Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células de mástil peritoneales murinas. También describimos dos protocolos para su caracterización funcional: una proyección de imagen fluorescente de la concentración de Ca libre^{2 +} intracelular y una prueba de degranulación basado en la cuantificación colorimétrica de la β-hexosaminidasa lanzado.

Resumen

Mastocitos (MCs), como parte del sistema inmunológico, juegan un papel clave en la defensa del huésped contra varios patógenos y en la iniciación de la respuesta inmune alérgica. La activación de MCs por el cross-linking de superficie IgE limitado a receptor de IgE de alta afinidad (FcεRI), así como a través de la estimulación de varios otros receptores, inicia el ascenso del libre intracelular Ca^{2 +} nivel ([Ca^{2 +}]) que promueve la liberación de mediadores inflamatorios y alérgicos. La identificación de los componentes moleculares implicados en estas vías de señalización es fundamental para la comprensión de la regulación de la función de MC. En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento de murine del tejido conectivo tipo MCs por lavado peritoneal y la cultivación de MCs peritoneales (CMP). Culturas de MCs de diferentes modelos de ratón knockout por esta metodología representan un método útil para la identificación de proteínas implicadas en rutas de señalización de MC. Además, también se describe un protocolo para la célula Fura-2 proyección de imagen como una importante técnica para la cuantificación de Ca^{2 +} en MCs. basada en fluorescencia monitoreo de [Ca^{2 +}] es un confiable y enfoque de uso general estudio de Ca^{2 +} señalización de eventos, incluyendo la entrada de calcio con tienda que funciona, que es de suma importancia para la activación de MC. Para el análisis de MC degranulación, se describe un ensayo de liberación de β-hexosaminidasa. La cantidad de β-hexosaminidasa liberado en el medio de cultivo se considera como un marcador de degranulación para diferentes subconjuntos secretores de todos tres descrito en MCs. β-hexosaminidasa puede cuantificarse fácilmente por su reacción con un sustrato de colorigenic en un Análisis colorimétrico de la placa de microtitulación. Esta técnica altamente reproducible es rentable y no requiere ningún equipo especializado. En general, el protocolo siempre demuestra un alto rendimiento de MCs expresan marcadores de superficie típico MC, mostrando las características morfológicas y fenotípicas típicas de MCs y demostrando las respuestas altamente reproducibles a secretagogos en Ca^{2 +}- Análisis de la proyección de imagen y degranulación.

Introducción

MCs juega un papel destacado durante las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas. Específicamente, MCs participa en la muerte de patógenos, como bacterias y parásitos y también degradan péptidos endógenos potencialmente tóxicos o componentes de venenos (para revisión ver Galli et al. 2008¹). El papel fisiológico de MCs en la inmunidad innata y adaptativa es objeto de acalorado debate. Por lo tanto, las numerosas discrepancias de datos en los estudios realizados con diferentes modelos de ratón deficientes en MC requieren una reevaluación sistemática de las funciones inmunológicas de MCs más allá de alergia². MCs madurados se localizan principalmente en tejidos y órganos como la piel, el pulmón y el intestino y generalmente sólo se encuentran en pequeña cantidad en la sangre. MCs derivan de precursores hematopoyéticos, como progenitores de MC y completar su diferenciación y maduración en los microambientes de casi todos los tejidos vascularizados¹. Factor derivado de células T interleukin (IL) -3 selectivamente promueve la viabilidad, proliferación y diferenciación de una población de pluripotent del ratón MCs de sus progenitores hematopoyéticos³. Factor de células madre (SCF) es producida por células estructurales en los tejidos y desempeña un papel crucial en la MC desarrollo, supervivencia, la migración y función⁴. Las propiedades de los MCs pueden diferir dependiendo de su capacidad para sintetizar y almacenar diversas proteasas o proteoglicanos. En ratones, se distinguen el tipo de tejido conectivo denominada MCs de MCs mucosa según su localización anatómica, morfología y contenido de heparina y proteasas⁵.

En MCs, un aumento del libre citosólico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]) es indispensable para la degranulación y producción de eicosanoides, así como para la síntesis de citoquinas y activación de factores de transcripción en respuesta a antígenos y varios secretagogos⁶. Un objetivo importante aguas abajo de estos estímulos es la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato inositol 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol (DAG). DAG activa la proteína quinasa C y IP3 libera iones de Ca^{2 +} desde el retículo endoplásmico. Agotamiento de estas tiendas activa Ca^{2 +} afluencia vía membrana plasmática Ca^{2 +} , llevando a almacenar calcio operados entrada (SOCE). Este proceso es evocado a través de la interacción del Ca^{2 +}-sensor, interacción stromal molecule-1 (Stim1), en el retículo endoplásmico con Orai1⁷ , así como a través de la activación del canal de (TRPC) canónico potencial transitorio del receptor proteínas (para revisión ver Freichel et al. 2014⁸) en la membrana plasmática.

Para estudiar el papel fisiológico de estos canales, varios farmacológico (uso de bloqueadores de los canales) o enfoques genéticos se utilizan típicamente. En este último caso, supresión de la expresión de la proteína se obtiene dirigiéndose a mRNA (caída) o ADN genómico con global o tejidos específicos⁹ canceladura de un exón codificación un poro formando la subunidad de un canal (eliminatorias). La disponibilidad de un bloqueador con suficiente especificidad para estos canales es limitada. Además, el enfoque de precipitación requiere un control cuidadoso de su efectividad mediante, por ejemplo., Western blot análisis y se ve obstaculizada por la falta de disponibilidad de anticuerpos específicos para la proteína de canal específicos en muchos casos. Así, el uso de modelos de ratón knockout todavía se considera como el estándar de oro para dicho análisis. Un modelo preferido en vitro para la investigación de las funciones de la MC es cultivo de CMP que pueden ser aisladas ex vivo como una población totalmente madura (a diferencia de la distinción de MCs en vitro de, por ejemplo., células de médula ósea)¹⁰ . En comparación con la médula ósea derivada de MCs (BMMCs), que también se utilizan para estudiar la función de MC en vitro, la estimulación de FcεRI y beta-hexosaminidase liberación aumenta 8 y 100-fold en CMP, respectivamente. En este artículo, describimos un método de aislamiento y cultivo de CMP murinas, que permite para obtener después de 2 semanas de cultivo de un elevado número de puro tejido conectivo tipo MCs, suficientes para su posterior análisis.

A pesar de recientes avances en el desarrollo y aplicación de indicadores genético codificados calcio, su uso es aún limitado por dificultades en la entrega de genes a las células diana, específicamente, en células altamente especializadas tales como MCs cultivadas primarios. Además, este grupo de indicadores fluorescentes de [Ca^{2 +}] las mediciones aún carece de tintes radiométrica con un alto rango dinámico. Por estas razones, el método preferido para la medición radiométrica [Ca^{2 +}] sigue siendo el uso del tinte fluorescente "Fura-2"¹¹.

Actualmente, el más de uso general enfoque para la evaluación de MC activación y degranulación es la medida de actividad de β-hexosaminidasa. Β-hexosaminidasa, un mediador alérgico, es uno de los componentes de gránulo de MC que es lanzado conjuntamente con histamina en proporción constante de MCs¹². Β-hexosaminidasa se puede medir fácilmente y con precisión a través de su reacción con un sustrato específico, que produce una cantidad mensurable de un producto colorigenic que es fácilmente detectable en un ensayo colorimétrico de microplacas. En este artículo, se divulga una aplicación de esta técnica para el análisis de las CMP degranulación en respuesta a una variedad de estímulos.

Agregación del receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidad (FcɛRI) activa en MCs una vía de señalización intracelular versátil, conduce a una liberación del contenido de gránulos secretores en el espacio extracelular circundante. Además el antígeno específico, muchos otros estímulos pueden activar MCs para liberar una gran variedad de mediadores inmunomoduladores, como complemento anaphylatoxins (e.g., C3a y C5a)¹³, el péptido vasoconstrictor la endotelina 1 (ET1)¹⁴ , así como numerosas sustancias catiónicas y drogas provocando reacciones pseudoallergic (e.g., icatibant)¹⁵ atando a MRGPRX2¹⁶. Vías de señalización intracelular implicados en la Desgranulación inducida por MRGPR MCs mal se caracterizan con respecto a la señalización intracelular mediada por el FcɛRI; estas vías sólo comenzaron a ser estudiado intensamente durante los últimos pocos años¹⁷ después de la identificación del receptor del¹⁶. Los membrana plasmática canales del ion en la entrada de calcio seguido por estimulación MRGPRX2 siguen siendo en gran parte, para ser entendido. Por lo tanto, el presente artículo se centra también en la señalización intracelular del calcio y degranulación de los MCs estimulado con agonistas de la MRGPR.

Protocolo

Animales todos los procedimientos fueron realizados según las directrices de la legislación alemana para el cuidado y uso de animales de laboratorio (oficialmente aprobado por el Consejo regional de Karlsruhe).

1. PMC aislamiento y cultivo de lavado Intraperitoneal

1	Hielo
2	jeringas de 10 mL
3	Agujas 27 G
4	Agujas de 20 G
5	Pernos y bloque de espuma de poliestireno
6	Tubos (tubos de centrífuga plástico de 50 mL)
7	etanol al 70%
8	Medio RPMI (Pre enfriado y mantenido en hielo)
9	Medio PMC: RPMI medio 20% FCS (suero de ternero Fetal) + 1% solución de penicilina estreptomicina (Pen-Strep)
10	Fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina - DPBS (sin Ca2 + y Mg2 +)
11	Frascos de cultivo (25 cm)
12	Soluciones de stock de factores de crecimiento (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13	Pipetas serológicas (10 mL)
14	Puntas de pipetas estériles (20 – 200 μL)
15	Hemocitómetro
16	Centrífuga de Banco
17	Tijeras y pinzas
18	CO2 cámara para ratones
19	Campana estéril abierto
20	Campana cerrada estéril
21	Incubadora de la célula (37 ° C y 5% CO2)
22	Pipetas de transferencia (20 – 200 μL)

Tabla 1: Materiales para el paso 1.

1. Aislamiento de PMC por lavado intraperitoneal
   1. Antes del aislamiento celular, preparar los materiales listados en la tabla 1.
   2. Utilizar 8 a 14 semanas de edad ratones machos para el aislamiento del PMC. Eutanasia a un ratón por inhalación de CO₂ y confirmar la muerte por pérdida de los reflejos. Rocíe el ratón con etanol al 70% y fijarla en un bloque de espuma con pernos (lado dorsal hacia abajo). Retirar la piel ventral del ratón usando las tijeras de borde romo. Evitar daños en la cavidad peritoneal.
      Nota: Utilizamos normalmente este protocolo para ratones con un fondo genético de la cepa C57BL/6N.
   3. Inyecte 7 mL de Medio RPMI helado y 5 ml de aire en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL, equipada con una aguja de 27 G. Empuje cuidadosamente la aguja en el peritoneo y no perforar cualquier órgano. Usar un spot en la región de la grasa Epididimal para reducir el riesgo de una perforación del órgano.
   4. Después de la inyección, agitar el ratón durante 1 min separar las células peritoneales en el Medio RPMI. No se mueva el ratón demasiado fuertemente, para evitar dañar los órganos internos y contaminar la cavidad peritoneal con la sangre.
   5. Reutilizar la jeringa de 10 mL por dotándolo con una nueva cánula 20 G. Cambio de los órganos internos a un lado por la inclinación del bloque de espuma y golpearlo suavemente en el Banco para facilitar la aspiración de la mediana desde el otro lado. Inserte una aguja de 20 G, bisel hacia arriba y aspirar el líquido del abdomen suavemente y lentamente (~0.5 mL/s) para evitar la obstrucción de los órganos internos. Recoger tanto líquido como sea posible (normalmente 5-6 mL).
   6. Retire la aguja de la jeringa y transferir la suspensión celular recogida en un tubo de recogida en el hielo. Descartar un tubo muestra si hay sangre visible contaminación.
   7. Centrifugar los tubos con la suspensión de células a ~ 300 x g durante 5 minutos. Bajo una campana estéril aspirar el sobrenadante. Para cada ratón, combinar las pelotillas de la muestra en 4 mL de frío (4 – 10 ° C) medio de PMC y la transferencia de la suspensión de células a un matraz de cultivo 25 cm² . Añadir los factores de crecimiento IL-3 y SCF a las concentraciones finales 10 ng/mL y 30 ng/mL, respectivamente. Coloque el frasco que contiene las células en una incubadora (37 ° C y 5% CO₂) e incube durante ~ 48 h hasta el siguiente procedimiento.
2. Cultura PMC
   1. Día 2 (~ 48 h después de aislamiento): cambio medio
      1. Para eliminar el sobrenadante y no adherente las células (eritrocitos y células muertas), aspirar el medio del frasco colocando una punta de pipeta Pasteur en el borde del frasco y sosteniendo el frasco casi horizontalmente. Añadir 4 mL de medio de PMC precalentado por ratón. Añadir los factores de crecimiento IL-3 (10 ng/mL) y SCF (30 ng/mL). Coloque el frasco que contiene las células en una incubadora (37 ° C y 5% CO₂).
   2. Día 9: Célula partiendo
      1. Transferir la suspensión de células del frasco de cultivo de células en un tubo de centrífuga de plástico de 50 mL. Lavar el frasco tres veces con solución salina de 10 mL previamente calentado (37 ° C) Dulbecco tampón fosfato (DPBS), que recoge la suspensión de células con las células separadas en el mismo 50 mL tubo de centrífuga de plástico. Cuenta la concentración de células por un hemocitómetro y calcular el número total de las células.
      2. Centrifugue la suspensión de células a ~ 300 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Recuperar el pellet en medio de PMC precalentado (37 ° C) para obtener la célula concentración 1 x 10⁶ células/mL. Transferir la suspensión de células a un nuevo frasco de cultura 25 cm² . Deseche el frasco antiguo con fibroblastos adherido a la parte inferior.
      3. Añadir los factores de crecimiento IL-3 (10 ng/mL) y SCF (30 ng/mL) y coloque el frasco que contiene las células en una incubadora (37 ° C y 5% CO₂).
   3. Días 12-15: medidas de la célula
      1. Si se planean cualquier experimentos con estimulación de los receptores FcɛRI, pretratar las células durante la noche con 300 ng/mL de IgE anti-DNP en medio de cultivo estándar. Proceda con el paso 2 o paso 3.

2. medición de la concentración de calcio libre intracelular fluorométrico en CMP

1. Antes de las mediciones, preparar los materiales listados en la tabla 2. Además, preparar una instalación de proyección de imagen que consiste en: microscopio de fluorescencia invertido; Objetivo: 40 X / 1.3 petróleo; Fura 2 filtro establecido; Cámara del CCD; Fuente de luz de excitación; Programa de adquisición de imágenes; Gravedad alimenta el sistema de aplicación de la solución.

1	PMC (12 – 15 días) 1 x 106 células/mL
2	Concanavalina A
3	Fura-2 AM
4	Solución al 20% pluronic F-127
5	Vidrios cubreobjetos redondo; ø 25 mm; No. 1
6	Solución madre de DNP-HSA (albúmina sérica de dinitrofenol-humanos)
7	Solución anti-DNP-anticuerpo (IgE)
8	Placa de fondo plano (12 cavidades)
9	Solución madre de compuesto 48/80
10	Cubrir bien la proyección de imagen cámaras
11	Hemocitómetro
12	Pipetas de transferencia (20 – 200 μL)

Tabla 2: Materiales para el paso 2.

2. Preparación de Fura-2
   1. Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro y ajustar la concentración de células 1 x 10⁶ células/ml. Dividir las colonias de CMP mediante pipeteo suave (3 a 5 veces) la suspensión de células con una pipeta de 1 mL.
   2. Preparar un Ca^{2 +}-que contienen HEPES tamponada con solución salina (Ca^{2 +}- HBSS) compuesto de 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES y 12 mM de glucosa. Ajustar el pH a 7.4 con 3 M NaOH.
   3. Preparar la concanavalina A portaobjetos recubiertos por pipeteo 1 gota de solución de concanavalina A (0,1 mg/mL de H₂O) en cada 25 mm redondo vidrio de cubierta bajo una campana de estéril. Deje las gotas en el cubreobjetos para al menos 1 minuto, luego retire la mayor parte de la solución con una pipeta y deje el cubreobjetos secar por 45 min Presione con cuidado el cubreobjetos de concanavalina A tratados sobre la goma de cámara de la proyección de imagen (véase Tabla de materiales) hasta que unen para obtener cámaras de imágenes de microscopía.
      Nota: Diapositivas de poli-l-lisina cubierto pueden utilizarse como alternativa.
   4. Disolver el Ca^{2 +} colorante fluorescente Fura-2 AM (1 mM) en dimetil sulfóxido (DMSO). Almacenar esta solución protegida de la luz.
   5. Diluir el Fura-2 solución AM en Ca^{2 +}- HBSS a una concentración final de 5 μm para preparar el "buffer de carga". Suplemento con 5 μl/mL de pluronic 20% F-127 en DMSO.
   6. Mezcla 500 μl de "buffer de carga" con 500 μl de la suspensión de células PMC. Pipetear la mezcla en la cámara de proyección de imagen e incubar las células durante 20 – 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   7. Establecer la gravedad alimentada el sistema de aplicación con diferentes soluciones según el protocolo de estimulación. Suplemento jeringa 1 con 40 mL de solución de Ca^{2 +}- HBSS, 2 con 40 mL de Ca^{2 +}- HBSS solución con 100 ng/mL DNP la jeringuilla, jeringuilla de 3 con 40 mL de Ca^{2 +}- HBSS solución que contiene 50 μg/mL compuesto 48/80, jeringa 4 con 40 mL de nominalmente Ca^{2 +}-libre-solución HBSS y jeringa de 5 con 40 mL de nominal Ca^{2 +}-libre-solución HBSS conteniendo 2 μm Thapsigargin.
   8. Preparar un objetivo de 40 X alta apertura aceite inmersión colocando una pequeña gota de aceite de inmersión en él.
   9. Montar el sistema de aplicación en la etapa del microscopio invertido. Poner la cámara de proyección de imagen con las células cargadas en el sistema de aplicación y fijarlo para evitar el movimiento durante la grabación. Encienda la luz transmitida y centrar las celdas.
   10. Enjuague las células tres veces con Ca^{2 +}- HBSS tampón utilizando el sistema de aplicación de flujo por gravedad.
   11. Incubar las células en Ca^{2 +}- HBSS por 5 min para Fura-2 esterificación de AM.
   12. Enjuague las celdas una vez más antes de comenzar la proyección de imagen eliminar cualquier potencialmente filtrado colorante fluorescente.
3. Proyección de imagen de la célula
   1. Iniciar el programa de adquisición de imágenes en el modo de adquisición fisiológica. Abra la ventana de configuración y ajustar el enfoque y el tiempo óptimo de adquisición (que debe ser el mismo para la excitación con 340 nm y 380 nm y por lo general oscila entre 50-150 ms).
      Nota: Reducir al mínimo la exposición del Fura-2 celular cargado a cualquier luz para evitar el fotoblanqueo de colorante.
   2. Un cuadro de referencia de la imagen y marcar las células como las regiones de interés (ROI). Marcar el último ROI en una zona donde no hay células presentan y definen como fondo.
   3. Completar la configuración e iniciar la medición con una tasa de adquisición s 5.
      Nota: Las células serán alternativamente iluminadas con la luz de excitación de 340 nm y 380 nm y la fluorescencia emitida (> 510 nm) se recogerán mediante la cámara CCD. Las imágenes de fluorescencia señales F340 nm y nm F380 así como la relación (F340 nm/F380 nm) se mostrará en tres ventanas. Las cartas del curso temporal de la intensidad de fluorescencia de ROIs individual significan valores se mostrará también continuamente.
   4. Agregar soluciones en el número de ciclo adecuado según el diseño del experimento:
      1. A elevación medida inducida por antígeno de [Ca^{2 +}], como se ilustra en la figura 2A, 2B, aplique la solución de la jeringa 2 después de ciclo de 20 y parada de grabación después de ciclo de 150.
      2. Para medir la elevación inducida por el compuesto 48/80 de [Ca^{2 +}]_i,como se ilustra en la figura 2C, aplicar la jeringa 3 después de ciclo de 20 y parada de grabación después de ciclo de 150.
      3. Para medir la elevación de la [Ca^{2 +}] evocado por SOCE, como se ilustra en la figura 2D, aplique la solución de la jeringa 4 después del ciclo 10, aplique la solución de la jeringa 5 ciclo 70, aplique la solución de la jeringa 4 después de ciclo de 120, Aplique la solución de la jeringa 1 después de ciclo de 150 y detener la grabación después del ciclo de 220.
   5. Después de terminar la medición, convertir los resultados en una tabla de relación con las intensidades medidas para longitudes de onda de excitación con y sin corrección de fondo, así como los valores de la relación con y sin corrección de fondo por cada retorno de la inversión y cada momento de medición. En el programa de adquisición, consecutivamente los botones: "cortador de inicio", "marcar todos", "todo pasa", "medidas de fisiología", "bien,"Ok". Guardar los archivos como tablas y montones de imágenes para análisis fuera de línea.

3. beta-hexosaminidase liberación medida en CMP

1	PMC (12 – 15 días) 1 x 106 células/mL
2	Solución anti-DNP-anticuerpo (IgE)
3	Solución madre de DNP-HSA
4	Solución madre de compuesto 48/80
5	Ionomycin
6	Placa de 96 pozos, fondo en forma de v
7	Placas de 96 pozos, fondo plano
8	Tubos de centrífuga plástico (15 mL)
9	Pipetas serológicas
10	Incubadora de la célula (37 ° C y 5% CO2)
11	Centrífuga de Banco
12	Lector de placas de microtitulación para mediciones de densidad óptica
13	Pipeta multicanal (20 – 200 μL)
14	Hemocitómetro

Tabla 3: Materiales para el paso 3.

1. Antes de las mediciones, preparar los materiales listados en la tabla 3.
   Nota: β-hexosaminidasa liberado de MCs tras su estimulación hidroliza el p-nitrofenil-acetilo-D-glucosamina (pNAG) en p-nitrofenol y n-acetil-D-glucosamina. La cantidad de β-hexosaminidasa en la muestra es proporcional a la cantidad de p-nitrofenol que se formará. En un ambiente de pH alto de "Solución de parada", p-nitrofenol existe como deprotonated completamente p-nitrophenolat y pueden ser detectado por su ligera absorbancia a 405 nm.
2. Preparar solución de Tyrode que contiene NaCl de 130 mM, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 mM de glucosa y BSA 0.1%. Ajustar el pH a 7.4 con 3 M NaOH.
3. Preparar la solución de lisis mediante la adición de un volumen de 1% de Tritón X-100 para solución de Tyrode.
4. Preparar la solución de parada compuesta de glicina de 200 mM y ajustar el pH a 10.7 con NaOH.
5. Preparar la solución pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-Nitrophenyl) disolviendo pNAG en 0,4 M ácido cítrico a una concentración final de 4 mM.
6. Calcular la cantidad de células necesarias para el análisis (realizar el análisis por duplicado). Uso 200.000 CMP por pozo. Utilizar 2 pozos como controles negativos (solución de Tyrode sin cualquier secretagogos como DNP o compuesto 48/80) y 2 pozos como controles positivos (solución de Tyrode con el μm 10 Ionomycin) para cada genotipo.
7. Transferir las células a un tubo de centrífuga de plástico de 15 mL, ajustar el volumen de 15 mL con solución de Tyrode y centrifugue a 200 x g 4 minutos quite el sobrenadante con una pipeta Pasteur y resuspender las células en solución de Tyrode a 2 x 10⁶ células / ml.
8. Transferir 100 μl de la suspensión de células por pocillo a una placa bien 96-well V-inferior. Añadir 25 μl de solución de control o el estímulo a cada pozo (según el esquema de pipeteo ilustrado en la figura 3A). Incube las células durante 45 min a 37 ° C y 5% CO₂.
9. Detener la reacción mediante la colocación de la placa de 96 pocillos en hielo durante 5 minutos. Luego, centrifugar la placa a 4 ° C por 4 min a x 120 g. Transferencia 120 μl del sobrenadante con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillos de fondo plano y coloque en hielo. Cuidadosamente evitar tocar los gránulos de la célula, pero aspirar completamente el sobrenadante.
10. Añadir 125 μl de tampón de lisis a los gránulos de la célula. Incubar los pellets de células durante 5 minutos a temperatura ambiente y resuspenderlos después de la incubación mediante pipeteo repetido (aproximadamente 5 veces).
11. Pipetear 25 μl de la solución de pNAG (4 mM) en los pozos requiere de una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano. Añada 25 μl de cada sobrenadante a la solución de pNAG preparados así como 25 μl de cada lisado de célula.
12. Incubar los lotes de la reacción por 1 h a 37 ° C. Después de la incubación, Pipetear 150 μL de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción.
13. Analizar la placa con un lector de microplacas con una configuración de doble longitud de onda a 405 nm con referencia 630 nm para fondo automático. En el programa de adquisición, marque la casilla "Referencia" y en el programa "Absorbancia" elemento menú, seleccione "630 nm" en la lista desplegable. Si la densidad óptica de las muestras es demasiado alta, preparar una dilución apropiada de la sonda antes de ahora.
14. Calcular el porcentaje de liberación de β-hexosaminidasa según la siguiente ecuación:
    
    donde [%] es el porcentaje de liberación específica de beta-hexosaminidase, [sobrenadante] es el corregir absorción del sobrenadante, y [lisado] es el corregir la absorción de la correspondiente célula lisada.

Resultados

PMCs se aislaron 3 ratones de tipo salvaje (C57BL/6N) por lavado intraperitoneal y más cultivadas en Medio RPMI suplementado con 20% de FCS y 1% Pen-Strep en presencia de factores de crecimiento (IL-3 a 10 ng/mL) y SCF a 30 ng/mL bajo estéril humedecido las condiciones en 37 ° C y 5% CO₂. El medio fue cambiado durante los días 2 y 9 después el aislamiento de la célula. La morfología de la célula se analizó mediante la transmisión de luz de proyección de imagen de DIC...

Discusión

Modelos MC pueden utilizarse con éxito para el estudio de MC degranulación, quimiotaxis, adherencia, así como dilucidar vías intracelulares de transducción de señalización implicadas en la activación de MC. Algunos investigadores uso MCs los modelos humanos, como las líneas inmortalizadas (LAD2 y HMC1) o MCs humanas derivados de cordón de células progenitoras (CD133 +) y las células progenitoras de sangre periférica (CD34 +) de la sangre. Otros prefieren roedores modelos MC, como inmortalizados (leucemia bas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R