habitualmente realizadas⁶.

Entrega de vectores de virus en el corazón de ratón adulto se logra aproximadamente dos estrategias: inyección local o sistémica. Inyección sistémica de cardiotropic serotipo de aireación como AAV9 es no invasiva para la manipulación de genes específicos cardiacos⁷. Sin embargo, este método requiere una cantidad relativamente alta de vectores necesarios para la transducción eficiente y expresión génica y puede resultar en significativa transducción de nontarget órganos como el músculo y el hígado⁷. Inyección local de virus se logra por inyección intramiocárdica o intracoronaria entrega⁷. Entrega intracoronaria conduce a una distribución más uniforme del virus dentro del corazón en comparación con la inyección intramiocárdica. Sin embargo, las desventajas de esta técnica son el lavado rápido fuera de vectores virales para la circulación sistémica y la transducción de señales en órganos no objetivo⁸y su exigencia de dispositivos para la medición de la presión durante la operación. Por el contrario, permite de inyección intramiocárdica mejor retención de virus en el miocardio, así como entrega de sitio específico, pero es incapaz de distribuir virus vector⁷. Para pequeños animales, entrega intracoronaria es técnicamente difícil de realizar, mientras que la inyección sistémica de AAV9 e inyección intramiocárdica más comúnmente practicado^4,5,7. Aunque la inyección sistémica es fácil de realizar, inyección intramiocárdica convencional requiere toracotomía y ventilación mecánica, provoca daño tisular extenso y es desperdiciadora de tiempo.

En este informe, describimos un método fácil, ahorro de tiempo y muy eficiente para la inyección intramiocárdica. Codificación de luciferase y VDR o shRNA dirigido a VDR, adenovirus fue inyectado para manipular la expresión genética cardiaca. Una vez dominado, este método puede utilizarse para la manipulación de genes, así como la inyección de las células u otros materiales en el corazón de ratón.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron según directrices para los institutos nacionales de salud en el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por Comité del Instituto de ética Animal. Ratones machos C57BL/6J (de 8 a 10 semanas de edad) fueron utilizados para los experimentos. Ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos en 24 ° C ± de 4 ° C, bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con libre acceso a agua y alimentos.

1. preparación de solución de Adenovirus

1. A la llegada de la solución purificada de adenovirus, guarde la solución en un congelador de-80 ° C.
   Nota: La inyección de adenovirus fue realizada en ratones viables. Para asegurar la esterilidad de los vectores de adenovirus, el adenovirus (codificación luciferase, VDR o shRNA dirigido a VDR) fueron preparados y purificados comercialmente^9,10.
2. En el día de la operación, sacar la solución purificada de adenovirus (3 x 10¹⁰ placa formando unidades [pfu] / ml) del congelador de-80 ° C y descongelar solución de vector de adenovirus en el hielo.
3. Colóquese una mascarilla, guantes estériles y bata estéril.
4. Preparar un 50-μl jeringa Hamilton que ha sido esterilizado el día antes de la operación.
   Nota: Para la esterilización, la jeringa Hamilton fue envuelta en una gasa y colocada en un esterilizador de alta temperatura/alta presión. El modo de "Esterilización para el sólido" fue seleccionado y esterilización se inició presionando el botón "Inicio".
5. Después de la descongelación completa de la solución purificada de adenovirus, rocíe el tubo que contenga solución de adenovirus con etanol al 75% y mover la solución de adenovirus en campana de flujo laminar estéril.
6. En campana de flujo laminar estéril, aspirar solución adenovirus a 50 μL con la jeringa sin aguja, la jeringa Hamilton seguida de accesorio de una aguja de 30 G de Hamilton.
7. Sostenga la jeringa con la aguja de 30 G hacia arriba y empuje suavemente el émbolo de la jeringa hasta que la aguja se llena con solución de adenovirus (confirmado por la aparición de las primeras gotas de la solución de la punta de la aguja).
   Nota: Tarda aproximadamente 45 μl solución para llenar la aguja de 30 G, por lo que ahora casi ninguna solución es visible en la jeringa.
8. Utilice la jeringa preparada anteriormente para aspirar cuidadosamente otra solución de adenovirus 30 μl y coloque la jeringa ligeramente tapada en hielo para su posterior uso.

2. anestesia y preparación operativo

1. Añadir 20 mL isoflurano en un vaporizador de isoflurano y conecte el vaporizador de isoflurano a un tanque de oxígeno.
2. Abrir la válvula y dejar que el oxígeno flujo del tanque de oxígeno para el vaporizador de isoflurano. Mantener el flujo de oxígeno a 2 L/min a través de un monitor de flujo de oxígeno en el vaporizador de isoflurano.
3. Inducir la anestesia del ratón con 4% de isoflurano en oxígeno al 100% (2 L/min) durante 2 minutos en una jaula plástica conectada al vaporizador de isoflurano.
4. Sacar el ratón anestesiado de la caja de plástico y fijarlo en una plataforma de plástico en la posición prona en una campana de flujo laminar estéril y mantener la anestesia con isoflurano 2% en oxígeno al 100% (2 L/min) a través de un cono de nariz.
5. Confirmar la anestesia adecuada por la falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
6. Aplicar la crema oftálmica estéril para cada ojo para proteger la córnea de la sequedad.
7. Afeitarse el pecho y el abdomen superior. Solicitar crema depilatoria comercialmente disponible en el sitio depilado 1 minuto retirar la crema depilatoria y el resto de la piel con gasas húmedas.
8. Esterilizar el campo quirúrgico (parte inferior izquierda del pecho) con 3 peelings de antiséptico de yodo-clorhexidina base (p. ej. entoiodine). Cubrir el sitio quirúrgico con un paño estéril.

3. intramiocárdica inyección de Adenovirus en corazón de ratón

1. Quitarse los guantes y en un nuevo par de guantes estériles.
2. Esterilice las pinzas, una pinza micro mosquito, un par de tijeras quirúrgicas, y un sostenedor de la aguja en el día antes de la operación en alta temperatura/alta presión esterilizador (véase la nota de paso 1.4).
3. Hacer una incisión en la piel de 0.5 cm a lo largo de la línea que une el xifoides y el axilla. Sin rodeos diseccionar los pectorales mayores y pectorales menores con fórceps y una pinza mosquito micro.
4. Exponga los espacios intercostales por retracción de los pectorales mayores y pectorales menores. Perforar a través y abrir el cuarto espacio intercostal (o el más amplio espacio intercostal por observación) con una pinza hemostática mosquito micro.
5. Empuja el corazón hacia la incisión para extraer el corazón con el dedo índice de la mano no dominante presionando suavemente contra la parte derecha de la pared torácica.
6. Suavemente Sujete el corazón externalizado con el dedo índice y el pulgar de la mano no dominante.
7. Inyectar un total de 30 solución de adenovirus μL en el miocardio del ventrículo izquierdo en tres sitios (pared ventral, dorsal y lateral del ventrículo izquierdo) a través de la jeringa Hamilton llenado de adenovirus (figura 1) con la mano dominante.
8. Después de la terminación de la inyección, coloque inmediatamente el corazón nuevamente dentro del espacio intratorácico.
9. Manualmente, Evacue el aire en el espacio intratorácico presionando suavemente la pared del pecho hacia el lugar de la incisión de la piel.
   Nota: Evacuación exitosa puede ser evidenciado por aleteo de los pectorales mayores y pectorales menores causados por el aire expulsado.
10. Cerca de la piel por sutura horizontal de colchonero con una sutura de seda 5-0.
    Nota: Los pectorales mayores y pectorales menores deben no ser suturados, porque ellos sólo sin rodeos se disecaron y sus estructuras anatómicas están intactas a lo largo de la operación.

4. cuidados posoperatorios

1. Administrar buprenorfina (3 mg/kg) dos veces al día mediante inyección subcutánea para reducir el dolor postoperatorio para las primeras 48 h después de la operación¹¹.
2. Después de la operación, inmediatamente mantener los ratones en una almohadilla de calor (37 º C) hasta que se recuperó completamente. El ratón vuelva a colocar la jaula después de se recupere completamente.
3. Esterilizar la jeringa Hamilton usado y aguja de jeringa de 30 G en un esterilizador de alta temperatura/alta presión (véase la nota de paso 1.4). Recoger la aguja esterilizada de jeringa de 30 G en un contenedor de objetos punzantes.

5. en Vivo la proyección de imagen para medir la expresión de luciferasa cardiaca

1. El día 5 después de la inyección de adenovirus, prepare una solución fresca de luciferin en 15 mg/mL en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS). Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm.
2. Intra peritoneally inyectar a los ratones despiertos con la solución de luciferin en 150 mg/kg de peso corporal.
3. Encienda el sistema de proyección de imagen.
4. Después automático uno mismo-prueba del sistema de proyección de imagen, seleccione el modo de proyección de imagen como "Luminiscente" y realizar los ajustes siguientes: exposición: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Excitación: Bloque; Emisión: abierto.
5. A 10 min después de la inyección de luciferin, anestesiar los ratones por la inyección de hidrato de cloral (300 mg/kg de peso corporal). Confirmar la anestesia adecuada por la falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
6. Asegure los ratones anestesiados sobre una platina calefactada de la proyección de imagen en la posición prona, con el pecho dirigido hacia la cámara.
7. Recoger imágenes (1 imagen por cada ratón) y cuantificar la intensidad de señales dibujando regiones de idéntica medida circulares de interés (ROI) alrededor del pecho.
8. Después de la colección de imágenes, sacrificar a los ratones y recoger los tejidos como se menciona en la sección siguiente.

6. recolección de tejidos

1. En diferentes momentos después de la inyección de virus (figura 1B), anestesiar los ratones con 4% de isoflurano y mantener la anestesia con isoflurano 2% a través de un cono de nariz y fijarlo en una plataforma de plástico en la posición propensa.
2. Hacer una incisión de línea media ventral en el cuello anterior. Exponer la arteria carótida común derecha por retraer los músculos omohioideo y esternocleidomastoideo.
3. Sacrificar a los ratones transecting la arteria carótida común derecha y drenando la sangre.
4. Hacer una incisión de línea media ventral en el abdomen. Cortar las costillas de ambos lados de la caja torácica a lo largo de la línea de midclavicular y transecto el diafragma.
5. Exponer el corazón levantando el xifoides. Encontrar la aorta ascendente y quite con cuidado el tejido adiposo perivascular.
6. Canule la aorta y retrogradely inundar el corazón con una aguja de 30 G conectada a una jeringa de 1 mL con 0,5 mL de 4 ° C solución de tampón fosfato (PBS).
7. Después de la perfusión, suprimir el corazón y dividirla en los ventrículos izquierdos y derecho. Impuestos especiales, el hígado, el pulmón y el bazo.
8. Después de dos lavados en PBS frío (4 ° C), almacenar todos los tejidos recogidos por separado en frascos criogénicos de nitrógeno líquido.

7. determinación de la expresión de la proteína

1. Preparación de buffer de homogeneización mediante la adición de proteasa inhibidor cóctel en tampón de lisis disponibles comercialmente en una proporción de 1: 100. Calcular el volumen total basado en el número de muestras a procesar. Guardar el buffer de homogeneización preparados a 4 ° C para su posterior uso.
2. Sacar los tejidos desde el tanque de nitrógeno líquido. Pese el tejido en balanzas de alta precisión (aproximadamente 60 mg para cada pieza de tejido).
3. Transferir el tejido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 200 μL de tampón de homogeneización y bolas de acero de 1,5 mm preenfriadas (4 ° C) en el tubo de microcentrífuga.
4. Fije los tubos de microcentrífuga en preenfriada (4 ° C) los titulares de metal en un tejido automático, máquina de pulir y comience a homogeneización iniciando la máquina con los siguientes valores: frecuencia: 70 Hz; tiempo: 120 s.
5. Después de la homogeneización, centrifugar el homogeneizado (16.000 × g, 4 º C) y transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL con una pipeta 100 μl.
6. Añadir carga buffer solución (x 5) a la proteína de sobrenadante en una proporción de 1:4 y desnaturalizar la proteína a 100 ° C durante 5 minutos.
7. Los niveles de expresión de proteínas en el corazón y otros tejidos de órganos son más supervisados por análisis de Western blot (representante de resultados se muestran en la figura 2 y figura 3) según el protocolo descrito previamente¹².

Resultados

El protocolo del experimento y algunos de los pasos claves para el método reportado se muestran en la figura 1. A los 5 días después de la inyección intramiocárdica de luciferase codificación de adenovirus (Adv-luc), en vivo la proyección de imagen en adv-luc inyectó ratones indica fuerte sobreexpresión de luciferase específicamente en el corazón (figura 2A, B), que fue confirmada por análisi...

Discusión

El actual informe demuestra una técnica modificada para la inyección intramiocárdica de vectores virales para la manipulación de genes cardíacos, que fue modificada de un método para la inducción del infarto de miocardio por Gao et al. ¹³ actualmente en vivo caracterización de funciones gen específico suele implicar la generación de golpe de gracia o ratones transgénicos^3,14,15

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Laminar flow sterile hood	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Tissue grinding machine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizer	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane vaporizer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III imaging system	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision balance	Sartorius (Göttingen, Germany)	28091873
Instruments
Eppendorf pipette (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Curved tip
Hamilton syringe	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curved, tip width 1.3mm
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Surgical scissors	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibody	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-rabbit IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralic hydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1.8 mL
Depilatory cream	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP tube	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Pore size 0.2 µm
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysis buffer for western  blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Without inhibitors
Ophthalmic cream	Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 silk suture	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ball	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Width 1.5 mm
Syringe needle	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warm mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW