Fabricación de la matriz extracelular de la lengua y reconstitución de células escamosas de lengua In Vitro

Resumen

Aquí se muestra un método para la preparación de la matriz extracelular de la lengua (TEM) con descelularización eficiente. La temperatura puede utilizarse como andamios funcionales para la reconstrucción de un modelo de carcinoma de células escamosas (TSCC) lengua bajo condiciones de cultivo estático o agitada.

Resumen

Con el fin de construir un modelo eficaz y realista para lengua squamous cell carcinoma (TSCC) en vitro, los métodos fueron creados para producir decellularized lengua matriz extracelular (TEM) que proporciona funciones andamios para la construcción de TSCC. TEM proporciona un nicho en vitro para el crecimiento celular, diferenciación y migración celular. Las microestructuras de nativo matriz extracelular (ECM) y composiciones bioquímicas retenidos en la matriz de decellularized proporcionan nichos de tejidos específicos para el anclaje de las células. La fabricación de TEM puede ser realizada por digestión de desoxirribonucleasa (DNasa) acompañada de una seria de tratamiento orgánico o inorgánico. Este protocolo es fácil de operar y asegura alta eficiencia para la descelularización. El TEM demostró cytocompatibility favorable para las células TSCC bajo condiciones de cultivo estático o agitada, que permite la construcción del modelo TSCC. Un biorreactor hecho a sí mismo también fue utilizado para la persistente condición agitada para el cultivo celular. TSCC reconstruido usando TEM demostraron las características y propiedades que se asemejan a la histopatología clínica de TSCC, sugiriendo el potencial en investigación TSCC.

Introducción

La lengua tiene varias funciones importantes, tales como deglución, articulación y degustación. Así, el deterioro de la función de la lengua tiene gran impacto en la calidad de vida de pacientes¹. La neoplasia más frecuente en la cavidad bucal es lengüeta carcinoma de célula squamous (TSCC), que generalmente ocurre en personas que beben alcohol o fuman tabaco².

En los últimos años, se ha logrado poco progreso en la investigación fundamental de TSCC. La falta de investigación eficiente en vitro modelos restos para ser uno de los mayores problemas. Por lo tanto, la matriz extracelular (ECM) resulta para ser una solución potencial. Desde ECM es una estructura de red compleja compuesta por componentes de la matriz altamente organizados, materiales del andamio con un ECM-como la estructura y composición sería competentes para la investigación del cáncer. ECM decellularized perfectamente puede proporcionar el nicho de las células desde el mismo origen en vitro, que resulta para ser la más importante ventaja de ECM.

ECM puede conservarse con componentes celulares de los tejidos a través de la descelularización mediante detergentes y enzimas. Varios componentes de la ECM, incluyendo colágeno, fibronectina y laminina en la matriz de decellularized proporcionan un microambiente natural-tejido-como de células cultivadas, promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células³. Además, la inmunogenicidad para el trasplante se puede reducir a un mínimo con la ausencia de componentes celulares en ECM.

Hasta ahora, métodos de fabricación para ECM decellularized se han ensayado en diferentes tejidos y órganos, como corazón^4,5,6,7, hígado^{8,9,10 ,11}, pulmón^{12,13,14,15,16,17}y^18,de riñón^{19 , 20}. sin embargo, se ha encontrado ninguna investigación relevante en trabajos similares en la lengua al mejor de nuestro conocimiento.

En este estudio, matriz extracelular de la lengua decellularized (TEM) se fabricó eficientemente y barato por una serie de tratamiento físico, químico y enzimático. Entonces la temperatura solía recapitular TSCC en vitro, mostrando una simulación adecuada para el desarrollo y comportamiento TSCC. TEM tiene buena biocompatibilidad, así como la capacidad de guiar a las células hacia el nicho de tejidos específicos, que indica que TEM puede tener gran potencial en TSCC investigación³. El protocolo que se muestra a continuación proporciona una opción para investigadores estudiando en patogenesia o terapias clínicas de TSCC.

Protocolo

Animal todo el trabajo fue realizado de acuerdo con la ley de bienestar animal, las pautas y aprobado por institucional Animal cuidado y uso, Universidad de Yat-sensor del sol.

1. preparación de TEM

1. Ejecutar ratones por dislocación cervical y retire las lenguas utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas estériles.
2. Sumerja las lenguas en etanol al 75% durante 3 minutos, luego poner cada lengua en 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL de fosfato estéril de 10 mM de solución amortiguadora (SSAF).
   Nota: La concentración de PBS en los siguientes pasos es igual a la concentración en este paso.
3. Lisis de la célula por hielo-deshielo: congelar las lenguas en tubos de EP a-80 ° C durante 1 h y luego descongelar las lenguas a temperatura ambiente durante 45 minutos por 3 ciclos.
4. Carga de cada lengua sobre un pedazo de sutura quirúrgica, utilizando una aguja quirúrgica y envuelva el extremo de la sutura con un pequeño trozo de papel de aluminio estéril. Realizar la operación en un plato de cultura 3,5 cm o 6 cm que contiene 75% de etanol en condiciones estériles.
   Nota: La longitud adecuada de cada pieza de sutura quirúrgica es de unos 20 cm y el tamaño adecuado de cada pieza de papel de estaño es de 0,3 cm² (1 cm x 0,3 cm). La lengua debe colocarse cerca del papel de estaño.
5. Enjuague cada lengua con 3 mL de PBS estéril en una placa de cultivo 3,5 cm o 6 cm para 30 s. realizar esta operación en condiciones estériles.
6. Lavar la lengua con agua ultrapura: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de agua ultrapura estéril a una concentración final de 90 μg/mL. Poner las lengüetas al frasco que contiene una barra de agitación. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
   Nota: Hasta 5 lenguas se pueden poner en la misma botella en la consideración de hermanamiento de la sutura. El estaño está en el extremo de la sutura en la botella para evitar que la lengua caiga. Las lenguas se deben colocar 2 cm de altura desde el fondo de la botella mediante el ajuste de la longitud de la sutura queda dentro de la botella. Esta nota está también para pasos 1.8, 1.10, 1.12 y 1.16.
7. Puso la botella en un agitador magnético durante 12 h.
8. Lavar la lengua con NaCl: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de estéril 1 M de NaCl a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
9. Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
10. Célula de la lisis por Triton X-100: Añadir ampicilin a una concentración final de 90 μg/mL en una botella de boca ancha 250 ml estéril 2% Tritón X-100 en PBS. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
11. Puso la botella en un agitador magnético durante 48 h.
12. Lavar la lengua con CaCl₂/MgCl₂: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de estéril 5 mM CaCl₂/MgCl₂ a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
13. Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
14. Digestión de la ADNsa: Añadir 1 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) a cada tubo de EP. Agregar ADNasa en HBSS respectivamente a una concentración final de 300 μm. Mueva cada lengua en cada tubo de EP, con parte de la sutura del tubo exterior. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
    Nota: Asegúrese de que la parte de la sutura que permanece dentro de las botellas en los pasos anteriores también permanece dentro del tubo de la EP en este paso y asegúrese de que la parte de la sutura que queda fuera de las botellas en los pasos anteriores sigue siendo también tubo exterior de la EP en este paso.
15. Incubar las lenguas en el EP de los tubos a 37 ° C durante 24 h.
16. Lavar la lengua con PBS: Añadir ampicilin en un frasco de boca ancha con 250 mL de PBS estéril a una concentración final de 90 μg/mL. Mover las lengüetas y la barra de agitación en la botella. Apriete el tapón de la botella con parte de la sutura queda fuera de la botella. Esta operación se realiza en condiciones estériles.
17. Puso la botella en un agitador magnético durante 24 h.
18. Guarde el TEM preparado en PBS estéril a 4 º C hasta su uso.

2. tres dimensiones (3D) reconstitución de TSCC

1. Modelismo estático de TSCC
   1. Semillas 1.0 x 10⁶ TSCC células (Cal27) en una placa de cultivo de 3,5 cm. Añadir 3 mL de Dulbecco modificado Eagle medio/F12 (DF12) con 10% suero bovino fetal (FBS), ampicilin 90 μg/mL y 90 kanamicina μg/mL.
   2. La cultura las células Cal27 a 37 ° C durante 2 a 3 días. Asegúrese de que las células cubren al menos el 60% área de la parte inferior del plato.
   3. Cargar TEM en la monocapa Cal27 en la placa de cultivo.
   4. Poner el plato en un incubador de CO₂ a 37 ° C durante 28 días.
   5. Actualizar el medio de cultivo cada día durante el proceso de cultivo celular. La concentración de CO₂ en la incubadora es 5%.
2. Construcción de modelo TSCC agitada
   1. Preparación de un minibioreactor revuelto hecho a sí mismo
      1. Saque el émbolo de una jeringa de 10 mL.
      2. Cavar un agujero (diámetro de 1 cm) cerca de la terminal inferior de la barra y carga una barra de agitación en el agujero.
      3. Cavar un agujero (diámetro de 0,5 cm) en el centro de la tapa de una botella de plástico boca ancha y poner la barra de pistón a través de la tapa.
      4. Cortar la mitad de un tubo de centrífuga de 50 mL y soldar en el lado exterior de la tapa de la botella.
      5. Colocar anzuelos a la barra envolviendo la varilla con líneas de pesca que se ataban a los anzuelos.
         Nota: Hasta 4 anzuelos pueden sujetarse a una varilla.
      6. Autoclave el complejo hecho a sí mismo antes de su uso.
         Nota: No autoclave la botella plástica de boca ancha. Utilice una nueva botella de plástico estéril de boca ancha mientras que las células de cultivo.
3. Cultura de célula dinámica
   1. Semillas 1.0 x 10⁶ Cal27 células individuales en el self-made minibioreactor. Añadir 150 mL de medio de DF12 que contiene 10% FBS, 90 ampicilin μg/mL y 90 μg/mL de kanamicina.
   2. Cargar TEM en la minibioreactor utilizando anzuelos atados a la barra.
   3. Apriete el tapón de la botella y poner la minibioreactor en un agitador magnético. Activar minibioreactor a 200 rpm en un incubador de CO₂ a 37 ° C durante 7 a 14 días.
      Nota: La concentración de CO₂ en la incubadora de CO₂ es 5%.

Resultados

Este protocolo para la preparación de TEM resulta para ser eficiente y apropiado. El TEM demostró descelularización perfecto en comparación con los tejidos de la lengua materna. La eficacia de la descelularización fue confirmada por hematoxilina-eosina (HE) tinción (figura 1A-B). LO resultados de tinción desaparición completa reveladora de tinción nuclear en TEM (figura 1B). Por otra par...

Discusión

Un protocolo bien establecido para la fabricación de ECM decellularized debe conservar la composición nativa de ECM al eliminar componentes celulares en los tejidos casi totalmente²¹. A pesar de los protocolos actualmente divulgado de la descelularización que requieren de la perfusión a través de la vasculatura para quitar materiales celulares por transporte convectivo, agitación mecánica fue adoptada aquí, conocido como un método sencillo y barato tradicional²²

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805