En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Resumen

Aquí, presentamos un método fácil de usar y versátil para realizar en proyección de imagen de procesos de desarrollo en general y músculo-Tendinosas de la morfogénesis en particular en la vida de pupas de Drosophila .

Resumen

Los músculos junto con los tendones y el esqueleto permiten animales incluyendo los seres humanos para mover partes de su cuerpo. Morfogénesis del músculo es altamente conservadas de los animales a los seres humanos. Por lo tanto, el potente sistema de modelo de Drosophila puede utilizarse para estudiar los conceptos de desarrollo músculo-tendón que puede aplicarse también a la biología humana del músculo. Aquí, describimos en detalle cómo morfogénesis del sistema músculo-tendón adulto pueden ser fácilmente reflejada en la vida, desarrollo de Drosophila pupa. Por lo tanto, el método permite investigar proteínas, células y tejidos en su entorno fisiológico. Además de un protocolo paso a paso con consejos útiles, nos proporcionan una visión completa de las proteínas del marcador fluorescente etiquetado que son adecuados para el estudio del sistema músculo-tendón. Para resaltar las aplicaciones versátiles del Protocolo, nos Mostrar ejemplo películas que van desde la visualización de eventos morfogenéticos a largo plazo – que se producen en la escala de tiempo de horas y días – a la visualización de los procesos dinámicos a corto plazo como las fasciculaciones musculares que ocurren en la escala de tiempo de segundos. Tomados en conjunto, este protocolo debe permitir al lector a diseñar y realizar experimentos de imágenes en vivo para la investigación de morfogénesis del músculo-tendón en el organismo intacto.

Introducción

El aparato músculo-tendón permite a los animales incluyendo los seres humanos para mover partes de su cuerpo. Los bloques de edificio moleculares del sistema músculo-tendón están muy conservados. Por lo tanto, conceptos de desarrollo músculo-tendón relevante para la biología de músculo humano, por ejemplo morfogénesis del músculo, músculo-tendón accesorio y autoorganización de la miofibrilla, se pueden estudiar utilizando Drosophila melanogaster como un fácil acceso modelo de sistema. El sistema pupal de Drosophila tiene varias ventajas experimentales. En primer lugar, en el estadio pupal, cuando se forman los músculos adultos – el organismo es sésil y por lo tanto fácil de la imagen en un microscopio en un período de horas o incluso días. En segundo lugar, muchos forma músculos cerca debajo de la superficie de la pupa para que puede ser reflejadas en el organismo intacto, parcialmente translúcido. En tercer lugar, los músculos se pueden investigar en su entorno natural, donde se conectan al exoesqueleto formando a través de las células del tendón y tensión del tejido se acumula. Esto no es posible en sistemas de cultivo de células de músculo. Y por último, una gran cantidad de herramientas genéticas en Drosophila. Entre ellos están muchos marcadores de fluorescencia de etiquetado que permiten etiquetar de tipos celulares específicos o estructuras subcelulares para la proyección de imagen en vivo.

La tabla 1 resume los más importantes marcadores utilizados para el estudio de morfogénesis del músculo-tendinosos. Incluye marcadores overexpressed utilizando el sistema GAL4-UAS¹ y endógeno etiquetados proteína marcadores^2,3,4. La ventaja del sistema GAL4-UAS es que los marcadores generalmente se expresan en altos niveles, resultando en una señal fuerte que fácilmente puede ser reflejada en todo montaje pupas. Además, especificidad de tejido puede lograrse eligiendo cuidadosamente GAL4 controladores. La ventaja de proteínas de fusión expresada bajo control endógeno es que la dinámica de las proteínas respectivas puede ser estudiado en vivo, mientras que también pueden ser utilizados como marcadores para diferentes tipos de células o estructuras subcelulares específicas, por ejemplo, ΒPS-integrina-GFP para sitios de fijación del músculo. Juntos, estos marcadores ofrecen gran flexibilidad en diseño y selección de problemas de investigación que puede ser resuelto ahora y en el futuro.

Etiquetado estructura

Marcador

Expresión y localización

Clase

Número de stock

Comentario

Ref.

Músculo

Mef2-GAL4

mioblastos todas y todos los músculos en todas las etapas

Línea de GAL4

BL 27390

5

1151-GAL4

músculo adulto precursores y primeros miotubos hasta ≈24 h APF

Línea de GAL4, trampa de enhancer

-

6

Act79B-GAL4

saltar sobre la diferenciación del músculo

Línea de GAL4

-

7

Act88F-GAL4

músculos de vuelo indirectos a partir ≈14 h APF

Línea de GAL4

-

7

Act88F- Cameleon 3.1

músculos de vuelo indirectos a partir ≈14 h APF

Potenciador de Act88F promotor de conducción Cameleon 3.1

-

Indicador de CA2 +

8

Act88F-GFP

músculos de vuelo indirectos a partir ≈14 h APF

GFP-fusión (mosca de TransgeneOme de línea)

fTRG78 y fTRG10028

4

Le- nls-GFP

precursores del músculo adulto, nucleares, hasta ≈24 h APF en músculos de vuelo indirectos

Enhancer/promotor con la reportera de nls-GFP

-

fragmento de potenciador de 1,5 kb

9

MHC-Tau-GFP

microtúbulos en plantillas de DLM y en diferenciar los músculos

Enhancer/promotor con la reportera de Tau-GFP

BL 53739

10

ΒTub60D-GFP

microtúbulos en miotubos (por ejemplo, en los músculos de vuelo indirectos de ≈14 h AFP, disminuyendo fuertemente después de ≈48 h APF)

GFP-fusión (mosca de TransgeneOme de línea)

fTRG958

4

MHC-GFP (weeP26)

sarcómeros (filamento grueso) en todos los músculos del cuerpo (por ejemplo, en los músculos de vuelo indirectos a partir de ≈30 h APF)

GFP-trampa

-

uso heterozigótico, etiquetas de un subconjunto de la isoforma

11

SLS-GFP

sarcómeros (disco de Z) en todos los músculos del cuerpo (por ejemplo, en los músculos de vuelo indirectos a partir de ≈30 h APF)

GFP-trampa (línea atrapamoscas)

-

G53, uso heterozigótica

2

Zasp66-GFP

Z-disco en todos los músculos del cuerpo

GFP-trampa (línea atrapamoscas)

BL 6824

ZCL0663

2 , 12

Zasp52-GFP

Z-disco en todos los músculos del cuerpo

GFP-trampa (línea atrapamoscas)

BL 6838

G00189

2 , 12

HTS-GFP

atascamiento de la actinia; expresa en epitelio, mioblastos y miotubos

GFP-fusión (mosca de TransgeneOme de línea)

fTRG585

4

Dlg1-GFP

las ensambladuras de la célula epitelial, mioblastos y las membranas de los músculos en todas las etapas

GFP-fusión (mosca de TransgeneOme de línea)

fTRG502

4

Sitio de fijación del músculo

ΒPS-integrina-GFP

sitios de fijación de músculo (por ejemplo, partida ≈18 h AFP en los músculos de vuelo indirectos)

GFP-knock-in

-

13

Talin-GFP y - mCherry

sitios de fijación de músculo (por ejemplo, partida ≈18 h AFP en los músculos de vuelo indirectos)

GFP-trampa (línea MiMIC)

-

3

Talin-GFP

sitios de fijación de músculo (por ejemplo, partida ≈18 h AFP en los músculos de vuelo indirectos)

GFP-fusión (mosca de TransgeneOme de línea)

fTRG587

4

Calaña-GFP

sitios de fijación de músculo (por ejemplo, partida ≈18 h AFP en los músculos de vuelo indirectos)

GFP-trampa (línea atrapamoscas)

Kyoto 110951 (ZCL3111)

ZCL3111, ZCL3192

2

Vinc-GFP y RFP-

sitios de fijación de músculo (por ejemplo, partida ≈18 h AFP en los músculos de vuelo indirectos)

GFP-fusión (transgen)

-

13

Tendón de

Sr-GAL4

células de tendón del tórax, a lo largo de la etapa pupal

Línea de GAL4, trampa de enhancer

BL 26663

homocigoto letal

14

Músculo y el tendón

UPD-GAL4

los músculos y los epitelios, inicio temprano

Línea de GAL4

BL 66682

kirre-rP298, marcador de célula fundadora

15

UAS-Reporteros

UAS- GFP-Gma

atascamiento de la actinia

Línea UAS

BL 31776

dominio de unión a actina de moesina fusionada a GFP

16

UAS- mCherry-Gma

atascamiento de la actinia

Línea UAS

-

GMA fusionado a mCherry

17

UAS- Lifeact-GFP

atascamiento de la actinia

Línea UAS

BL 35544

18

UAS- Lifeact-Ruby

atascamiento de la actinia

Línea UAS

BL 35545

18

UAS-CD8-GFP

Unión de la membrana

Línea UAS

varias acciones, por ejemplo: BL 32184

19

UAS-CD8-mCherry

Unión de la membrana

Línea UAS

BL 27391 y 27392

20

UAS-Palma-mCherry

Unión de la membrana a través de la palmitoilación

Línea UAS

BL 34514

UAS- brainbow

21

Tabla 1: Etiqueta fluorescente marcadores de proteínas adecuados para el estudio de morfogénesis del músculo-tendón en vivo.

Aquí, describimos en detalle cómo la proyección de imagen de la morfogénesis del músculo-tendón en pupas de vida puede realizarse fácilmente y con éxito (figura 1). Alternativamente, se pueden fijar pupas, disecado y immunostained, que permite utilizar anticuerpos también etiquetar las proteínas para los que no viven los marcadores están disponibles²². En este caso, la calidad de imagen es generalmente más alta porque no hay ningún movimiento y la estructura de interés puede ser colocada en proximidad cercana al cubreobjetos. Sin embargo, la disección y fijación pueden conducir a daño y molecular o dinámica del tejido, por ejemplo, músculos, sólo puede estudiarse en el organismo vivo.

Protocolo

1. etapa pupas

1. Configurar una cruz con hembras vírgenes de 20-40 y 20 por la botella de comida mosca (figura 1A). Alternativamente, se utilizarán las reservas, la vuelta a cada acción en nuevas botellas. Para obtener suficiente pupas, considere establecer dos botellas por genotipo.
2. Incubar las botellas a 25 º C (ó 27 ° C según el diseño experimental) durante cinco a seis días (figura 1B).
   Nota: Mantenga los bancos las moscas cada dos o tres días para evitar el hacinamiento y garantizar un suministro continuo de pupas.
3. Use un cepillo mojado para recoger prepupas blanco de las paredes de las botellas y transferirlas a los portaobjetos de vidrio (figura 1). Tiempo la puesta en escena que las pupas de alcanzan la edad cuando se inicia en la proyección de imagen en el microscopio.
   Nota: Estas prepupas parecen más pupas en términos de su forma, pero son todavía blancos como larvas. El inicio de la etapa prepupal se define como 0 h después de la formación del pupario (0 h APF).
4. Quitar grupos de alimentos mosca se adhiera a las pupas con un cepillo mojado y orientar el lado ventral de las pupas hacia el portaobjetos de cristal con un estereomicroscopio (figura 1). Deseche las pupas que se sigue moviendo (demasiado joven) o que han comenzado a dar vuelta a marrón (demasiado viejo). Esto asegura que todos pupas tienen la misma edad (0 - 1 h APF).
5. Etiquete los portaobjetos con el genotipo, la fecha y hora de recogida. Transfiera los portaobjetos de vidrio para un plato de petri y añadir un pañuelo húmedo para evitar que las pupas de la desecación (Figura 1E).
6. Almacenar las pupas en una incubadora a 25 ° C y 27 ° C hasta llegar a la edad deseada. Continuar con los siguientes pasos 1 h antes de la proyección de imagen, para que las pupas tienen la edad cuando se inicia en la proyección de imagen (paso 3), por ejemplo a las 13 h la APF para la película se muestra en la figura 2A-D.
   Nota: Lo más temprano posible factible tiempo punto de partida es después de la eversión de la cabeza de la pupa ocurre en 8-10 h APF a 27 ° C.

2. prepare pupas para la proyección de imagen

1. Asegúrese de que las pupas ahora ponerte el portaobjetos de cristal igual que naturalmente se peguen a las paredes de las botellas debido a restos de alimentos mosca. Ningún pegamento adicional es necesario. Si las pupas no se pegan bien debido a la alta humedad, abre la caja Petri para unos minutos a dejar que se seque. O bien, transferirlos a cinta de doble cara en un portaobjetos de vidrio, pero por lo general, esto no es necesario.
2. Ventana abierta en la envoltura pupal para proyección de imagen de los músculos de vuelo indirectos (Figura 1F; Sáltese a la sección 2.3 para la proyección de imagen de los músculos abdominales).
   1. Oriente las pupas que se pega a la diapositiva de cristal con la orientación anterior del investigador bajo un estereomicroscopio. Ajuste el zoom a 2 X.
   2. Utilizando uno de los extremos de la biología grado #5 pinzas, cuidadosamente haga un orificio en la envoltura pupal dorsal del ala donde termina el abdomen y el tórax comienza.
   3. Para cortar abierto la envoltura pupal, suavemente mover las pinzas en el extremo anterior del tórax a lo largo del ala pero no dañar el tejido de ala vulnerables.
      Nota: Si el líquido se filtra desde la pupa, está dañado; desecharlo y empezar de nuevo con una pupa diferentes.
   4. Levante la sección de la envoltura pupal sobre el tórax con el fórceps y luego cortar esta sección con tijeras finas y afiladas en el lado opuesto de la línea media dorsal.
3. Ventana abierta en envoltura pupal para proyección de imagen de los músculos abdominales (Figura 1)
   1. Oriente las pupas que se pega a la diapositiva de cristal con la cara anterior hacia el investigador bajo un estereomicroscopio. Ajuste el zoom a 2 X.
   2. Utilizando uno de los extremos de la biología grado #5 pinzas, cuidadosamente haga un orificio en la envoltura pupal dorsal del ala donde termina el tórax y el abdomen comienza.
   3. Para cortar abierto la envoltura pupal, mueva suavemente el fórceps hacia el extremo posterior del abdomen.
      Nota: Si el líquido se filtra desde la pupa, está dañado; desecharlo y empezar de nuevo con una pupa diferentes.
   4. Levante la sección de la envoltura pupal sobre el abdomen con el fórceps y luego cortar esta sección con tijeras finas y afiladas en el lado opuesto de la línea media dorsal.
4. Montaje de pupas (Figura 1 H)
   1. Use un cepillo mojado para transferir hasta cinco pupas a una diapositiva de plástico con una ranura (a la medida, reutilizables, vea la discusión y lista de materiales). Añadir uno o dos cubreobjetos de espaciador a cada lado dependiendo de la profundidad de la ranura y el grueso de las pupas. Poner una pequeña gota de agua debajo de cada espaciador cubreobjetos para pegarse a la diapositiva y dejar algo de espacio entre el surco y el cubreobjetos de espaciador en cada lado.
      Nota: El cubreobjetos espaciador pueden también estar unida a la diapositiva con pegamento, por adelantado.
   2. Oriente las pupas de tal manera que la abertura de la envoltura pupal enfrenta hacia arriba con el cepillo. Asegurar la colocación cuidadosa de las pupas en el ángulo correcto para la buena calidad de imagen. Optimizar el ángulo de cada tejido y cada momento del desarrollo.
      Nota: Una pequeña cantidad de agua en el surco hace colocación de las pupas más fácil. Drenar el exceso de agua con el cepillo después para evitar el ahogamiento.
   3. Sostenga un cubreobjetos (18 x 18 mm) por encima de las pupas sin tocarlas. Coloque pequeñas gotitas (sobre 0,5 μl) de solución de glicerol al 50% sobre cada envoltura pupal de apertura sobre el cubreobjetos con una pipeta de 20 μl.
      Nota: Este procedimiento asegura que las gotas tienen el mismo espacio como a las pupas.
   4. Voltee el cubreobjetos y colocarlo encima de las pupas a mano o con unas pinzas (patrón #5) descansando a un lado del cubreobjetos sobre el cubreobjetos del espaciador al lado de las pupas. A continuación, soltar suavemente el cubreobjetos sobre las pupas. Asegurar que las aberturas caso pupas están debidamente cubiertas con 50% de glicerol para la buena calidad de imagen y para evitar que las pupas se seque.
   5. Doble más uno de los extremos de un pedazo de cinta adhesiva y agarrarlo con pinzas (patrón #5) en ello. Coloque con cuidado la cinta que cubre un borde del cubreobjetos superior, el espaciador coverslip(s) y la corredera de plástico en un lado. No presione la cinta, sin embargo. En primer lugar, la vuelta el carro y repita para el otro lado.
   6. Utilice ambos dedos índice para presionar la cinta simultáneamente en ambos lados. Este procedimiento asegura que las pupas no son desplazadas.
   7. Compruebe si las pupas son bien en contacto con el cubreobjetos. Para una calidad de imagen óptima las pupas deben ser suavemente apretadas debajo del cubreobjetos. Ajustar el número de cubreobjetos espaciador si es necesario.
   8. Etiqueta de la diapositiva por escrito en la cinta adhesiva.

3. proyección de imagen de pupas en vivo

1. El método de montaje permite la proyección de imagen de las pupas en microscopios invertidos (figura 1I) y en los microscopios verticales (Figura 1J). Especialmente conveniente para la proyección de imagen de vivo son exploración microscopios confocales y dos fotones microscopios microscopios confocal de disco de spinning independientemente de si son invertidos o vertical. Para películas a largo plazo, utilizar una etapa de control de temperatura si está disponible.
2. Usando el ocular y una lámpara Ultravioleta o transmisión de luz, busque un enfoque dentro de la pupa y pupa.
3. Usar la cámara, encontrar la estructura deseada y ajustar el nivel de zoom.
4. Para películas a largo plazo, definir una pila z que abarca la estructura de interés bien (por ejemplo, los músculos de vuelo indirectos, sus sitios de fijación, las células del tendón o una combinación de lo anterior) y elija un intervalo de tiempo. Considere hacer un promedio para una mejor calidad de imagen. Para películas de alta velocidad, a corto plazo, elegir un solo plano z para alcanzar una alta velocidad.
5. Ajustar la potencia del láser para dar la mejor señal posible pero poca saturación. Sin embargo, energía del laser demasiado alta puede dañar la pupa con el tiempo.
6. Iniciar la proyección de imagen y de vez en cuando volver a ver la película y vuelva a ajustar la colocación del z-pila si es necesario.

Figura 1: flujo de trabajo para la proyección de imagen viva de la morfogénesis del músculo-tendón en Drosophila pupa. Ver protocolo para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Varios tejidos pueden ser reflejada en vivo en el desarrollo de pupas de mosca, lo que un sistema modelo ideal para el estudio de la morfogénesis de órganos adultos. Entre ellos están los músculos de vuelo indirectos, el epitelio de tórax incluyendo las células del tendón, el epitelio del ala, los músculos abdominales y el corazón^{22,23,24,25,26 , 27}. aquí, nos centramos en la proyección de imagen viva de la morfogénesis del músculo y el tendón. Para una descripción detallada de los músculos de vuelo indirectos y morfogénesis del músculo abdominal y métodos adicionales para estudiar biología muscular en Drosophila, remitimos al lector a Weitkunat y Schnorrer 2014²².

Vive imágenes de los músculos de vuelo indirectos

Para estudiar el desarrollo a largo plazo de los músculos de vuelo indirectos consisten en los músculos dorsolongitudinal (DLMs) y la musculatura dorsoventral (DVMs), Moesin globular dominio de unión a actina etiquetado con GFP (UAS -GFP-Gma) se expresó en todos los los músculos con el factor 2 (Mef2) del reforzador de miocito-GAL4 controlador (figura 2A-D, Película S1). Antes de la proyección de imagen, se abre una ventana en la envoltura pupal sobre el tórax como se muestra en la Figura 1F. En un microscopio de dos fotones, pilas de z fueron adquiridas cada 20 min de 21 h a partir de ≈11 h después de la formación del pupario (11 h APF). En este período de tiempo, el DLMs (verde superposiciones en la figura 2A'-D') primero iniciar la adhesión a las células del tendón (figura 2A) y luego dividir mientras que los accesorios del músculo maduran (figura 2B). A continuación, los miotubos acortan (figura 2) hasta que finalmente alcanzan la etapa de máximo compactada en 30 h APF (Figura 2D). Tomados en conjunto, esta película destaca los cambios dramáticos en la morfología del músculo que ocurren en la escala de tiempo de horas.

Figura 2: proyección de imagen de la morfogénesis del músculo y tendón del vuelo indirecto en vivo. (A-D) Tiempo puntos de una película de dos fotones (película S1) con Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma como marcador para la actinia en los músculos de vuelo indirectos consisten en los músculos dorsolongitudinal (DLMs, resaltados en verde en el A'-D') y el (musculatura dorsoventral DVMs, resaltados en azul en el A'-D'). Barras de escala son 100 μm. (E-H) momentos de una película de dos fotones (película S2) con UPD-GAL4UAS-CD8-GFP como marcador para los músculos de vuelo indirectos y el epitelio de tórax incluyendo las células del tendón. Paneles E'-H' muestran una superposición con un modelo del sistema músculo-tendón en cada momento, destacando las extensiones largo celulares formada por el epitelio del tendón (magenta) en contacto con los músculos (verde). Barras de escala son 100 μm (aproximadamente del tamaño de las estructuras de la imagen). (- L) Puntos de tiempo de una bicolor, giro confocal película disco (película S3) centrándose en iniciación de músculo-tendón accesorio. Las células del tendón están marcadas con sr-GAL4UAS-Palma-mCherry (magenta) y el dorsolongitudinal indirecta de vuelo músculos con Mhc -Tau-GFP (green). Barras de escala son 10 μm. tiempo es indicado como HH: mm después de la formación del pupario (APF). Tenga en cuenta que no todas las películas fueron adquiridas en una etapa de control de temperatura, por lo tanto, la sincronización del desarrollo puede divergir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para el estudio de morfogénesis del tendón y músculo a la vez, unida a la membrana GFP (UAS -CD8-GFP) se expresó con Dumbfounded (Duf)-GAL4 como conductor, que se expresa en las células de los tendones y los músculos de vuelo indirectos (Figura 2E -H, S2 de la película). Una pila de z fue tomada en un microscopio de dos fotones cada 20 minutos a partir de las 16 h APF para 20 h. Mientras que el compacto de los miotubos (superposición de verde en la Figura 2E'-H'), el tendón las células extensiones largo celular forma alargado con el tiempo (superposición de magenta en la Figura 2E'-H'). Tomados en conjunto, esta película pone de relieve la estrecha interacción entre el tendón y el músculo las células en vivo.

Para investigar la interacción músculo-tendón en más detalle, se realizó la proyección de imagen de dos colores, alta magnificación. Pupas con la cadena de miosina pesada (Mhc)-Tau-GFP en el DLMs y UAS -mCherry palmitoylated (UAS -Palma-mCherry) conducido por el raya (sr)-GAL4 en los tendones eran imágenes cada 5 min a partir de las 12 h APF de 4,5 h en un disco de spinning microscopio confocal (figura 2I-L, película S3). A las 12 h de la APF, los miotubos emigran hacia sus células de destino del tendón mientras formando filopodia largo en los extremos (figura 2I). Posteriormente, el músculo y el tendón tejidos entre (figura 2J, K) para formar un accesorio estable. A medida que madura el accesorio, menos forma de filopodia y la interfaz del músculo-tendón alisa (figura 2 L). Así, la proyección de imagen de dos colores, alta magnificación puede utilizarse para revelar la dinámica celular en detalle en el organismo vivo.

Vive imágenes de los músculos abdominales

Para la proyección de imagen viva de la musculatura abdominal (figura 3película S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP fue utilizado como un marcador y se abrió una ventana sobre el abdomen de la envoltura pupal como indica en la figura 1. Similar a la película de músculo de vuelo indirecto representada en la figura 2A-D, la formación y crecimiento de los músculos abdominales se pueden seguir durante muchas horas de desarrollo (55 h en película S4). Durante este tiempo, los mioblastos se fusionan para formar miotubos (Figura 3A) de crecimiento. Los consejos de myotube migran sus objetivos del tendón, y después de colocar a las células del tendón, se forman las unidades contráctiles de los músculos, los sarcómeros, (figura 3B-D).

Figura 3: proyección de imagen de la morfogénesis del músculo abdominal en vivo. (A-D) Tiempo puntos de una película (película S4) con Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP como marcador para seguir morfogénesis del músculo abdominal. Paneles A'-E' Mostrar superposiciones con los modelos de un conjunto de músculos abdominales (verde) que se forma de novo durante la etapa pupal. Barras de escala son 100 μm. tiempo es indicado como HH: mm APF. La película fue adquirida a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En vivo imagen de fasciculaciones de los músculos

En contraste con la figura 2 y figura 3, figura 4 muestra la dinámica del músculo que ocurren en la escala de tiempo de segundos: la grabación en vivo de las contracciones musculares. Pupas de expresar βPS-integrina-GFP bajo control endógeno fueron imagen con una resolución de tiempo de 0.65 s en un solo plano de z en un microscopio confocal (Película S5). En el ejemplo mostrado en la figura 4, fueron imágenes de los sitios de fijación de tres DVMs (Figura 4A) por 10 min a partir de las 42 h APF. Durante este tiempo, contracción de cinco eventos se observaron (Figura 4B-F), mostrando que los sarcómeros están ya montados bien coordinadas las contracciones en este momento la ayuda en el desarrollo. Por lo tanto, la proyección de imagen de las fasciculaciones musculares puede utilizarse como un indicador funcional para sarcomerogenesis ya durante vuelo indirecto muscular desarrollo²⁸, a diferencia de por ejemplo las pruebas de vuelo, que puede realizarse solamente después de la eclosión.

Figura 4: vive la proyección de imagen de fasciculaciones de los músculos. (A) primer-momento de una película (película S5) mostrando fasciculaciones de los músculos de vuelo indirectos dorsoventral en 42 h usando APF βPS-integrina-GFP como marcador. En el campo de visión es el músculo accesorio sitios de DVM II 2, III 1 DVM y DVM III 2. (B-F) Color de superposiciones de cinco eventos de cada contracción, cada uno mostrando el marco antes de la contracción (magenta) y el primer fotograma del evento de contracción (verde). Tenga en cuenta que las fibras individuales del músculo contracción nerviosa independientemente unos de otros. Las flechas resaltan el movimiento que crispa. La resolución de tiempo de la película es 0,65 s. barras de escala son 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En vivo la proyección de imagen de proteínas endógeno etiquetas

Similar a βPS-integrina-GFP, una colección grande de proteínas de fusión expresado en Drosophila bajo control endógeno ha sido generado^2,3,4. Estas líneas de mosca pueden utilizarse para estudiar por ejemplo la localización subcelular o los perfiles de expresión de proteínas de interés. La colección es especialmente útil si no hay anticuerpos específicos o dinámica de la proteína necesita ser investigados en vivo sin fijación. La figura 5 muestra tres ejemplos de proteínas de fusión endógeno expresado de la mosca TransgeneOme (fTRG) Biblioteca, Hu li tai shao (Hts)-GFP (figura 5A, B), Talin-GFP (figura 5, D) y βTubulin60D-GFP ( Figura 5E, F). La expresión de estas proteínas puede estudiarse en todos los tejidos que expresan naturalmente. Aquí, mostramos el epitelio de tórax (figura 5AC, E) y los músculos de vuelo indirectos o sus sitios de fijación (figura 5BD, F) como ejemplos.

Figura 5: en la proyección de imagen de endógeno etiquetados proteínas. (A, B) Proyecciones de máxima de z-pilas de pupas expresando GFP Hts. (C, D) Proyecciones de máxima de z-pilas de pupas expresando GFP Talin. (E, F) Proyecciones de máxima de z-pilas de pupas expresando GFP βTubulin60D. Paneles A, C y E Mostrar el epitelio del tórax en 18, 24 y 18 h de la APF, respectivamente y paneles B, D y F muestran los músculos de vuelo indirectos o sus sitios de fijación a las 30 h de la APF. Barras de escala son 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo presentado describe cómo imagen de morfogénesis del músculo-tendón en la vida de pupas de Drosophila usando una variedad de proteínas fluorescencia de etiquetado. Esta en vivo imagen estrategia puede utilizarse para el estudio de procesos de desarrollo en su ambiente natural de todo el organismo.

Es fundamental para un exitoso experimento encontrar el punto correcto tiempo de desarrollo para analizar. Por ejemplo, músculos de vuelo indirectos dorsolongitudinal inician la adhesión a sus objetivos de tendón a ≈16 h APF²³ mientras que los músculos abdominales desarrollan más tarde y conectar en ambos extremos sólo entre 30 y 40 h APF²⁶. En consecuencia, la literatura publicada previamente se debe utilizar para encontrar los puntos de tiempo de desarrollo para analizar o, si el tejido o estructura de interés no ha sido estudiado en detalle antes, el desarrollo integral debe caracterizarse en primer lugar.

Pupas de montaje con éxito en las diapositivas de plástico a la medida, es importante que las ranuras tienen dimensiones adecuadas: lo surcos deben ser 1.0-1.5 mm ancho y 0,3 - 0,4 mm de profundidad. Esta profundidad permite ajustar la distancia precisa a cubreobjetos superior con espaciador cubreobjetos según sea necesario. Sin embargo, por lo menos un espaciador cubreobjetos puede usarse para evitar drenaje el glicerol 50% de la muestra por las fuerzas capilares. La correcta posición de las pupas en el surco requiere experiencia y deberían optimizarse tal que la estructura de interés es lo más cerca posible al cubreobjetos.

Si un gran número de pupas se supone para ser reflejada en la sesión de un microscopio, pueden todos ser montados previamente y luego almacenados en una incubadora hasta la proyección de imagen para asegurar la correcta sincronización del desarrollo. Las pupas deben sobrevivir todo el procedimiento y también por lo menos intentar eclose si se mantiene en la diapositiva después de la proyección de imagen. La tasa de supervivencia puede utilizarse como una lectura para verificar si las condiciones de dañan las pupas.

Los ajustes de imagen deben elegirse cuidadosamente según los requisitos experimentales. Para películas a corto plazo, una velocidad de fotogramas alta versus un alto cociente signal-to-noise debe ser equilibrado, mientras que la energía relativamente alta del laser se puede utilizar sin dañar demasiado las pupas. Sin embargo, para películas a largo plazo, la energía del laser tiene que mantenerse en un nivel moderado y las pupas no deben ser reflejadas continuamente sino en ciertos puntos del tiempo, por ejemplo, cada 20 minutos. Para asegurar que la estructura de interés no se mueve fuera del campo de visión, podría ser necesario reajustar la posición de la pila de z entre los puntos de tiempo. A nuestro conocimiento, la apertura de la envoltura pupal por sí no afecta tiempo de desarrollo. Sin embargo, una etapa de control de temperatura debe usarse para películas a largo plazo para asegurar la correcta sincronización del desarrollo. Teniendo estas consideraciones en mente, se pueden adquirir películas altamente informativos.

El protocolo presentado puede utilizarse para visualizar no sólo la morfogénesis del músculo-tendón sino también otros tejidos en desarrollo, por ejemplo, el ala de epitelio²⁹. Sólo tres modificaciones en el presente Protocolo se requiere: (1) abertura de la envoltura pupal sobre el ala en lugar del tórax o abdomen, (2) posicionamiento de pupas con el ala hacia el cubreobjetos arriba y (3) el uso de proteínas de diferentes marcadores fluorescentes. Con el avance de la tecnología/Cas9 CRISPR, proteínas fluorescentes más endógeno etiquetas estará disponibles, porque es más sencillo dirigir loci endógenos en Drosophila^{30,31 , 32}. en el futuro, esto permitirá dilucidar la dinámica de numerosas proteínas, células y tejidos todos en su entorno fisiológico en detalle.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Leica	MZ6	product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials)	-	-	standard culture medium
paint brush	da Vinci	1526Y	size 1
microscope slides	Thermo Scientific	VWR: 631-1303	76 x 26 mm
double-sided tape (optional)	Scotch	6651263	12 mm x 6.3 m
petri dishes	Greiner Bio-One	632102	94 x 16 mm
paper tissues	Th.Geyer	7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard)	Fine Science Tools	11251-20	0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)	Fine Science Tools	11252-20	0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-02	straight tip
plastic slides with a groove (reusable)	custom-built	-	75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips	Marienfeld	107032	18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol	Sigma-Aldrich	49781	dilute to 50 % in water
adhesive tape	Tesa	57370-02	1.5 mm x 10 m