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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
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  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Resumen

Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3' final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3' de un gen, el método tradicional de elección es 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE). Protocolos para 3' raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3' no traducida (3' UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3' UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3' UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3' RACE. Ampliado 3' RACE puede detectar inusual 3' UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3' UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.

Introducción

La formación del extremo 3' es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción1.

Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3' extremos3. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3' UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3' UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3'. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3' de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3' carrera sigue siendo el método de elección4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3' raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3' UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3' RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado4,6. 3' carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas4,7. Esto ha permitido 3' carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3' de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3' UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3' carrera que incluye grandes porciones de 3' UTR y regiones flanqueantes 5', es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5' a sus 3' extremo8.

Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3' RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3' UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento9. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3' UTR10, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3' RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3' UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3' RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3' UTR como la longitud de los 3' UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función13. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3' protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.

Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3' UTR 3', el PAS y el 3' final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.

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Protocolo

Usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad en todo momento mientras se realizan todos los procedimientos en el presente Protocolo. Asegúrese de que envases y tubos que contienen el reactivo de fenol y guanidina isotiocianato sólo se abren en una capilla certificada y disponer de los residuos de fenol en un contenedor designado. Utilizar reactivos, puntas y tubos estériles libre de DNasa/Rnasa.

1. cultivo celular

  1. Crecer la línea celular HeLa y dos suspensión manto linfoma de la célula líneas celulares, Granta-519 y Jeko-1, en DMEM con 10% FBS y 100 U/mL penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Diluir las células 1:10 y contar con un contador de partículas14.
  2. Para la extracción de RNA, la placa de 500.000 células/pocillo de una placa bien 6 (media de 2 mL por pozo). Después de la incubación por 24 h, recoger RNA de las células.

2. extracción de RNA

  1. Recolección de células
    Nota: Con excepción de la etapa de centrifugación, realice todos los pasos enumerados en una campana de cultivo de tejidos para mantener la esterilidad.
    1. Para las células de suspensión (Jeko-1 y Granta-519):
      1. Transferencia de las células (junto con 2 mL de medio) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 1.725 x g por 5 min aspirar los medios de comunicación y dejar el precipitado de células en la parte inferior del tubo.
      2. Resuspender el pellet celular en 50 μl de 1 x de tampón de fosfato salino (PBS). Añadir 500 μl del reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mezclar bien y dejar a temperatura ambiente (RT) por 5 min al invertir el tubo de microcentrífuga cada 1 minuto.
    2. Para células adherentes (HeLa):
      1. Aspire los medios de cultivo celular de cada pocillo. Añadir 1 mL de PBS a cada pocillo para limpiar escombros.
      2. Retirar el PBS y agregar 500 μl de reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada pocillo.
      3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con suave balanceo. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Lisis de la célula
    1. Congelación de la mezcla de células isotiocianato fenol y guanidina a-20 ° C durante 1 h.
      Nota: Puede dejar la mezcla a-20 ° C durante la noche o hasta que se necesite.
    2. Descongelar el fenol y guanidina isotiocianato celular la mezcla en hielo. Añada 100 μl de cloroformo en el tubo de microcentrífuga en una campana PCR. Vórtice de la muestra para s 10-15 hasta que la mezcla es color rosa y opaco. Incubar la muestra en hielo (a 4 ° C) durante 15 minutos.
    3. Centrifugue la muestra durante 15 min a 20.800 x g a 4 ° C. Cuidadosamente Remueva la fase acuosa incolora superior (~ 200 μL) y traslado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Precipitación de RNA
    1. Añadir un volumen igual de isopropanol a cada muestra. Añadir 1 μl de coprecipitant (véase Tabla de materiales) a cada uno para actuar como un portador para el RNA de la muestra y ayuda a visualizar el ARN en los pasos posteriores. Incubar la muestra a-80 ° C durante al menos 4 h. Para mejores resultados, incubar durante una noche a-80 ° C.
    2. Transferir la muestra a una centrífuga refrigerada. Centrifugar durante 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; el RNA aparece como una mota azul en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el isopropanol de la muestra. Añadir 500 μl de etanol al 80% y resuspender el precipitado con brevemente un vórtex durante 3 s.
    3. Centrifugar la muestra a 20.800 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el etanol de la muestra. Dejar la muestra secar por unos 10 minutos volver a suspender la muestra en 35 μl de agua libre de ARNasa. Colocar en un bloque de calor (65 ° C) durante 5 minutos para que el ARN sea completamente en solución y coloque inmediatamente el tubo en hielo.
    4. Determinar la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro como se describió anteriormente, excepto usar 1,5 μl de la muestra de RNA en lugar de 1 μl15. Opcionalmente, ejecute 1 μg de ARN total en gel de agarosa al 1% para determinar la integridad del RNA.

3. DNasa tratamiento

  1. Después de la cuantificación del ARN, realizar tratamiento de DNasa en el ARN total para degradar cualquier DNA genomic. Para cada muestra, añadir los siguientes reactivos del kit libre de Rnasa DNasa al hacer una reacción total de 20 μl mezclar en un tubo de microcentrífuga separados:
    1. Mezcle 2 μl de DNasa 10 X buffer de reacción con 4,4 μg de ARN total. Llevar a un total de 14 μl con agua.
    2. Añadir 2 μl de DNasa Rnasa-libre. Incubar a 37 ° C por 30 min en presencia de 2 μl de inhibidor de la Rnasa (desde el Kit de transcripción inversa).
    3. Añadir 2 μl de solución de parada y calor en un bloque de calor 10 min a 70 ° C para inactivar la enzima DNasa.
      Nota: El tratamiento de DNasa es opcional.

4. síntesis de cDNA

Para un volumen final de reacción de 50 μl:

  1. Para un volumen final de reacción de 50 μl: transferencia 22 μL de la ADNsa tratados RNA a un tubo nuevo o transferencia 4 μg de ARN total con agua hasta un volumen total de 22 μL a un tubo nuevo. Añadir 2 μl del primer T7 oligo dT25 solución de imprimación de 10 μm. La secuencia de la cartilla de T7 oligo dT25 es 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  2. De la transcripción reversa kit añadir 2 μl de inhibidor de la Rnasa (20 U/μL), 8 μl del buffer de reacción de 5 x, 4 μL de 10 mM dNTPs y 2 μl de la transcriptasa reversa (200 U/μL).
    Nota: Configurar una reacción sin transcriptasa inversa para actuar como un control negativo.
  3. Incubar a 42 ° C por 1 h. transferencia directamente al hielo. Calentar el tubo a 75 ° C por 5 min y coloque el tubo en hielo.

5. primer búsqueda de transcripción del gen de fusión

  1. Primer diseño
    1. Descargar la secuencia de cDNA desde el navegador de genoma conjunto (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar una región dentro de la ORF de la transcripción blanco (ANKHD1) aguas arriba del codón de parada. Copiar y pegar toda la región (hasta 700 nucleótidos) que contienen secuencias aguas arriba del codón de parada en la región de entrada de secuencia de lo software de diseño de la cartilla (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Seleccione la opción Mostrar todos los particulares y 10 para el número de cartillas que el sistema debe generar (resultados a devolver) y salen todos los otros parámetros fijados por defecto.
    3. Elija cinco cartillas hacia adelantados y dos cartillas inversos que no se superponen. Iniciadores de la orden y reconstituir con agua libre de DNasa/Rnasa a una concentración final de 10 μm. Más detalles sobre el diseño de la cartilla general de PCR están cubiertos en otra parte16.
  2. PCR para identificar potenciales cebadores para su uso en posteriores 3' RACE
    Nota: Para determinar los iniciadores avance finales en la reacción, pruebe los cebadores diseñados por establecer diferentes combinaciones de cebadores de adelante y atrás para regular PCR en una campana PCR.
    1. Transferir el cDNA (2 μL) a un tubo PCR de 0.5ml dulce. Añadir 1 μl del primer delantero y 1 μl del primer inverso (de una solución de imprimación de 10 mM). Hacer hasta 12.5 μl agregando 8,5 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 12.5 μl de 2 x Gel de PCR Master Mix.
    2. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmicas PCR: 95 ° C por 2 min seguida de 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 minuto Seleccione el final a 68 ° C por 7 min.
    3. Después de la polimerización en cadena, ejecute los productos en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio. Detalles de la electroforesis se describen previamente con unas cuantas modificaciones17.
      1. Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de tampón Tris acetato (TAE) en un matraz de 250 mL. Hervir en el microondas.
      2. Dejar enfriar durante 1 minuto y agregar 7,5 μl de solución de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL) en una campana de humos. Mezclar bien agitando el frasco y vierta en un aparato de gel horizontal. Dejar a temperatura ambiente en la campana por lo menos 30 minutos permitir que el gel se solidifique.
      3. Cubrir el gel con 1 x TAE tampón y cargar 10 μl del producto PCR en el gel de agarosa con 3-5 μl de la escala del peso molecular de ADN. Corren 175 V para 10 minutos visualizar los productos usando a un sensor y si se necesita más separación de productos, ejecutar el gel para un 5-10 minutos adicionales.
  3. Selección de primers anidados para 3' RACE
    1. Analizar los resultados del gel de agarosa PCR para seleccionar los iniciadores que tienen una banda distinta, fuerte, sola de PCR. Utilice la cartilla más 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') junto con la cartilla de25 oligodT T7 en la primera PCR ejecutar.
    2. Seleccione la cartilla anidada que se encuentra aguas abajo de la primera cartilla (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') y con la cartilla de T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') en el segundo conjunto de las reacciones de PCR.

6. optimización de 3' de carrera a los 3' UTR mediante dos enzimas diferentes

Nota: Ha habido un aumento en la diversidad de las polimerasas de la DNA utilizada para PCR; por lo tanto, quisimos determinar condiciones estándar que pueden aplicarse incluso cuando se utiliza diferentes enzimas para 3' reacciones de PCR de raza. Los cebadores de reversos para cualquier transcripción se mantienen constantes; los únicos cambios son en los cebadores anidados adelantados que son específicos para la transcripción de destino.

  1. Protocolo 1:3 ' usando una ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu) de la raza
    1. Primera PCR
      1. 1 μl de cDNA de transferir a un tubo PCR y añadir 5 μl de tampón de reacción de Pfu de x 10. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada, 1 μl del primer T7 oligodT25 y 1 μl de dNTPs (de una solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl total volumen añadiendo 40 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu y mezclar bien. Ejecute la polimerización en cadena usando el perfil de la polimerización en cadena en la tabla 1.
    2. Segunda PCR
      1. Transferir 2 μl de los productos de la PCR primer a un nuevo tubo PCR y mezclar con 5 μl de 10 x PfuUltra II reacción tampón. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada, 1 μl del primer T7 y 1 μl de dNTPs (solución 10 mM).
      2. Hacer hasta 49 μl reacción total volumen añadiendo 39 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu . Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 1).
  2. Protocolo 2:3 ' carrera usando una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión a ADN fusionado a un Pyrococcus-como corrección de la mezcla principal de la polimerización en cadena de polimerasa
    1. Primera PCR
      1. Transferencia de 1 μl de cDNA en un tubo PCR. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada y 1 μl de la cartilla de25 oligodT de T7. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua.
      2. Añadir 25 μl de 2 x PCR Master Mix y mezclar bien. Utilizar las condiciones PCR ciclo descritas en la tabla 2.
    2. Segunda PCR
      1. Transferencia de 2 μl de los productos de la PCR primera a un nuevo tubo PCR. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada junto con 1 μl del primer revés T7.
      2. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua. Añada 25 μl de 2 X PCR Master Mix. Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 2).

7. Verifique que el segundo producto PCR de 3' de carrera.

  1. Tomar 5-10 μl de la segunda producto de la polimerización en cadena (como producto de la primera ronda de PCR si la transcripción se expresa abundantemente) y correr en un gel de agarosa. Configurar el gel y correr la electroforesis como se describió anteriormente (pasos 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizar los resultados en un reproductor de imágenes.

8. secuenciación y purificación del producto

  1. Purificar los productos PCR del gel de la segunda polimerización en cadena usando el Gel y sistema de limpieza de ADN PCR fragmento según protocolo del fabricante.
  2. Realizar Sanger secuenciación (alternativamente, enviar el gel purificada muestras de productos PCR y secuenciación adecuados primers a un laboratorio de secuenciación). Analizar los datos de la secuencia después Sanger secuenciación.
  3. Descargar software de análisis de secuencia (véase Tabla de materiales) e importar los archivos de trazas en el software. Uso el QVs individuales de Base puro (valores de calidad) para obtener la Base llamada información18. Descargar el cromatograma con rastros de alta calidad para la visión.
    Opcional: El producto purificado de gel puede ser clonado utilizando un kit de clonación adecuado y los clones aislados para Sanger secuenciación.

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Resultados

Búsqueda anidada Primer avance:

El gel de agarosa de La figura 1 muestra dos distintas gel productos de la PCR (carriles 1 y 2) que utilizan la misma adelante cartilla pero diferentes primers inversas. Carril 3 tiene un producto PCR distinto y distinto primer avance y retroceso. Los iniciadores ideal a utilizar para la reacción de PCR basado en son los que dan un producto PCR diferen...

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Discusión

A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3' carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3' carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3' UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3' RACE es que con algunas adaptaciones ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer a Bettine Gibbs por su ayuda técnica.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa cellsATCCCCL-2Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cellsATCCCRL-3006Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cellsDSMZACC-342Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF6178Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/StreptomycinThermoFisherScientific15140122Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlueAmbionAM9545Coprecipitant.
DMEMThermoFisherScientific10569044Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-WaterThermoFisherScientificAM9938Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SolutionCorning21-0301X PBS.
ChloroformSigma  AldrichC7559-5VL
2-propanolSigma AldrichI9516
Reagent AlcoholSigma Aldrich793175Ethanol
Ethidium Bromide solutionSigma AldrichE1510
TRIzol ReagentThermoFisherScientific15596026Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master MixAmrescoN8672X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTPAmrescoN557
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM6101Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)New England BioLabsB7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF bufferThermoFisherScientificF531S2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymeraseAgilent Technologies600670Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo FischerK1691Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder5 Prime2500360Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha InnotechUsed to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight LadderNew England BioLabsN3233LMolecular weight DNA ladder.
Vortex MixerMidSciVM-3200
Mini CentrifugeMidSciC1008-R
Dry BathMidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000CSpectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBioRad1704469Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Power supply for gel electrophoresis.
AgaroseDot ScientificAGLE-500
Mastercycler GradientEppendorf950000015PCR thermocycler.
CentrifugeEppendorf5810 R
CentrifugeEppendorf5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up SystemPromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cellsThermoFisherScientificK280020
MyPCR Preparation Station MystaireMidSciMY-PCR24Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hoodThermoFisherScientificFume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle CounterBeckman Coulter6605698Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)Software to analyze Sanger sequencing data.

Referencias

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Reimpresiones y Permisos

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