Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

Resumen

En este estudio, nanomateriales antimicrobianos fueron sintetizados por oxidación ácida de nanotubos de carbono pirólisis y posterior deposición reductiva de nanopartículas de plata. Se realizaron pruebas de actividad y la citotoxicidad antimicrobianas con los nanomateriales como preparado.

Resumen

En este estudio, los nanotubos de carbono multipared (ello) fueron tratados con una solución acuosa de ácido sulfúrico para formar un grupo funcional a base de oxígeno. Ello plata fueron preparado por la deposición reductiva de plata de una solución acuosa de AgNO₃ en ello oxidado. Dado el color único de los CNTs, no era posible aplicar a la concentración mínima inhibitoria o ensayos de toxicidad mitocondrial para evaluar las características de toxicidad y antibacteriana, ya que pueden interferir con los ensayos. La zona de inhibición y la concentración bactericida mínima para la Ag-ello se midieron y análisis de azul de tripano y vivos/muertos se utilizaron para medir las características de toxicidad y antibacteriano sin interferir en el color de los CNTs.

Introducción

El objetivo de este estudio es hacer medio ambiente nanomateriales antibacteriano que pueden inhibir el crecimiento de bacterias forma biofilms. Estos nanomateriales antibacterianos tienen el potencial para superar los problemas de resistencia de toxicidad y antibiótico de antibióticos compuestos químicos o de productos químicos comúnmente usados. Un biofilm es una sustancia polimérica extracelular hidratada (EPS) que se compone de polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos^1,2. Biopelículas protegen la entrada de sustancias extrañas y ayudan a las bacterias a crecer vigorosamente^3,4. Biofilms provocan olor y enfermedades infecciosas crónicas^5,6. Methylobacterium spp., por ejemplo, crece adhiriéndose a lugares donde el agua está siempre presente o donde es difícil garantizar la Erradicación bacteriana en una base continua, como intercambiadores de calor de aire acondicionado, duchas y sanitarios. Estos tipos de biofilms provocan olor y enfermedades infecciosas crónicas^5,6.

Normalmente, se utilizan productos químicos o compuestos químicos antibióticos para inhibir el crecimiento de bacterias que forman biopelículas. La aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y las preocupaciones sobre seguridad en vivo de los productos químicos están impulsando la necesidad de desarrollar nuevos materiales para prevenir la formación de biofilms y para inhibir el crecimiento de bacterias.

En este estudio, se sintetizan nanomateriales antimicrobianos que están libres de toxicidad y resistencia a los antibióticos. La plata es una sustancia antimicrobiana conocida, y los acontecimientos recientes en la Nanociencia y la nanotecnología han llevado a investigación sobre los efectos antimicrobianos de nanopartículas de metal^7,8. Estudios recientes han informado que el pequeño tamaño y alta relación superficie a volumen de las nanopartículas como resultado aumento de la actividad antibacteriana^9,10,11.

Los nanomateriales presentados combinan nanopartículas de plata con nanotubos de carbono con un alto cociente de aspecto, lo que aumenta el área superficial por unidad de volumen y aumento de propiedades antimicrobianas. El compuesto de plata fabricado en carbono nanopartículas nanotubos presenta importantes propiedades antimicrobianas y mínima toxicidad para las células humanas y animales. Los procesos sintéticos en estudios anteriores utilizan peligrosos agentes reductores como el NaBH₄, formamida, dimetilformamida e hidracina. El proceso es complicado, peligroso y desperdiciador de tiempo. El proceso sintético registrado aquí utiliza etanol como agente reductor significativamente menos peligroso.

Se midieron la zona de inhibición y la concentración bactericida mínima (CBM) para el Ag-ello; Vivo/muerto y ensayos de azul de tripano fueron utilizados para medir la toxicidad y propiedades antibacterianas. Concentración mínima inhibitoria (CMI) y ensayos de toxicidad mitocondrial (MTT), no se realizaron debido al color inusual de los nanotubos de carbono que habría interferido con los ensayos. Finalmente, se determinó la concentración mínima para prevenir el crecimiento de Methylobacterium spp sin afectar a células de mamíferos.

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Protocolo

1. MWCNT oxidación

1. Miden 30-50 mg de MWCNT en un frasco de 50 mL. Agregar lentamente 8 mL de H₂hasta₄: solución HNO₃ (concentración inicial de 90%, 3:1 vol/vol) con una pipeta con puntas de pipeta de 1 mL.
   PRECAUCIÓN: Esta preparación debe realizarse en una campana de humos químicos.
   1. Deje 30 minutos para la reacción exotérmica completar.
2. Someter a ultrasonidos la solución a 60-80 ° C y 160 W durante 1 hora hasta MWCNT se instala en la parte inferior del frasco.
   PRECAUCIÓN: El nivel del agua en el sonicador debería ser inferior a la parte superior del frasco para que no se le introduce agua en el frasco.
3. Transferir la solución a un tubo de centrífuga.
   1. Con una micropipeta, agregar 30 mL de agua destilada gota a gota a la solución de MWCNT-COOH.
      PRECAUCIÓN: Una fuerte reacción exotérmica ocurre durante la adición de agua destilada. Agregar agua destilada poco a poco y dar tiempo para el enfriamiento.
4. Centrifugue la solución MWCNT-COOH a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos.
   PRECAUCIÓN: Al utilizar una centrífuga, garantizar la centrifugadora equilibrada mediante la colocación de un tubo con el mismo peso frente al tubo de muestra.
5. Quite el sobrenadante con una pipeta y pipeta de 1 mL. Añadir 5 mL de etanol con una pipeta y pipeta de 1 mL. Enjuague las paredes del frasco con etanol pipeteado adicional. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos.
   1. Determinar el pH del sobrenadante con papel pH. Repita el lavado y centrifugar hasta que el sobrenadante pH es neutro.
6. Retire el sobrenadante de todos. Añadir 1 mL de agua destilada para precipitar y MWCNT-COOH se dispersan uniformemente en la solución. Congelación en solución a-60 ° C en vacío hasta que se seque.

2. deposición de nanopartículas plata en ello

1. 10 mg de MWCNT-COOH en un tubo cónico de 50 mL y diluir con 30 mL de agua destilada. Someter a ultrasonidos solución a 60 ° C y 160 W durante 1 hora.
2. Coloque 6 mL de 0.1 N de AgNO₃ en un tubo cónico de 50 mL y diluir con 18 mL de agua destilada. Someter a ultrasonidos solución a 60 ° C y 160 W durante 1 hora.
   Atención: Añadir AgNO₃ en proporción a la masa total de ello tal que la masa total de Ag no exceda del 20%.
3. Añadir gota a gota la solución de AgNO₃ a la solución de ello con una pipeta y pipeta de 1 mL mientras sonicando la mezcla a 60 ° C y 160 w. continuar sonicando durante 1 h después de añadir el de AgNO₃.
4. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos y eliminar el sobrenadante. Centrifugar la solución y eliminar el sobrenadante dos veces más.
5. Añadir 1 mL de agua destilada a la mezcla de Ag-ello y dispersar el precipitado en la solución. Añadir 5 mL de etanol y permitir la reacción proceder a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Centrifugue la solución a 12.000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos y eliminar el sobrenadante.
7. Determinar el pH del sobrenadante con papel pH. Repita el lavado y centrifugar hasta que el sobrenadante pH es neutro.
8. Añadir 1 mL de agua destilada a Ag-ello y dispersar uniformemente en la solución. Congelación de la solución a-70 ° C en vacío durante 24 horas.

3. zona de inhibición de la prueba

1. Mezclar 18,12 g de agar R2A y 1 L de agua destilada en un matraz. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
2. Permita que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Colocar 10 mL de gel en placas de Petri antes de endurecer para preparar el medio sólido.
3. Coloque 100 μl de las bacterias en medio sólido. Trasmitir las bacterias en el medio sólido, utilizando un esparcidor.
   PRECAUCIÓN: Este procedimiento debe realizarse en una campana de vapores químicos, iluminada con una lámpara de alcohol.
4. Incubar las placas a 30 ° C por 48 h.
5. Mezcla de 3,12 g de R2A caldo con 1 L de agua destilada en un matraz. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
6. Transferir las colonias crecidas en un medio líquido mediante un bucle y aguja e incubar en una incubadora a 180 rpm y 30 ° C.
7. Registre el valor de OD (densidad óptica) por espectrofotometría UV a 600 nm en una base por hora para medir el crecimiento bacteriano.
   Nota: Se utilizó agar R2A en esta prueba, en lugar de agar Mueller-Hinton estándar, porque R2A es el recomendado: agar para crecimiento de Methylobacterium spp.
8. Lugar 10 mL de agar de R2A preparado en una caja Petri para preparar un agar de fondo.
   1. Mezcla de 3,12 g de caldo de R2A y 8 g de agar con 1 L de agua destilada. Esterilizar la mezcla en un autoclave a 121 ° C durante 15 min lugar 10 mL de este gel en el agar de la parte inferior.
9. Carga de 50 μl de solución de Ag-ello sobre disco de papel estéril con una micropipeta.
   1. Secar y esterilizar ello Ag muestra en una cámara de vacío bajo UV luz durante 30 minutos.
10. Lugar Ag-ello muestra en el agar.
11. Incubar la placa de agar a 30 ° C durante 48 h.
12. Zona de medida de inhibición¹².
    Nota: Se incluyen instrucciones para el software utilizado en las referencias.

4. prueba antibacteriano

1. Repita los pasos 3.1 a 3.7 para preparar cultivo bacteriano.
2. En OD máximo, inocular 100 μl de las bacterias en 3 mL de medio líquido fresco con una punta de pipeta micro pipeta y 100 μl.
3. Preparar cinco 50 muestras μl de la solución de control en tubos cónicos de 15 mL. Agregue lo siguiente a cada tubo: 1) metanol; 2) 1000 μg/mL MWCNT-COOH; 3) 50 μg/mL Ag-ello; 4) 40 μg/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 μg/mL Ag-ello.
4. Incubar a 30 ° C y 180 rpm hasta que el control es máximo activo determinado por espectrofotometría UV como se describió anteriormente.
5. Medir el valor de OD de cada muestra y calcular la concentración de MIC. El valor de OD está directamente relacionada con el número de células bacterianas en el caldo de la muestra.
6. Trasmitir las bacterias cultivadas en un medio sólido con un esparcidor.
7. Incubar la placa a 30 ° C por 48 h.
8. Recuento de colonias bacterianas y los valores de UFC de medida para determinar la actividad antibacteriana¹².
   Nota: Se incluyen instrucciones para el software utilizado en las referencias.

5. Análisis de viabilidad de

1. Después de quitar las células de cultivo de la incubadora, el medio de la succión y lavar tres veces con un lavado gota a gota 5 ml de PBS.
2. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA en PBS a la célula de lavado y succión después de 1 minuto.
   1. Toque en la placa para eliminar las células pegadas.
3. Añadir 5 mL de DMEM (medio modificado Eagle de Dulbecco) y luego retire las células. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 3 minutos y retirar el sobrenadante.
   1. Añadir 1 mL de DPBS y mezclar.
   2. Contar las células en 10 μl de la solución con una máquina automatizada de conteo de células.
      Nota: Se incluyen instrucciones para la máquina de conteo celular utilizado en las referencias¹³.
4. Lugar 1 × 10⁵ de AML12 células por pocillo en una placa de seis pozos que contengan solución DMEM. El medio contiene 10% (v/v) de suero fetal bovino y antibiótico estéril 1%.
5. Incubar la placa de 8-12 h a 37 ° C en un ambiente de aire 95% 5% CO₂.
6. El sobrenadante de los pozos con un aspirador de succión.
   1. Agregar cada muestra conformada de 30-40 μg/mL Ag MWCNT a 1 mL de DMEM, NMS-DMSO (dimetil sulfóxido) y control.
   2. Incubar a 37 ° C en un ambiente de aire 95% 5% CO₂para 8 h.
7. Eliminar el sobrenadante y lavar las muestras con 5 mL de PBS.
8. Añadir 1 mL de preparado kit live/dead (20 μl de 2 mM EthD-1 con 5 μl de 4 mM calceína AM en DMSO en 10 mL de PBS) gota a gota a la celda.
9. Incubar a colocados durante 30-45 min o 37 ° C durante 10 minutos la fluorescencia medida con microscopía de fluorescencia estándar en 100 X o 300 X.

6. ensayo de azul de tripán

1. Preparar las muestras según pasos 5.1 a través de 5.6.2 arriba.
2. Eliminar el sobrenadante.
3. Lave la placa con 1 mL de 1 x DPBS y decantar.
4. Añadir 1 mL de tripsina de la placa e incubar durante 3 min separar las células de cultura. Utilizar medio de cultivo celular que lave la placa y recoger las células. Colocar células colectadas en un tubo de 15 mL.
5. Centrifugar el tubo a 200 x g y 4 ° C por 3 minutos.
6. Deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de medio fresco a pellets celulares y volver a dispersar las células.
7. Añadir 10 μl de azul tripán con 10 μl de células dispersas y contar las células con una máquina automatizada de conteo de células.
   Nota: Se incluyen instrucciones para la máquina de conteo celular utilizado en las referencias.

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Resultados

Imágenes de microscopía electrónica (TEM) de transmisión confirman la formación de Ag-ello (figura 1A y 1B). Su síntesis exitosa fue confirmada por el cambio en la carga de superficie. Se calculó el tamaño de las partículas de Ag en el ello (figura 1). El tamaño de partícula promedio fue aproximadamente 3.83 nm. El patrón de DRX de la Ag-ello sintetizado como se muestra en la fig...

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Discusión

Aquí, Divulgamos un método simple para la preparación de ello con nanopartículas de Ag depositadas. Este nanomaterial con plata demuestra actividad antibacteriana substancial y mínimo potencial de absorción incontrolada de nanopartículas de plata en el cuerpo. Demostramos que 30 μg/mL de Ag sintetizado-ello es un nivel eficaz de actividad antibacteriana contra Methylobacterium spp con la insignificante citotoxicidad a hepatocitos de mamífero. Aunque mejoras adicionales y evaluaciones de bioseguridad par...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 N silver nitrate	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Carbon nanotube, multi-walled	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A broth	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC