Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Resumen

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Resumen

La evaluación de las vacunas de subunidad moderna revela que la generación de anticuerpos neutralizantes es importante pero no suficiente para la selección del adyuvante. Por lo tanto, están urgente adyuvantes con capacidades inmuno-estimuladora humorales y celulares que son capaces de promover respuestas citotóxicas de los linfocitos (CTL) T. Así, el fiel seguimiento de candidatos de adyuvante que inducen reactividad cruzada y posteriormente aumentar la generación de CTL representa un paso crucial en el desarrollo de una vacuna. Aquí presentamos una aplicación de un método que utiliza SIINFEKL específicos (OT-I) las células T para controlar la presentación cruzada del modelo antígeno ovoalbúmina (OVA) en vivo en la presencia de candidatos de diferentes adyuvantes. Este método representa una prueba rápida para seleccionar adyuvantes con las mejores capacidades de reactividad cruzada. La proliferación de CD8⁺ T las células es la más valiosa indicación de reactividad cruzada y también es considerado como un correlato de presentación cruzada inducida por adyuvante. Esta característica puede ser evaluada en diversos órganos inmunes como los ganglios linfáticos y el bazo. También puede supervisar el grado de la generación de CTL, que dando ideas sobre la naturaleza de un local (nodo de linfa de drenaje principalmente) o una respuesta sistémica (distante de los ganglios linfáticos o bazo). Esta técnica además permite múltiples modificaciones para probar fármacos que pueden inhibir vías específicas de presentación cruzada y también ofrece la posibilidad de ser utilizado en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente y convencionales. En Resumen, la aplicación que presentamos aquí será útil para los laboratorios de la vacuna en la industria o la academia que desarrollaran o modificar químicos adyuvantes de la vacuna investigación y desarrollo.

Introducción

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que las vacunas son fundamentales intervenciones terapéuticas que se han desarrollado para luchar contra a ciertos tipos de cáncer¹. También son importantes las vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares²CTL. Por otra parte, CTL son uno de los pocos mecanismos de defensa inmunes funcionalmente activos en poblaciones de riesgo como neonatos^3,4 quien también dependen de CTL para luchar contra la temprana vida infecciones⁵. En este sentido, las vacunas contra el Virus sincitial respiratorio (VSR) que fueron desarrolladas con un adyuvante que no provocan respuestas CTL (alumbre) resultaron en un fracaso de la vacuna lleva a serias complicaciones con infecciones en recién nacidos⁶. Estos efectos negativos de la vacunación pueden invertirse por una CD8⁺ de respuesta de la célula de T⁷. Previamente hemos demostrado que las citoquinas principales (tipo interferones de I) sacadas por algún estimulador de agonistas (aguijón) los genes de interferón son esenciales para las respuestas CTL generadas por estos adyuvantes⁸, en parte por la medición de la proliferación de OT-I T las células después de la vacunación y usar estos resultados como una medida de CTL inducen las capacidades observadas en extendieron vacunación horarios⁹. La medición de la proliferación de OT-I CD8⁺ T las células en un ratón receptor de tipo salvaje (WT) C57BL/6 por carboxyfluorescein succinimidyl tinte de éster (CFSE) dilución es una estimación robusta de la capacidad de los adyuvantes de una vacuna para generar reactividad cruzada de SIINFEKL, (el péptido inmuno-dominante de ovoalbúmina, óvulos). Variaciones de esta técnica están ampliamente utilizadas para la evaluación de la proliferación de OT-I CD8⁺ y OT II CD4⁺ T las células. Por ejemplo, se ha utilizado en la ausencia de las citoquinas (ratones KO) o para medir la eficacia de la vacuna después de memoria del antígeno en animales de peso. Ideamos un protocolo corto (4 días experimento) en el que después de la transferencia pasiva de OT CFSE-manchado-I CD8 células⁺ T, una vacunación subcutánea de (s.c.) que consiste en una dosis de 50 μg de huevos libres de endotoxinas complementado con adyuvantes de la prueba se administra (Figura 1). El seguimiento de los resultados 48 horas después de la vacunación proporciona una prueba confiable de la capacidad de los adyuvantes para generar respuestas CTL. Por esta estrategia, es posible evaluar la potencia de la respuesta inmune local en el nodo de linfa de drenaje después de la inmunización, así como la magnitud de la respuesta mediante la medición de la actividad CTL en el bazo (o los ganglios linfáticos distantes).

Protocolo

Todos los ratones utilizados en este estudio fueron el fondo C57BL/6. Todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos fueron realizados según la normativa de la ley de protección animal alemán (TierSchG BGBl. S 1105; 25.05.1998) y fueron aprobados por el Comité de Sajonia inferior sobre la ética de los experimentos animales y la Oficina Estatal de baja Sajonia Estatal Oficina de protección al consumidor y seguridad alimentaria, bajo el permiso número 33.4-42502-04-13/1281 y 162280.

1. CFSE tinción de OT-I T las células y transferencia adoptiva

Nota: OT-los ratones son animales transgenically generados que expresan un receptor de célula T (TCR) con fijo α y β cadenas que reconocen a los péptidos inmuno-dominante de OVA, SIINFEKL^10,11. Como resultado, estos ratones tienen un número considerablemente alto de CD8 específicas SIINFEKL⁺ T las células (97%)¹² en comparación con ratones normales o vacunados de OVA (≤ 1%)¹³.

1. Aislamiento de trazabilidad CD8⁺ T células de OT-los ratones que expresaban el linfocito T específico Thy1^un (Thy1.1) alelo:
   1. Eutanasia de OT 6-9 semanas de edad-ratones por la inhalación de CO₂ seguido por dislocación cervical¹⁴. Disecar el bazo y ganglios linfáticos principales (sólo pares inguinales, axilares y cervicales) cortando la piel con tijeras quirúrgicas, separar la piel del cuerpo con la ayuda de pinzas quirúrgicas y fórceps y colocar en cajas Petri (60 x 15 mm) cada uno con un 100 μm poro malla taza para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido.
   2. Mantener platos de petri (cada uno con malla de una taza) en 3-5 mL de Medio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 μg/mL) en hielo.
   3. Los órganos con la ayuda de un émbolo o un instrumento estéril similar el puré (corte previo no es necesario) y recoger la suspensión unicelular resultante en tubos de centrífuga de 15 mL.
   4. Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Lavar las células en 10 mL de PBS frío mediante centrifugación y lisar los eritrocitos del bazo por volver a suspender el sedimento en 1 bazo mL de tampón de cloruro de amonio (tampón de ACK, comercialmente disponible). Incubar las células durante 1,5 min en hielo y posteriormente lavar las células con 10 mL de PBS frío por centrifugación (como antes).
   5. Vuelva a suspender el sedimento en el mismo tubo en 1 mL de PBS (pH 7.2) que contiene 5% suero bovino fetal de un aislamiento electromagnético.
2. Para realizar el aislamiento magnético, proceder a la selección negativa de CD8⁺ T las células utilizando un kit de aislamiento magnético según las instrucciones del fabricante o publicado protocolos¹⁵.
3. Para realizar la tinción de la CFSE, contar primero el número de CD8⁺ T las células obtienen de OT-I ratones utilizando un contador de células automatizado (contador de partículas). Mancha 1-5 x 10⁷ células/mL en un volumen de 1 a 5 mL con 5 μm CFSE en PBS durante 7 minutos a 37 ° C, protegido de la luz en un tubo falcon de 15 ml.
4. Sacian la CFSE tinción añadiendo el mismo volumen (1:1) de suero fetal bovino a las células e Incube por adicional 7 min a 37 ° C, protegido de la luz. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces.
5. Contar las células usando un contador de células automatizado. Establecer el número de células al 3-5 x 10⁷ células/mL de PBS para inyectar por vía intravenosa 3-5 x 10⁶ células/ratón de 100 μl (i.v.) a través de la vena de la cola.
6. Para realizar inyecciones de vena de la cola, inmovilizar los ratones en restrainers apropiados. Caliente la zona de la espalda y la cola de los ratones que se inyecta usando una lámpara de luz roja, entre 20 a 25 cm de los ratones por 1-3 min permitir la vasodilatación de la vena de la cola.
   Nota: Esto ayuda a facilidad vena detección y administración de la suspensión de células.
7. Asegurar (con la mano colocada entre la lámpara y los ratones) que no es demasiado caliente para los ratones y cuando las venas de la cola son claramente visibles, proceder a la inyección. Inyectar las células en la vena lateral o dorsal de la cola utilizando una jeringa de 1mL con aguja de calibre 25¹⁶.

2. inmunización (Endo-libre OVA +/-adyuvante)

1. Colocar los ratones transplantados con OT-I (paso 1.7, figura 1) de las células en una cámara de anestesia y administrar isoflurano en oxígeno por una máquina de anestesia¹⁴.
2. Cuando el ratón está totalmente dormido bajo anestesia, sacar de la cámara y afeitarse la piel del ratón en el área sobre los superficialis de los glúteos (zona lumbar lateral) mediante el uso de una máquina de corte de pelo eléctrico, con el fin de realizar una inyección limpia con una buena vista de la zona de aplicación.
3. Inyectar 50 μl de la vacuna, s.c. en el área depilado con una aguja de calibre 25.

3. aislamiento de linfocitos y de tinción para análisis de citometría de flujo

1. Aislamiento de linfocitos y esplenocitos
   1. Eutanasia a los ratones vacunados por CO₂ inhalación seguida por dislocación cervical.
   2. Extraer los ganglios linfáticos de drenaje y distantes y bazo y colocar en cajas Petri separadas que contienen 100 μm poro malla tazas para lanzamiento de pulido y de la célula del tejido. Siga los pasos de 1.1.2 a 1.1.3.
   3. Decantar el sobrenadante después de centrifugación y vuelva a suspender los pellets de células en el mismo volumen de PBS del remanente (aproximadamente 100 μL).
2. Tinción para análisis de citometría de flujo
   1. En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una mezcla principal que contiene los anticuerpos tinción en las concentraciones que se muestra en la tabla 1, así que rinde 2 x concentrado mezcla de tinción. Prepare suficiente volumen de mezcla principal a 100 μl por muestra. Mezcle las células y el maestro mezcla 1:1 e incubar a 4° C por 30 minutos.
      Nota: El volumen final de la tinción por muestra debe 200 μl (100 μl de células pellet + 100 μl de la mezcla principal anticuerpo).
   2. Lavan las células dos veces por centrifugación como se describe en 1.1.3, agregar 10 mL de PBS, dos veces.
   3. Resuspenda las células en 0.5-1 mL de PBS para la adquisición y transferencia de la suspensión a los tubos de citómetro de flujo. Siempre mantenga las muestras en hielo y protegidos de la luz.

4. citometría de flujo

1. Siempre prefiltro las muestras de células mediante filtros de 70-100 μm.
2. Preparar solo tinción controles de compensación para los fluoróforos detallados en la tabla 1 (granos o células).
   Nota: Compensación debe ser realizada en citómetro o análisis software^17,18,19 y aplicada a todas las muestras.
3. Seguir la estrategia bloquea representada en la figura 2. Brevemente, poblaciones de la puerta en altura de dispersión hacia adelante frente a la zona de dispersión hacia adelante (figura 2A) y otra vez dispersión lateral amplia vs área de dispersión lateral (SSA, figura 2B) para excluir dobletes.
4. Puerta de la población de figura 2B trazando BV 650 (auto-fluorescencia) vs FITC (CFSE) para discriminar la CFSE verdadero manchados células de células auto-fluorescente alta. Incluir granos o células teñidas con anticuerpos conjugados a 650 de BV en controles de compensación. Este diagrama (figura 2) de 650 BV vs FITC se utiliza para el OT de la puerta-me CFSE manchadas las células.
5. Puerta de la población de figura 2 C Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) para distinguir las células derivadas de donantes vs ratones receptores.
   Nota: Células derivadas de OT-I ratones donantes son Thy1.1⁺ (CD90.1), mientras que WT (C57BL/6, destinatarias) ratones las células derivadas son Thy1.2⁺ (CD90.2) (Figura 2D). Algunos laboratorios tienen OT-I ratones en un fondo de Thy1.2 y WT (C57BL/6) en un Thy1.1. En este caso tienes que usar un anticuerpo contra Thy1.2 para OT-célula de control.
6. Volver a puerta CD8 de las células de población Thy1.1^{+ +} trazando en una puerta que comprende 450 BV (CD4) y APC (CD8) (Figura 2E).
7. Mostrar la población cerrada en Figura 2E mediante el uso de una pantalla de histograma de los CD8⁺ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - láser azul-), la puerta la población proliferada incluyendo intensidades de 10² hasta el nivel donde las poblaciones de control son (intensidades ~ 10⁵, dependiendo de la eficacia de la tinción de CFSE y el ajuste de la tensión en el citómetro de flujo) (figura 2F).
8. Hacer un puerta adicional (no se muestra en la figura 2) trazado marcador FITC vs L/D (450/20 canal, láser UV) con el fin de evaluar las células muertas en paralelo a la evaluación de la proliferación.
9. Adquirir por lo menos 5000 eventos para los controles de compensación y 10,000 eventos (puerta E, figura 2) de las muestras en un citómetro de flujo. Ejecutar el citómetro de flujo de baja o media (no exceder las tasas de flujo de 20.000 eventos/s).

Resultados

Para probar los tratamientos utilizando una combinación diferente de los adyuvantes (ADJ1 y ADJ2), hemos evaluado la capacidad de generación de CTL midiendo la proliferación de OT eventualmente transferido-I CD8⁺ T las células mediante citometría de flujo (figura 2). Para esto, hemos manchado previamente células aisladas de los ganglios linfáticos y bazo (tabla 1) drenaje. Mediante la medición de la proliferación de CD8

Discusión

Las vacunas modernas son idealmente composedof antígeno purificado y adyuvantes, con la posible adición de un sistema de entrega como liposomas, virus-como partículas, nanopartículas o vectores vivos. Un aspecto clave en el diseño de una vacuna es elegir el adyuvante adecuado según las necesidades clínicas. Parte del ámbito podría implicar favoreciendo una humoral y respuesta inmune celular (o ambos), la elección de un local frente a una respuesta inmune sistémica (o ambos) y el tipo de memoria que la vacuna d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer	BD	Special Order	Flow Cytometer
CFSE	Molecular Probes	C34554	Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007	Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Molecular Probes	L23105	Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7	eBioscience	25-0900-82	antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody	BioLegend	100712	antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4	BD	740007	antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer	Beckman Coulter	9914591DA	Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)	Hyglos(Germany)	321000	Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon	Corning	352360	Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials	Beckman Coulter	899366014	Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes	Fischer (Corning)	14-959-5	Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes	Fischer (Corning)	05-527-90	Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)	Fischer (Gibco)	20-012-027	Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)	Dirk Rossmann GmbH (Germany)	405096	Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)	Abbott Laboratories (USA)	5260.04-05.	Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber	Parkland Scientific	V3000PK	Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium	Gibco (distributed by ThermoFischer)	11-875-093	Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	15-140-148	Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	10082147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	A1049201	Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes	Nunc (distributed by ThermoFischer)	150340	60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter	CellTrics (Sysmex)	04-004-2317	CellTrics® 50 μm, sterile