Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

Resumen

Gel-seq permite a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de ambos ADN - y RNA-seq en el insignificante costo adicional a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas.

Resumen

La capacidad de amplificar y la secuencia de DNA o RNA de pequeñas muestras partidas sólo se ha logrado en los últimos cinco años. Desafortunadamente, los protocolos estándar para generar genómica o transcriptómicos bibliotecas son incompatibles y los investigadores deben optar por la secuencia de DNA o RNA de una muestra particular. Gel-seq soluciona este problema permitiendo a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de DNA y RNA a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas. Hemos diseñado Gel-seq para que pudiera ser fácilmente implementado por otros investigadores; muchos laboratorios de genética ya tienen el equipo necesario para reproducir la fabricación de dispositivo seq Gel. Nuestro protocolo emplea comúnmente utilizado kits para ambos toda transcripción amplificación (WTA) y preparación de la biblioteca, que también es probable que sean familiares a los investigadores ya versados en la generación genómicos y transcriptómicos bibliotecas. Nuestro enfoque permite a los investigadores a llevar el poder de la secuenciación de ADN y ARN en una sola muestra sin dividir y con insignificante coste añadido.

Introducción

Próxima generación sequencing (NGS) ha tenido un impacto profundo en la manera en que se lleva a cabo la investigación genética. Cuando los investigadores se centraron una vez en secuenciar el genoma de una especie entera, ahora es posible secuenciar el genoma de un solo tumor o incluso una sola celda en un experimento. ¹ NGS también ha hecho rentable a los transcritos de RNA encontrados dentro de una célula, un conjunto de datos conocidos como el transcriptoma de la secuencia. La capacidad de amplificar y la secuencia de DNA o RNA de pequeñas muestras partidas sólo se ha logrado en los últimos cinco años. ^{2 , 3 , 4} Desafortunadamente, protocolos estándar son incompatibles y los investigadores deben optar por la secuencia de DNA o RNA de una muestra determinada. Cuando una partida muestra es suficientemente grande, puede dividirse por la mitad. Sin embargo, en escalas más pequeñas, pérdida de material debido a la división de las muestras puede afectar la calidad de la biblioteca, y puesta en común de las muestras puede promedio de variaciones interesantes entre las células. ⁵ además, los investigadores están cada vez más interesados en el examen de las muestras que no pueden dividirse, como las células o las biopsias de pequeño tumor heterogéneo. ⁶

Para resolver este problema, tres protocolos recientemente se han desarrollado para la secuencia de ADN y ARN de la misma muestra partida: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸y DR-seq⁹. Este artículo presenta un protocolo detallado para Gel-seq, que puede utilizarse al mismo tiempo generar bibliotecas de ADN y ARN desde tan sólo 100 células en el insignificante costo adicional. El aspecto novedoso de Gel-seq es la capacidad para separar el ADN y el ARN basado exclusivamente en el tamaño utilizando matrices de hidrogel de bajo costo. La innovación principal del protocolo Gel-Seq es la separación física de la DNA del RNA. Esta separación se logra utilizando electroforéticamente una combinación de membranas de poliacrilamida que se aprovechan de las diferencias de tamaño entre estas moléculas. Para poner estas diferencias de tamaño en contexto, considerar cómo son imágenes de ADN y ARN: ADN existe en la escala de micrones y puede verse con los microscopios tradicionales, ARN existe en la escala de nanómetros y debe ser reflejada mediante técnicas complejas como cryo-electrón microscopia. ¹⁰

El enfoque a la separación de ADN y ARN en este protocolo se muestra en la figura 1. El panel izquierdo muestra ADN y ARN liberan flotando en la solución cerca de una membrana. Cuando se aplica un campo eléctrico, como se muestra en el panel derecho, DNA y RNA experimentan una fuerza electroforética que induce la migración a través de la membrana. Ajuste las propiedades de la membrana, hemos creado una membrana semipermeable que separa el ADN del ARN. Las moléculas de ADN son empujadas contra la membrana, pero se enredaron en el borde debido a su gran tamaño. Pequeñas moléculas de ARN, por otra parte, pueden reconfigurar y tejer su camino a través de la membrana. Este proceso, conocido como reptation, es similar a la forma de que una serpiente se mueve a través de la hierba. Eventualmente estas moléculas de RNA son detenidas por una segunda membrana alta densidad que es demasiado difícil para los polímeros más pequeños (> 200 pares de bases) a retorcerse a través. Una vez separadas físicamente, ADN y ARN pueden recuperado y procesado para generar información sobre el genoma y el transcriptoma. Mientras que podemos separar el ADN y el ARN, hemos encontrado mejores resultados se obtienen si el ARN es revés transcrito a cDNA antes de la separación. Los híbridos de ARN cDNA son más estables que el RNA solo y todavía pueden pasar a través de la membrana de baja densidad.

Figura 1 . Principio de funcionamiento de gel-seq. El principio subyacente que se utiliza para separar físicamente los ADN y ARN. En un campo eléctrico aplicado, las moléculas de ARN pequeñas migran a través de la membrana baja densidad pero grandes moléculas de ADN están atrapadas en la superficie. Esta figura fue reproducida de ref. 7 con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este documento describe en detalle tanto la fabricación del dispositivo de Gel-seq y el protocolo biológico para generar emparejado bibliotecas de DNA y RNA. Un resumen de ambos se muestra en la figura 2. El dispositivo es fabricado por capas tres diferentes densidades geles de poliacrilamida uno encima del otro en un proceso similar a la creación de geles de apilamientos estándar. ¹¹ el protocolo biológico comienza con 100-1000 células suspendidas en PBS. Las células son sometidas a lisis y el ARN se convierte en ADNc antes de que el dispositivo se utiliza para separar el ADN genómico de los híbridos de ARN cDNA. Después de la separación y recuperación, genómico y transcriptómicos bibliotecas son preparadas mediante un proceso que sigue de cerca el protocolo de kit de preparación de biblioteca estándar de todo el genoma. Mayores detalles sobre el desarrollo y validación de Gel-seq se pueden leer en el laboratorio en una publicación de Chip "seq Gel: todo el genoma y transcriptoma ordenando por la simultánea baja ADN y ARN biblioteca preparación utilizando barreras semipermeables hidrogel ." ⁷

Figura 2 . Protocolo de gel-seq. Un resumen de los pasos para fabricar el dispositivo de Gel-seq y el protocolo generados bibliotecas pares de ADN y ARN. Porciones de esta figura fueron reproducidas de 7 Ref. con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para generar bibliotecas de ADN y ARN de las células, los investigadores deben considerar el uso de G & T-seq o siguientes Dr. G & T-Seq, como Gel-seq, se basa en una separación física del ARN de la DNA genomic. Este enfoque se basa en ARN mensajero (ARNm) 3′ cofia cola como Diana abatible. El mRNA es capturado en una tira magnética utilizando una cartilla de oligo-dT biotinilado. Una vez que el ARNm se ha capturado las cuentas se sujetan con un imán y el sobrenadante que contiene el ADN genómico se puede quitar y transfirió a otro tubo. Después de esta separación física es completa, se pueden generar bibliotecas separadas del mRNA y de ADN. ⁸ este enfoque funciona bien si el ARN de interés es la cofia, sin embargo no puede utilizarse para el estudio de transcripciones no cofia, como ARN ribosomal, tRNA o ARN de procariotas.

DR-seq se basa en un paso de amplificación previa donde se amplifican ADN y ADNc derivado del RNA en el mismo tubo. La muestra es entonces dividida en dos y procesada paralelamente preparar bibliotecas de DNA y RNA-seq. Para distinguir entre ADN genómico y cDNA derivada del RNA, DR-seq tiene un enfoque computacional. Secuencias que están presentes sólo los exones computacionalmente se suprimen en los datos de ADN genómicos, como los pudieran haber originado de DNA o RNA. ⁹ una ventaja de este enfoque es que el DNA y cDNA del ARN necesitan no ser físicamente separados como se hace en Gel-seq y G & T-SS. El inconveniente, sin embargo, es que DR-seq requiere un conocimiento a priori del genoma y transcriptoma (es decir, exons y introns), puede no ser ideal para aplicaciones como secuenciación de núcleos, en que muchas transcripciones no son aún completamente empalmado y todavía contienen intrones. ¹²

El aspecto novedoso de Gel-seq es la capacidad para separar el ADN y el ARN en cientos de células basadas exclusivamente en el tamaño. Este método requiere de ningún conocimiento a priori del genoma o transcriptoma, es robusta contra empalme incompleto y no se limita a las transcripciones de poli-adenylated. Para aplicaciones donde un investigador puede comenzar con por lo menos 100 células, seq Gel proporciona un enfoque sencillo utilizando materiales baratos y extensamente disponible.

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Protocolo

1. preparación de la solución química

Nota: Los siguientes pasos son para la preparación de soluciones químicas en pasos posteriores. Éstos pueden hacen a granel y almacenados durante varios meses.

1. Para empezar, preparar 50 mL de agua desionizada, purificada por esterilizar en un horno de reticulación de UV 254 nm durante 15 minutos (15 mJ/cm² exposición total) neutralizar cualquier ADN contaminante. Calentar a 37 ° C para su uso en pasos.
2. Tomar 10 mL de un 40% total (T) y 3,3% crosslinker (C) (29: 1) solución de poliacrilamida precursora. Pesar 3,867 g de acrilamida monómero y 0,133 g de bis-acrilamida monómero. Combinar y llevar el volumen hasta 10 mL con agua purificada caliente y agitar hasta que se disuelva. Almacenar protegido de la luz a temperatura ambiente.
   Nota: Premezclado 40% T, 3.3% C (29: 1) soluciones de poliacrilamida pueden adquirirse comercialmente.
3. Tomar 10mL de T, la solución en gel 5% C el 50%. Pesar 4,750 g de acrilamida monómero y 0,250 g de bis-acrilamida monómero. Combinar y llevar el volumen hasta 10 mL con agua purificada caliente y agitar hasta que se disuelva. Almacenar protegido de la luz a temperatura ambiente.
4. Tomar 10 mL de una solución de sacarosa al 50% (w/v). Sacarosa de 5 g a una probeta graduada y añadir agua purificada caliente hasta un volumen total de 10 mL. Mezclar hasta que se disuelva y almacenar a temperatura ambiente.
5. Tomar 10 mL de 10% APS (w/v). Añadir 1 g de persulfato de amonio (APS) a un cilindro graduado. Añadir frío (~ 4° C) purificada agua hasta un volumen total de 10 mL y agitar hasta que se disuelva. Inmediatamente congelar en alícuotas de 200 μl.

2. gel-seq Cassette fabricación

Nota: Seq Gel fue desarrollado originalmente con cintas verticales (véase Tabla de materiales para obtener más información); sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para trabajar con cualquier casete de electroforesis de gel estándar.

1. Preparar gel precursores en tres tubos de plástico separados mediante la adición de los reactivos como se muestra a continuación en tabla 1. No añadir APS o Tetramethylethylenediamine (TEMED) hasta que dirigió en los siguientes pasos. Ingredientes de Vortex para mezclar bien.

Relleno Gel Precursor		Precursor de Gel de alta densidad		Precursor de Gel de baja densidad
40 %T, 3.3%C acrilamida bisacrilamida solución	1.6 mL	50 %T, 5 %C acrilamida bisacrilamida solución	2.4 mL	40 %T, 3.3%C acrilamida bisacrilamida solución	0,6 mL
Agua desionizada	10,2 mL	Agua desionizada	1,0 mL	Agua desionizada	4,8 mL
Solución de sacarosa (50% w/v)	2,6 mL	Solución de sacarosa (50% w/v)	0,6 mL
10 X Tris-borato-EDTA	1.6 mL			10 X Tris-borato-EDTA	0,6 mL
Persulfato de amonio (10% w/v)	104.0 ΜL	Persulfato de amonio (10% w/v)	50,0 ΜL	Persulfato de amonio (10% w/v)	39.0 ΜL
TEMED	6.0 ΜL	TEMED	1,0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Volumen total	16,1 mL	Volumen total	4,1 mL	Volumen total	6,0 mL

Tabla 1. Gel de síntesis reactivos. Gel de poliacrilamida reactivos precursores suficientes para la fabricación de 2 casetes.

2. De gas gel soluciones de monómero por inserción de una aguja a través del tapón del tubo y la conexión esta aguja a una línea de vacío de casa. Sumerja este ensamblado en un conjunto de baño de ultrasonidos alta y espere a que las burbujas dejen emergentes del líquido antes de pasar al siguiente paso (~ 60 segundos / tubo).
   Nota: La calidad del vacío y el poder del baño de ultrasonidos no es críticas siempre y cuando se observan burbujas saliendo de la solución.
3. Añadir TEMED y el APS y el relleno gel precursor vortex brevemente. Inmediatamente agregar 6 mL de relleno gel precursor a cada cassette de gel pipetear la solución en la parte superior de la cinta. Utilice una micropipeta de 1 mL para agregar el precursor en seis incrementos para evitar derrames. El tiempo total para este paso debe ser menos de 3 minutos.
4. Asegúrese de que el líquido es nivel colocando las cintas verticales en una tabla. Llene el resto de la cinta con agua desionizada, desgasificada. Pipeta el agua, con incrementos de 1 mL, poco a poco en el centro del cassette para minimizar la mezcla. Permitir que el polímero curar durante por lo menos una hora, hasta para la noche.
5. Después de que el polímero ha curado, invierta los cassettes de gel sobre un fregadero para eliminar la capa de agua. Una pistola de aire comprimido se puede utilizar para secar suavemente la interfaz soplando aire a través de la abertura superior del cassette de una distancia de 6 pulgadas.
6. Añadir TEMED y el APS al precursor de gel de alta densidad y vortex brevemente. Inmediatamente añadir 320 μl del precursor del alta densidad al cassette, otra vez usando una pipeta de 1 mL. Asegúrese de que el líquido cubre uniformemente la capa de gel de relleno, meciendo la cinta hacia adelante y hacia atrás alrededor de 3 veces. Este paso debe tomar menos de tres minutos.
7. Llene el resto de la cinta con agua desionizada, desgasificada. Tomar con pipeta lentamente con una pipeta de 1 mL en el centro del cassette para minimizar la mezcla. Permitir que el polímero de cura de al menos quince minutos, preferiblemente a una hora.
8. Otra vez, invertir los cartuchos de gel para eliminar la capa de agua. Puede utilizarse aire comprimido para secar con suavidad la interfaz. Añadir TEMED y el APS al precursor de gel de baja densidad y vortex brevemente. Inmediatamente llenar el resto de la cinta (~1.65 mL) con el precursor de gel de baja densidad e inserte el peine del gel.
9. Tomar con pipeta un exceso de precursores de la reserva en la parte superior del peine será absorbido durante la polimerización. Permitir que el polímero curar al menos 4 horas, preferentemente durante la noche. Los geles pueden guardarse durante una semana o más en un tampón de Tris-borato-dihidratada del ácido (EDTA) (tampón TBE).

3. preparación y transcripción reversa

1. A partir de una suspensión de células de interés y trabajar en una campana de flujo laminar (PCR) reacción en cadena de polimerasa, utilizan un hemocitómetro o un contador celular automático para calcular la concentración de la célula. Diluir las células a una concentración de 100 a 1000 células por μl de tampón fosfato salino (PBS).
   Nota: Este protocolo ha sido validado en un rango de celdas como PC3, HeLa, células de hígado de ratón.
2. Suministrado en el WTA de reactivos kit (véase Tabla de materiales), mezcla 19 μl de tampón de lisis y 1 μl de inhibidor de la Rnasa a preparar un 10 X stock solución de tampón de reacción. Crear una mezcla maestra de lisis volumen suficiente con 0,5 μl de tampón de reacción y 2.75 μl de agua libre de nucleasa para cada muestra.
3. Pipetear la suspensión hacia arriba y abajo 5 veces para resuspender las células colocadas y luego Pipetear 1 μl de muestra en un tubo de tira libre de nucleasa 200 μL esterilizado por rayos UV. Repita según sea necesario dependiendo del número de muestras. Asegúrese de incluir un control negativo por pipeteo 1 μl de agua libre de nucleasas en lugar de células para una reacción. A continuación, añada 3.25 μl de la mezcla principal de lisis para cada muestra y mezclar mediante pipeteo suavemente arriba y abajo 5 veces.
4. Precaliente a un termociclador (con la tapa caliente) a 72 ° C. Añadir 1 μl de cebador de RT y 1 μl de 20 μm random hexamer con adaptador WTA (5-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3 ') a cada muestra. Reservar al menos un tubo como control positivo para la preparación de biblioteca gDNA y añadir 2 μl de agua en lugar de cartillas.
   Nota: Random hexamer con adaptador WTA es opcional y tiene un impacto mínimo en los resultados de la secuencia.
5. Incubar las muestras a 72 ° C en el termociclador precalentado durante 3 minutos para lisar las células. Quitar las células del termociclador y en hielo durante 2 minutos. Guarde el control positivo a 4 ° C hasta el paso 5.
6. Mientras que las células son lisis, crean un volumen suficiente de mezcla principal reversa de la transcripción de todas las muestras de RNA que contienen las siguientes proporciones de reactivo: 2 μl de tampón de strand primera, 0.5 μl de plantilla interruptor del oligonucleótido (TSO), 0.25 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de de la transcriptasa reversa (100 U/μL).
7. Precaliente el termociclador a 42 ° C. Añadir 3,75 μl de la mezcla principal de reversa de la transcripción a las muestras restantes, que el volumen total de la muestra 10 μl. mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 5 veces.
8. Realizar la transcripción inversa inmediatamente colocar las muestras en un termociclador precalentado. Ejecutar el siguiente programa: 42 ° C durante 90 minutos, 70 ° C durante 10 min, 4 ° C para siempre. Este es un punto de parada segura.

4. gel separación y recuperación de la muestra

1. Limpiar una cámara de electroforesis de gel usando un producto de extracción de ADN. Aplicar varios mL de líquido limpiador líquido un paño libre de pelusa desechables y limpie a todas las superficies de la cámara y luego llene la cámara con limpia 0.5 x TBE. Para obtener resultados óptimos, coloque todo el aparato en un horno de reticulación 254 nm UV y esterilizar durante 15 minutos (15 mJ/cm²).
2. Inserte el cartucho de Gel-seq en la cámara de electroforesis de gel y trabarlo en su lugar. Lentamente retire el peine del gel tirando hacia arriba. Mueva lentamente para evitar el rasgado el gel o ripeo de los brazos.
3. Mantener las muestras del paso 3 en el hielo, reserva al menos una muestra como control positivo para la generación de la biblioteca de cDNA. Guarde este control a 4 ° C hasta el paso 6. Añadir 2 μl de 6 X tinte a las muestras restantes de carga, llevando el volumen total a ~ 12 μl. bien mezclar las muestras mediante pipeteo arriba y abajo 5 veces.
4. Combinar 1 μl de una escalera de ADN con 2 μl de 6 x carga de tinte y 7 μl de agua. Pipetear esta mezcla en 1 carril del Gel-seq cassette como un control de electroforesis. Pipetear las muestras del paso anterior en carriles separados de la cassette de Gel-seq. Tenga cuidado para evitar la contaminación entre pozos insertar la pipeta completamente en cada pocillo y con sólo un movimiento vertical.
5. Utilizando una fuente de alimentación estándar del gel de electroforesis, aplicar un campo eléctrico de 250 V a través del cassette de Gel-seq durante 30 minutos para separar el gDNA de los híbridos de ARN cDNA. Una vez separado, retire el casete de Gel-seq de la cámara de electroforesis en gel y abrir las dos mitades del cassette apalancando los bordes con una herramienta de raspado.
6. Con un bisturí, cortar el gel en la mitad justo por debajo de la capa de alta densidad. Deseche la mitad que contiene el gel de relleno por cogerlo con la mano enguantada. Pelar suavemente el gel restante de la cinta raspando con un raspador de pintura u otra herramienta similar. Coloque en esta sección de gel en un plato que contiene 30 mL de 0,5 x TBE con 3 μl de colorante de gel.
7. Cubrir el recipiente para minimizar el fotoblanqueo y remojar el gel agitando suavemente el recipiente por 5 minutos. Coloque el gel en la envoltura de plástico y tomar una imagen de UV utilizando un sistema de documentación de gel (para más detalles, consulte Ref. 13). Una segunda exposición 30 típicamente produce imágenes claras. Verificar que se ha producido la separación.
8. Mover el gel en un transiluminador UV para facilitar la visualización de los ácidos nucleicos. Usar gafas apropiadas de rayos UV, confirmar los resultados del sistema de documentación de gel. El gDNA debe estar ubicado al inicio del gel de baja densidad y el cDNA en el interfaz de las regiones de baja densidad y alta densidad.
9. Usar un bisturí, cortar las regiones del gel que contiene el gDNA y cDNA. Las muestras se recuperan mejor cortando una de 4 mm de sección rectangular de 10 mm de gel; sin embargo, la geometría exacta dependerá del sistema de electroforesis en gel. No olvide también cortar el carril de la carga con el control negativo.
10. Coloque cada sección suprimida de gel en un tubo tira utilizando un par de pinzas de extremo romo. Tenga cuidado de no aplicar demasiada fuerza o el gel se divide en varias piezas. Debe esto pasar, simplemente recoger cada pieza y agregar al tubo.
11. Triturar el gel en cada tubo con la punta de una pipeta (200 μL pipeta tips funcionan bien) moviendo la punta de la pipeta en forma circular sobre el fondo del tubo. Añadir agua libre de nucleasas (40 μL en las muestras del gDNA y 80 μL en las muestras de cDNA) a cada tubo antes de retirar la punta de la pipeta utilizada para moler el gel para minimizar la pérdida de muestra.
12. Colocar la tira de tubos con un mezclador de vórtice dentro de una incubadora de 37 ° C y agitar durante 8-12 horas. Esto permite que los ácidos nucleicos difundir fuera del gel y es un natural punto de este protocolo de día multi de parada.
13. Pipetear las muestras en una placa de filtro de malla de 8 μm y girar la placa a 2600 x g durante 5 minutos a la tensión a los fragmentos de gel. Levante la placa de filtro de malla de la placa de cubierta y pipetear las muestras gratis de gel en un tubo de strip nuevo de 200 μl.
14. Añadir 1 μl de proteasa (0,9 AU/mL) a cada muestra contiene gDNA, mezcla bien mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a 50 ° C durante 15 min, seguido de una inactivación de calor a 70 º C durante 15 minutos. Este paso es crítico para el agotamiento de los nucleosomas y hace accesible para los pasos de la reacción posterior del gDNA.
15. Utilizando una aguja de 18 calibre, empujar los agujeros en las tapas de todos los tubos de muestra. Coloque las muestras en un vacufuge para reducir el volumen de líquido. gDNA muestras deben reducirse a 5 μl y cDNA muestras reducidas a 10 μl.
16. Dependiendo del vacufuge y número de muestras, el tiempo de evaporación total varía entre 30 y 60 minutos. Si el volumen de muestra cae por debajo del volumen de destino, simplemente añadir agua libre de nucleasa para aumentar el volumen de muestra.

5. gDNA preparación de biblioteca

1. Con un fluorómetro o tecnología similar, cuantificar la concentración de ADN en cada muestra del gDNA desde el paso 4, así como el control positivo del paso 3. Para un protocolo detallado consulte el manual de referencia de Fluorímetro. ¹⁴
2. Diluir las muestras a 0,2 ng/μl de ADN. Dependiendo del tipo de la célula inicial y calidad de los resultados requeridos, concentraciones más bajas pueden producir todavía viables bibliotecas. Algunos experimentos se requiere; sin embargo, los autores tuvieron éxito con bibliotecas tan bajas como 0.1 ng/μl.
3. Completar gDNA biblioteca preparación siguiendo el protocolo de volumen biblioteca preparación medio de reacción en el paso 7.

6. preparación de la biblioteca de cDNA

1. A partir de las 10 muestras de cDNA μl y control positivo del paso 4, añadir 12,5 μl de mezcla X qPCR 2, 0,5 μl cDNA PCR primer y agua libre de nucleasa de 2 μl.
2. Realizar PCR en un termociclador en tiempo real mediante el protocolo siguiente: comienzo caliente a 95 ° C por 3 min, seguido de 20-30 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 65 ° C para 30 s y 72 ° C para el volumen de la muestra Total de 3 minutos es de 25 μl. controlar las curvas de reacción y detener la amplificación antes de th reacciones e salir de la fase exponencial (aumento de señal lineal versus número de ciclo) para evitar artefactos PCR debido a overamplification. Para más información sobre cómo evitar overamplification, consulte la sección de discusión de este papel como Ref. 15.
3. Después de la amplificación, limpie el producto con fase sólida perlas de inmovilización reversible (SPRI) siguiendo el protocolo en el paso 8. Una vez completado, proceder al siguiente paso.
4. Con un fluorómetro o tecnología similar, cuantificar la concentración de ADN en cada muestra de cDNA, así como el control positivo del paso 4. Diluir las muestras si es necesario para contener aproximadamente 0,2 ng/μl de ADN. Concentraciones ligeramente menores producen todavía viables bibliotecas. Algunos experimentos se requerirá, sin embargo, los autores tuvieron éxito con bibliotecas tan bajas como 0.1 ng/μl.
5. Paso opcional: realizar una separación de electroforesis en gel de poliacrilamida al estándar en 1-2 μl de cada producto de qPCR para validar la reacción de generación de biblioteca trabajado. Una imagen de muestra del resultado acertado se muestra en la figura 4. Para un protocolo detallado sobre cómo llevar a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida, ver Ref. 16.
6. Completar cDNA biblioteca preparación siguiendo el protocolo de reacción medio volumen de biblioteca preparación kit en el paso 7.

7. Biblioteca preparación con reacciones de medio volumen

1. Preparación de biblioteca sigue el protocolo de kit de preparación Biblioteca utilizando reacciones de volumen medio. ¹⁷ se hace referencia en esta sección del Protocolo de todos los reactivos son de la preparación de la biblioteca kit (véase Tabla de materiales). Comenzar por UV esterilización un número suficiente de tubos de la tira para el número de muestras a procesar.
2. Llevar a cabo la reacción de la transposasa añadir 5 μl de tampón de transposasa a cada tubo de tiras para ser utilizado en el ensayo. Añada 2,5 μl de entrada ADN a 0,2 ng/μl (0,5 total de ng) seguido por 2.5 μl transposasa. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo 5 veces.
3. Incubar a 55 ° C durante 5 minutos, y mantenga a 10 ° C. Después de que la muestra alcanza los 10 ° C, sácalo del termociclador y añadir 2,5 μl transposasa Tope amortizante para cada muestra. Mantener las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Preparar la reacción de PCR para amplificar la muestra del Tratado de la transposición mediante la adición de 7,5 μl biblioteca preparación PCR mezclar, 2.5 μl de un primer Índice 1 y 2,5 μl de una cartilla de índice 2. Estos iniciadores son propiedad y son suministrados por el fabricante del kit de preparación de biblioteca. Mezclar por pipeteo arriba y abajo 5 veces.
   Nota: Asegúrese de que se utilizan combinaciones de cartilla única para cada muestra. Hay 12 diferentes Índice 1 cartillas y 8 diferentes índice 2 cartillas, posibilitando únicamente la etiqueta hasta 96 muestras diferentes. Elegir una combinación única de cartillas para cada muestra.
5. Realizar PCR utilizando el siguiente programa en un termociclador. El volumen de muestra es de 25 μl.
   72 ° C durante 3 minutos
   95 ° C durante 30 segundos
   12 ciclos de:
   95 ° C por 10 segundos
   72 ° C por 30 segundos
   55 ° C durante 30 segundos
   72 ° C durante 5 minutos
   Mantener a 10 º C
6. Limpiar las librerías preparadas con perlas de SPRI siguiendo el protocolo en el paso 8. Las bibliotecas deben validarse mediante electroforesis en gel o un análisis similar. Consulte el manual de kit de preparación de biblioteca para obtener información sobre cómo validar las bibliotecas. ¹⁷

8. sólido fase inmovilización Reversible grano biblioteca limpieza

1. Fase sólida inmovilización reversible (SPRI) granos se deben guardar en alícuotas de 1,5 mL y deben ser llevado a temperatura ambiente antes de cada uso. También se recomienda para preparar etanol al 80% fresco para cada experimento. Los pasos siguientes se basan el protocolo de grano SPRI en el manual del kit WTA. ¹⁸
2. Añadir 1 μl del buffer de lisis WTA kit a cada producto PCR. Vórtice los granos SPRI hasta uniformemente mezclados, luego añada 50 μl de granos de la SPRI para cada muestra. Mezclar mediante pipeteo la muestra arriba y abajo 10 veces y luego incubar las muestras a temperatura ambiente durante 8 minutos.
3. Girar brevemente las muestras para recoger el líquido desde el lado de los tubos. Coloque las muestras en un dispositivo de separación magnética de ~ 5 minutos hasta que el líquido aparezca totalmente claro.
4. Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, lentamente Pipetee el sobrenadante y desechar - tenga cuidado de no disturbar el anillo de abalorios en el tubo. A continuación añadir 200 μL de etanol al 80% para cada muestra sin molestar a los granos. Espere 30 segundos y luego Pipetear cuidadosamente apagado el sobrenadante. Repita este paso (colada de etanol) una vez.
5. Permitir que las muestras a secar durante 30 seg - 1 min. No secar demasiado las muestras como fragmentos grandes estará convertido en obligado permanentemente a los granos.
   Nota: Se recomienda un tiempo breve de secado para asegurar que se eliminan todos los restos de etanol. Trazas de etanol quede detrás ligeramente pueden inhibir reacciones posteriores.
6. Retire las muestras del dispositivo de separación magnética y añadir 15 μl de agua para cada muestra a fin de eluir el ADN de los granos. Pipetee hacia arriba y hacia abajo y asegúrese de que los granos se quitan de los lados de los tubos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos. Girar brevemente las muestras y colocarlas en el dispositivo de separación magnética para ~ 1 minuto hasta que la solución aparece clara.
7. Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, lentamente Pipetee hasta el sobrenadante y transferir a tubos limpios. Tenga cuidado de no disturbar el anillo de abalorios en el tubo. Deseche los tubos con los granos.

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Resultados

La separación física de los híbridos gDNA y cDNA del ARN en el dispositivo de Gel-seq puede visualizarse a través de la proyección de imagen de gel fluorescente; un resultado representativo se muestra en la figura 3. Panel A muestra el dispositivo fabricado de Gel-seq; falso color se ha agregado para distinguir las regiones diferentes del gel. Panel B muestra un cierre de cuatro separaciones diferentes utilizados para la validación. El tercer carril, un...

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Discusión

Hay varios pasos críticos asociados con la fabricación de dispositivo seq Gel así como el propio protocolo. Durante la fabricación, recomendamos a partir de los espesores de capa prescritos para las distintas regiones del gel. Pasamos mucho tiempo prueba opciones de fabricación diferentes y el protocolo descrito aquí produce los mejores dispositivos para los cassettes enumerados en la tabla de materiales y reactivos. Si los investigadores utilizan un sistema de cassette alternativos, pueden encontr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.