Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Resumen

Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Resumen

Terapia de células madre se ha convertido en una carrera emocionante terapéutica, pero el método óptimo de entrega es incierto. Mientras que la técnica de microinyección se ha utilizado durante décadas para proporcionar células madre en modelos de ictus, esta técnica está limitada por la falta de capacidad para manipular las células madre antes de la inyección. Este artículo detalla un método de usar un andamio de polímero conductivo para la entrega de la célula de vástago. Estimulación eléctrica de las células madre utilizando un andamio de polímero conductor altera la supervivencia celular, respuesta inflamatoria y remodelación sináptica en los genes de la célula de vástago. Después de preacondicionamiento eléctricos, las células madre en el andamio se trasplantan intracranially en un modelo de rata de oclusión distal de la arteria cerebral media. Este protocolo describe una técnica poderosa para manipular las células madre a través de un andamio de polímero conductor y crea una nueva herramienta para desarrollar terapia basada en células madre.

Introducción

Accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte en el mundo y la quinta causa de muerte en los Estados Unidos. A pesar de estas tasas de mortalidad altas, tratamientos para la recuperación del derrame cerebral en la actualidad siguen siendo un desafío no viables opciones médicas disponibles en la actualidad¹. Hay actualmente sobre 300 ensayos clínicos relacionados con accidentes cerebrovasculares isquémicos, de los cuales sólo 40 utilizar células madre. Estudios previos han demostrado que terapias con células madre tienen un efecto beneficioso sobre tiempos reparación^2,3. Factores paracrinos como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la tromboespondina-1 (THBS-1) liberado de las células progenitoras neurales humanas trasplantadas (hNPCs) han demostrado mejor recuperación funcional a través de mecanismos asociados con un aumento en formación, angiogénesis, ramificación dendrítica y nuevas proyecciones axonales de la sinapsis, así como modular el sistema inmune^4,5,6. Sin embargo, los métodos de entrega óptima de las células madre permanecen fuera de alcance.

Entrega exitosa la célula de vástago en el cerebro sigue siendo un desafío. En la actualidad, hidrogel inyectable y sistemas de andamios poliméricos se han introducido para proporcionar células madre. Estos métodos de entrega protegen células madre durante el trasplante, así como ofrecen protección contra el ambiente áspero del poste-movimiento como respuesta inflamatoria del hospedador y condiciones hipóxicas^{7,8,9 , 10}. sin embargo, los materiales más comúnmente usados son inertes, que limita el uso de modulación continua (es decir, estimulación eléctrica) de la células¹¹. La estimulación eléctrica es una clave que influye en la diferenciación, densidad de canales de iones y consecuencia del neurite de células madre¹². En comparación con polímeros inertes, polímeros conductores pueden llevar un actual lo que permite la estimulación eléctrica y la manipulación de células madre². Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la estimulación eléctrica modula la liberación de factor neurotrófico (es decir, BDNF y THBS-1) es todavía no explorado.

En este protocolo, describimos los pasos para construir un sistema de cultivo celular que consiste en un andamio de polímero conductor, polypyrrole (PPy), que permite en vitro la estimulación eléctrica. Debido a la forma en que está fabricado el sistema de cultivo celular, es posible la implantación posterior del andamio sembrado de células sobre la corteza peri infarto. Para este sistema, nos requisito eléctricamente las células madre en el andamio para un corto período de tiempo antes de la implantación. Después de la estimulación eléctrica, el andamio de polímero conductor llevando las células es implantado con éxito intracranealmente mediante un método mínimamente invasivo.

Protocolo

Todas las células y procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de supervisión de investigación de la célula de vástago de Stanford y por el Panel administrativo de la Universidad de Stanford en laboratorio Animal Care (SCRO-616 y APLAC-31909).

1. de la aguafuerte del vidrio de ITO

1. Preparar el óxido de estaño indio (ITO)-portaobjeto cubierto mediante la colocación de un agente de enmascaramiento sobre el lado del conductor del vidrio.
   Nota: Cintas transparentes más comerciales pueden utilizarse como un agente de enmascaramiento.
   1. Quitar la máscara exceso usando una hoja, dejando solamente la forma deseada del diseño ITO final cubierto en el cristal.
2. Mezcle 5% (v/v) de ácido nítrico y 45% (v/v) de HCl en un matraz de vidrio dentro de una campana de humos para preparar la solución de la aguafuerte.
   1. Utilizar una placa y un termómetro para asegurar que la temperatura de la solución de la aguafuerte se mantiene a 70 ° C.
3. Una vez que la solución de la aguafuerte alcanza los 70 ° C, coloque el portaobjetos de vidrio de ITO enmascarado en la solución por 2 minutos eliminar la capa de ITO exceso.
   Nota: Masking Tape protege la capa de ITO de la exposición a la solución de ácido.
4. Quitar la corredera de la solución y enjuague con desionizada (DI) H₂O.
5. Retire con cuidado la máscara y medida resistencia con un multímetro para asegurarse de que el ITO restante está intacta. Lecturas de la zona grabada deseada deben ser aproximadamente 0 Ω.

2. preparación de solución de pirrol

1. En una botella de vidrio de 1000 mL, disolver 70 g de dodecylbenzenesulfonate del sodio (NaDBS) en 600 mL de DI H₂O.
2. Una vez que el NaDBS es disuelto, añadir 14 mL de 0,2 M pirrol y 386 mL de DI H₂O a la solución.
3. Cubrir la solución con papel de aluminio y almacenar a 4 ° C.

3. electrochapado de Polypyrrole en vidrio de ITO

1. Caliente la solución de pirrol a temperatura ambiente hasta que NaDBS es completamente se redisuelve.
   Nota: Esto toma unos 15 a 20 minutos.
2. Vierte 25 mL de la solución de pirrol en un vaso de precipitados.
3. Conectarse el vidrio ITO de un multímetro y sumerja el portaobjetos en la solución de pirrol.
   1. Asegúrese de que el lado con resistencia Ω 0 es hacia el electrodo de referencia de malla de platino.
4. Aplicar una corriente eléctrica para iniciar la galvanoplastia de PPy en la superficie de ITO con un multímetro (corriente controlado a 3 mA/cm² durante 4 horas).
5. Saque el vidrio de ITO el multímetro y lavar electroplated-PPy en DI H₂O para eliminar agente tensioactivo residual.
6. Separe suavemente la placa PPy electrochapado del vidrio de ITO con una cuchilla de afeitar.
   1. Guarde la placa del PPy a temperatura ambiente.

4. elaboración de polidimetilsiloxano (PDMS)

1. Usando una espátula y un plato de pesaje, mezcla de 18 g de agente de base con 2 g de agente de curado y vierta la mezcla en moldes de cristal dos de 10 x 8 cm.
2. Quite las burbujas de los moldes utilizando una cámara de vacío durante 15-20 minutos.
3. Coloque los moldes en un horno de 70 ° C durante 3 h.
4. Una vez fríos, use una espátula plana para quitar los PDMS de los moldes.

5. fabricación de la cámara de estimulación eléctrica In Vitro

1. Autoclave de las chapas (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) y flujo de las válvulas a 120 ° C durante 1 hora.
2. Con una diapositiva de la cámara como una plantilla, corte dos pedazos de PDMS.
   Nota: Una sola pieza de PDMS sirve como el perímetro de la cámara del celular con los recortes de dos cuadrados adyacentes de dentro de la cámara del celular. La otra pieza PDMS es un contorno del perímetro de la cámara.
   1. Cortar el interior cámara de celular para que sea cuadrado en forma de y coincide con la forma de la cámara del celular. Asegúrese de que la forma general de ambas piezas de PDMS es rectangular y coincide con el de la diapositiva de la cámara.
3. Los materiales de la capa siguiente de abajo hacia arriba: (1) placa de Metal (2) PDMS (sin recortes), (3) PPy placa (perpendicular a PDMS), (4) PDMS (con los recortes) y la cámara del celular (5).
4. Empotrar el aparato una vez que está totalmente alineada.
5. Cortar dos piezas de 60 cm de un alambre de metal y pasta de plata para conectar un cable a cada extremo de la placa de PPy que sobresale desde el exterior de la cámara. Asegúrese que los cables sean lo suficientemente largos que se extiende desde el aparato hacia el exterior de una incubadora.
6. Una vez que la pasta de plata es curada, reforzar y sellar la conexión de cable con epoxy.
   1. Expediente de la resistencia con un multímetro para asegurarse de que el campo aplicado es el mismo en cada cámara.
   2. Para la implantación, quitar los cables; Suelte las cámaras de celular y PDMS y luego ellos separan el andamio conductivo. La dimensión de las matrices de soporte implantados es de aproximadamente 1 mm x 3 mm x 0,25 mm.

6. revestimiento humano células progenitoras neuronales (hNPCs) en PPy

1. Esterilizar las cámaras reunidas bajo la luz UV durante 2 horas.
   1. Después de 1 hora, gire el montado cámaras de 90°.
2. Después de la esterilización, capa de la superficie del PPy en la parte inferior de la cámara con 800 μl de un substrato de capa y permitir que el sustrato solidificar en la placa de PPy en una incubadora a 37 ° C en 5% CO₂ para 1 h.
3. Después de 1 hora, retire el sobrenadante de cámaras y enjuague suavemente con 1 mL de DPBS + Ca + Mg por pozo.
   Nota: Evite lavar la superficie del PPy con fuerza ya que el desprendimiento del sustrato de la capa.
4. Medios celulares frescos, disocian mecánicamente las células cultivadas para su uso con las cámaras de una placa de cultivo de tejidos con pipeteo suave.
   Nota: Las células deben ser confluente de 90-100% a la disociación.
5. Recoger pastillas hNPC mediante centrifugación a 8000 x g durante 5 minutos.
6. Utilizando un hemocitómetro, cuenta y resuspender las células en un volumen de 100.000 células/cm².
7. Placa de 100.000 células en cada cámara bien (100.000 células/cm² en 1 mL de medio).
8. Volver cámaras a la incubadora a 37 ° C en 5% CO_2.

7. electroestimulación de hNPCs

1. Un día después de la siembra de las células en las cámaras, utilizar un generador de forma de onda a aplicar estimulación eléctrica a las células.
2. Antes de la estimulación, retire media vieja de cada cámara bien y reponer con 800 μl de medio fresco.
3. Después de cambiaron los medios de comunicación, coloque la cámara en la incubadora, extender los cables fuera de la incubadora y conecte a un generador de forma de onda
4. Aplicar el estímulo a las células con una señal de onda cuadrada en ±400 mV con 100 Hz por 1 h.
5. Después de la estimulación, quitar los cables e incubar las cámaras para otro día en una incubadora a 37 ° C con 5% CO₂.
6. Realizar posteriores análisis biológicos, incluyendo la viabilidad de las células y la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) siguiendo el protocolo del fabricante.

8. implantación de PPy en Vivo

1. Realizar modelos de movimiento de Oclusión arteria cerebral media distal (dMCA) en deficiencia de células T ratas desnudas macho adulto (NIH-RNU 230 ± 30 g) como describen anteriormente². Realizar oclusión de implantación una semana post-dMCA.
2. Un día antes de la cirugía, dar ampicilina (1 mg/mL) a las ratas en el agua de la jaula.
3. Anestesiar la rata en una cámara de inducción usando 0.5 - 3% mg/kg de isoflurano administrado por inhalación.
4. Confirmar la anestesia de la rata por la falta de respuesta reflejo de pellizco del dedo del pie.
   1. Mientras el animal está bajo anestesia, continúe visualizándolo su membrana color, patrón respiratorio y temperatura rectal cada 15 minutos.
5. Una vez confirmada la anestesia, aplicar lágrimas artificiales en los ojos de rata para evitar la sequedad.
6. Asegurar que se mantenga una técnica aséptica durante este procedimiento utilizando guantes estériles y paño quirúrgico estéril¹³. Mantener el instrumental quirúrgico estéril dentro de un campo estéril.
7. Mientras que la rata está bajo anestesia, perfore una craniectomía sobre la corteza izquierda. Abrir la duramadre.
   1. Retirar la duramadre del cerebro usando una aguja quirúrgica micro-fina.
8. Implante los conductoras andamios del sistema in vitro sobre la corteza de la rata.
   Nota: Para nuestros experimentos, hemos implantado andamios en vitro día 3 después de hNPC chapado.
   1. Colocar el implante sobre todo en la penumbra corteza medial a la lesión de accidente cerebrovascular.
9. Después de coloca el andamio, colocar surgicel sobre el implante para prevenir el movimiento con el cierre de la piel.
10. Sutura la herida cerrada e inyectar por vía subcutánea las ratas con SR de buprenorfina a dosis de 1 mg/kg para manejar el dolor asociado con la cirugía estereotáctica y la obstrucción de la dMCA.
11. Colocar la rata en una jaula de recuperación como recupera la conciencia.
    1. Nunca descuide el animal mientras está inconsciente.
    2. No coloque el animal con otros hasta que se ha ganado totalmente el sentido.
12. Vigilar animales diariamente para detectar signos de dolor incluyendo pérdida de peso corporal, ingesta disminuida de alimentos y agua, reducida capa arreglo desarreglado, disminuido, aumentado la actividad espontánea, postura anormal, deshidratación, piel acampar, ojos hundidos, ocultar, uno mismo-mutilación, respiración rápida, respiración de boca abierta, fasciculaciones, temblor, temblor y vocalización.
    1. Monitorear los animales todos los días hasta que se vea que son comer, beber, aseo personal y aumentar de peso; y luego semanal después de aumento de peso.
13. Euthanization temprana mediante inhalación de CO₂ y la confirmación secundaria de euthanization (para el animal no revivirá debido al CO₂ inhalación de oxígeno normal suministro post) ocurrirá a cualquier animal que parece ser no comer, beber y aumentar de peso después del procedimiento quirúrgico inicial; aparece en el dolor; o aparece incapaz de completar las pruebas de comportamiento debido a una mayor de lo esperado déficit motor de la corteza.

Resultados

El esquema que se muestra en la figura 1 representa el flujo de trabajo general de la estimulación eléctrica de hNPCs y posibles aplicaciones posteriores. Una limitación actual en terapia de células madre es que las células madre están expuestas a un ambiente áspero de poste-trasplante incluyendo inflamación y condiciones isquémicas. Estas difíciles condiciones que puedan limitan su eficacia terapéutica^14,

Discusión

Creciente evidencia ha demostrado la promesa de las células madre como terapia de movimiento nuevo. Esta promesa ha dado lugar a un importante esfuerzo para avanzar en la terapéutica de células madre a la cabecera del paciente con al menos 40 ensayos clínicos completados o en curso. Patología cerebrovascular ofrece un único trastorno neurológico que se presta a la terapia de células madre porque después de la injuria aguda, no existe ningún proceso de neurodegenerativas prevención recuperación. El mecanismo e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706