Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para medir la salida vascular inducida por la administración intradérmica de agentes de promoción de permeabilidad en la piel murina. Esta técnica puede utilizarse para determinar la capacidad de las moléculas para promover o inhibir la salida vascular o a estudiar los mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular.

Resumen

La función principal del endotelio vascular en los organismos vertebrados es servir como una barrera entre la sangre y cada tejido del cuerpo, por el que se pueden adaptar según la permeabilidad del endotelio a agua, macromoléculas del plasma y células sanguíneas la necesidad fisiológica. En ciertas enfermedades, citoquinas y factores de crecimiento son liberados que la barrera endotelial para aumentar transitoriamente la permeabilidad vascular; sin embargo, su presencia prolongada puede provocar hiperpermeabilidad vascular crónica y edema lo dañan el tejido. El ensayo de millas es una técnica en vivo que permite a los investigadores estudiar la hiperpermeabilidad vascular a través de la medición de proxy de salida vascular. Presentamos un protocolo detallado sobre cómo realizar este procedimiento en el ratón, que es el organismo modelo más ampliamente utilizado para estudiar la patología y fisiología mamífera. El procedimiento consiste en la inyección intravenosa del tinte de azul de Evans para la albúmina circulante seguida de múltiples inyecciones intradérmicas de agentes inductores de permeabilidad y soluciones de control de vehículo en oposición flancos del ratón de la etiqueta. En consecuencia, colorante azul de Evans pierde gradualmente en la dermis, donde se acumula y puede ser extraída para su cuantificación como fuga inducida por el agente de inducción de permeabilidad en relación con el vehículo. El ensayo de millas se puede realizar en tipo salvaje o genéticamente modificado modelos de ratón y puede combinarse con la administración de drogas para el estudio de mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular e identifican agentes/objetivos capaces de inducir o de bloqueo hiperpermeabilidad.

Introducción

La función principal del sistema cardiovascular es permitir a la transferencia de gases, nutrientes y deshechos entre la circulación y los tejidos en todos los órganos. Los vasos sanguíneos tienen niveles de órgano-específicas de permeabilidad basal para permitir tales intercambios¹. Por ejemplo, los vasos sanguíneos en el riñón son muy permeables, mientras que la barrera hemato encefálica forma un apretado y muy impenetrable interfaz^2,3,4. Las células endoteliales que forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos proveen una barrera física entre la circulación y los tejidos subyacentes y regulan la permeabilidad vascular de manera órgano-específicas. Sin embargo, ciertos estímulos provocan una interrupción parcial de la barrera endotelial al aumentar la extravasación de líquido de la circulación en el intersticio por encima de los niveles básicos¹. Tal hiperpermeabilidad se observa, por ejemplo, en sitios de trauma tisular, inflamación, tumores, durante la sepsis, en ojos con enfermedad neovascular o en el cerebro y el corazón, cuando se produce isquemia del tejido debido a un accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, respectivamente ^{5 , 6 , 7 , 8}. cuando crónicamente elevados, hiperpermeabilidad conduce a edema, que a su vez provoca daño a los tejidos, tales como pérdida de visión en el ojo la enfermedad⁹. Así, es deseable para la comprensión de los mecanismos que aumentan la permeabilidad endotelial y poner a prueba la eficacia de agentes diseñados para inhibir este modelado de la respuesta de la hiperpermeabilidad vascular.

El ensayo de millas es una técnica bien establecida, utilizada y relativamente simple que mide la salida vascular en vivo como una medida sustituta de la hiperpermeabilidad vascular. Aunque no toma en cuenta composición de factores que pueden aumentar la salida vascular independientemente de la regulación de la barrera endotelial, como presión arterial o la circulación sanguínea, el análisis de Miles generalmente está pensado para proporcionar un método confiable para evaluar la actividad de modulación de la permeabilidad de las sustancias e identificar los mediadores de señalización que promueven su actividad. En consecuencia, el ensayo de Miles ha sido parte integral de numerosos estudios que han identificado mediadores de la hiperpermeabilidad vascular y sus mecanismos de acción^{10,11,12,13, 14,15}, como el factor de crecimiento endotelial vascular VEGF-A que fue originalmente identificado como el factor de permeabilidad vascular VPF¹⁶.

Originalmente desarrollado por millas y millas para el estudio de la permeabilidad vascular en conejillos de Indias¹⁷, su ensayo fue adaptado posteriormente al uso de ratones, que son ahora el organismo modelo de elección para dilucidar los mecanismos moleculares de la permeabilidad vascular Reglamento debido a su exquisita adecuación a la manipulación genética. Brevemente, colorante de azul de Evans por vía intravenosa es había inyectado en ratones adultos y permitir que circule durante 30 minutos (figura 1). Agentes inductores de permeabilidad versus control del vehículo luego se inyectan por vía intradérmica en múltiples sitios de oposición flancos del ratón para inducir la fuga vascular (figura 1). En consecuencia, albúmina-limitan Evans tinte azul extravasates y se acumula en la dermis (figura 1). Después de sacrificar humanitariamente el ratón, azul de Evans se extrae de la dermis y el nivel de fuga vascular calcula como un cociente de la prueba a vehículo-inducidas por sustancias densidad óptica (figura 2).

Protocolo

Animal todo el trabajo se llevó a cabo después de la UK Home Office y las pautas del Bienestar Animal y cuerpo de revisión ética (AWERB).

1. ratón preparación

Nota: Realizar experimentos en ratones adultos de al menos 8 semanas de edad, hasta 6 meses de edad. Para demostrar reproductibilidad técnica y el tiempo constante para cada paso de este procedimiento entre diferentes animales, usar un mínimo de 2 y máximo de 6 ratones para cada sesión experimental. Para evaluar el efecto de una mutación en una sustancia inductora de la permeabilidad en los ratones modificados genéticamente, lo ideal sería utilizar 2 ratones mutantes y 2 controles de littermate por experimentos.

1. 24 h antes de la hiperpermeabilidad vascular estimulante, anestesiar ratones utilizando una adecuada inhalación de anestésica como isoflurano. Use 3% isoflurano para la inducción de la anestesia hasta que se pierde el reflejo de adrizamiento y el ratón no responde a los estímulos externos. Uso de isoflurano de 1.5% para el mantenimiento de la anestesia (Asegúrese de que el ratón tiene constante tasas respiratorias). Bajo anestesia, cuidadosamente afeitado ambos flancos de cada ratón con una afeitadora eléctrica, evitando lesiones en la piel.
   Nota: Se utiliza anestesia para evitar causar estrés al animal y reducir al mínimo el movimiento durante el afeitado, que puede resultar en daño a la piel.
2. Retomar el ratón afeitado su jaula casera. Para ratones machos, coloque cada macho en una jaula individual después de la recuperación de la anestesia para evitar la lucha y, por lo tanto, dañar la piel. Para los ratones hembra, envíelos en un grupo a su jaula casera.
   Nota: Si se observa un comportamiento de luchando entre ratones machos en la jaula, antes del procedimiento, separarlos en jaulas individuales durante 3 días antes del experimento para permitir que el potencial daño a la piel sanar.
3. Controlar los ratones hasta que recuperan la conciencia (generalmente en unos pocos segundos) y moverse por la jaula (generalmente dentro de 1 minuto).

2. intravenosa inyección de Evans Blue Dye

1. En un gabinete de flujo laminar, preparación de soluciones estériles separadas de la maleato de mepiramina inhibidor de la histamina (4 μg/μl de solución salina al 0.9%) y de colorante azul de Evans (1% p/v en solución salina al 0.9%). Esterilizar por pasar las soluciones a través de un filtro de 22 μm.
2. Utilice una jeringa estéril de 1 mL con una aguja de 30 G para inyectar por vía intraperitoneal cada ratón con 10 μl mepiramina maleato solución gram de peso corporal (figura 1A). Para realizar al pescuezo primero, de inyección, el ratón y luego inclínela para que la cabeza está dirigida hacia el suelo y el abdomen se dirige hacia arriba. Inyectar en los cuadrantes inferiores del abdomen de la línea media para evitar que la vejiga.
   Nota: El peso de los ratones entre 8 semanas y 6 meses de edad generalmente oscila entre 15 y 30 g. maleato de mepiramina inhibe la liberación de la histamina endógena, que de lo contrario podría promover salida vascular independientemente del agente a prueba.
3. Coloque el ratón en una cámara de calor de 37 º C durante 10 minutos promover la vasodilatación. Alternativamente, use una lámpara de calor se centró en la cola para promover la vasodilatación si se permite el uso de una lámpara de calor por las directrices éticas locales.
4. Mover un ratón a la vez a un limitador de ratón y frotar la cola con etanol al 70% para limpiar la zona de inyección y seguir promoviendo la vasodilatación.
5. Utilizar una jeringa estéril de 1 mL con una aguja de 30G para administrar 100 μl colorante azul de Evans por vía intravenosa en la vena de la cola (figura 1B). Inmediatamente aplique presión en el lugar de inyección manteniendo la cola entre un dedo y el pulgar para evitar el sangrado.
   Nota: Visualización de la vena de la cola puede mejorarse al dirigir la luz a la zona de inyección. En un protocolo publicado¹⁸encontrará mayores detalles sobre la realización de inyecciones intravenosas en la vena de la cola de ratón.
6. Permitir que el medio de contraste circule durante 30 minutos.

3. estimular la hiperpermeabilidad Vascular

1. Uso de soluciones estériles en un gabinete de flujo laminar, diluir al agente induce permeabilidad de interés a una concentración que permite la dosis final a ser entregado en un volumen de 20 μl.
   Nota: En el experimento del ejemplo que se muestra en la figura 1-figura 2, que VEGFA se utiliza para estimular la hiperpermeabilidad vascular en una concentración de 2,5 ng/μl de PBS, dando una dosis total de 50 ng y PBS se utiliza como un control del vehículo.
2. Cargar al agente induce permeabilidad de interés y el control del vehículo en 300 μL jeringas de 2 separados estéril con una aguja de 31 G. Cantidad suficiente de solución a inyectar cada ratón con 20 μl de la solución por triplicado la carga (es decir, preparar 60 μL del agente y vehículo por ratón, más volumen adicional para tener en cuenta para el volumen muerto de la aguja).
3. Anestesiar el primer ratón para probarse con isoflurano (3% para la inducción de la anestesia hasta que se pierde el reflejo de enderezamiento y el ratón no responde a los estímulos externos y 1.5% para el mantenimiento de la anestesia, asegurándose de que el ratón tiene constante tasas respiratorias).
4. Inyectar por vía intradérmica 20 μl del agente promoción de permeabilidad en el flanco del ratón (figura 1). Asegúrese de que la aguja esté en un ángulo de 15° a la piel. Busque la formación de una burbuja elevada dentro de la piel que indica una inyección exitosa. Repetir la inyección intradérmica en 2 sitios adicionales, menos de 1 cm de separación.
5. Gire el ratón para exponer el flanco 2 y repetir las inyecciones por triplicado con la solución de control de vehículo. Anote en un papel la posición de cada sitio de la inyección para facilitar su identificación para posterior recogida de muestras de piel.
   Nota: Manipular la piel del ratón con cuidado en esta etapa; por ejemplo, evitar pellizcar la piel al realizar inyecciones intradérmicas.
6. Volver el ratón inyectado a su jaula casera y controlar el ratón hasta que recupere la conciencia (generalmente en unos pocos segundos) y se mueve alrededor de la jaula.
7. Mientras se recupera el primer ratón, inmediatamente repita 3.3 y 3.5 con el segundo ratón, y así sucesivamente (hasta 6 ratones máximo por sesión). Mantener un registro del tiempo que cada ratón fue inyectado para ajustar la hora a la que se prosiga con el paso posterior.

4. cuantificación de azul de Evans acumulada dentro de la Dermis

1. Sacrificar cada ratón mediante dislocación cervical 20 minutos después de que ha recibido las inyecciones intradérmicas, observando el mismo orden en que los ratones fueron inyectados.
   Nota: La duración de la salida vascular puede variar según el agente de inducción de permeabilidad utilizado, y, por lo tanto, el tiempo entre la inyección intradérmica y sacrificio necesiten optimizar.
2. Lugar cada sacrificados ratón en su espalda y sus pies sobre un tablero de corcho envuelven con un paño limpio (figura 1) del perno.
3. Usando las tijeras embotadas, haga una incisión vertical de unos 3-4 cm de la parte inferior del abdomen hasta el pecho del ratón muerto. Con pinzas y bisturí, burlan a la piel de ambos flancos para revelar la parte interior de la dermis y sitios de acumulación de azul de Evans (Figura 1E). Precisar la piel floja y quitar la grasa de las regiones alrededor del sitio de salida con un bisturí. Si es necesario, tomar una foto representativa para demostrar la magnitud de la fuga de azul de Evans en la piel.
4. Utilizando pinzas y un bisturí, impuestos especiales piel regiones que comprende el tinte de azul de Evans se filtró cada sitio inyectan con el agente de inducción de permeabilidad o vehículo.
   Nota: tenga cuidado de suprimir regiones similar tamaños de la piel para asegurarse de que, en el posterior paso 4.7, una porción similar del volumen de formamida a ser adsorbida por cada muestra de la piel, permitiendo que el tinte extraído a diluirse en un volumen similar de formamida restantes . El mapa de inyección que registró en paso 3.5 le ayudará a definir el área a ser suprimido.
5. Coloque cada muestra en un tubo de 1,5 mL y etiquetaron por consiguiente, asegurándose de que cada muestra se basa en la parte inferior del tubo. Almacenar las muestras a - 20 ° C hasta su uso posterior. Si se procesa inmediatamente, siga estos pasos.
6. Secar las muestras de la piel durante la noche colocando tubos abiertos en un horno o en el pozo de un bloque de calentamiento a 55 ° C.
7. Para extraer el colorante azul de Evans, Añadir 250 μl de formamida desionizada a las muestras en una campana de humos, cerca de los tubos. Asegúrese de que las muestras de la piel están todos cubiertas por la formamida e incuban durante una noche en un horno o un bloque de calentamiento a 55 ° C.
8. Centrifugue las muestras en una centrífuga de sobremesa en velocidad máxima (> 10.000 x g) durante 40 minutos.
9. En una campana de humos, transferir 100 μl del sobrenadante que contiene el tinte de cada muestra en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos de fondo plano, transparente (figura 2A).
10. Pico de medir absorbancia de azul de Evans a 620 nm con una lectura de referencia de 740 nm en un espectrofotómetro.
    Nota: 620 nm es la absorbancia máxima de Evans blue, mientras que 740 nm no es absorbida por el azul de Evans y actúa como una longitud de onda de referencia.
11. Promedio de las lecturas de absorbancia de las inyecciones por triplicado del mismo agente o vehículo para cada ratón para tener en cuenta la variabilidad técnica (figura 2B).
12. Calcular la diferencia de doblez de lecturas de agente inductores de permeabilidad versus control del vehículo (figura 2).

Resultados

Utilizamos el análisis de Miles para evaluar la capacidad de VEGF-A para inducir la fuga vascular en relación con el control del vehículo (PBS) en ratones C57/Bl6 de tipo salvaje. A continuación, os mostramos un experimento representativo utilizando ratones de tipo salvaje estimuladas con inyección intradérmica de solución de 20 μl que contiene 50 ng de VEGF-A en PBS o vehículo PBS solo. Un claro aumento en salida de colorante azul de Evans en muestras de piel inyectado con VEGF-A en comparación con el PBS fue evidente en situ (Figura 1E) y después de la extracción de la tintura en formamida (figura 2A). Cuantificación de múltiples experimentos demuestra que 50 ng de VEGF-A induce significativamente más Evans azul salida de PBS solo (figura 2B), con un promedio 3-fold aumento en salida vascular en comparación con el vehículo (figura 2).

Figura 1: inducción de salida vascular en el ensayo Miles. Representación esquemática (paneles superiores) y las imágenes correspondientes (paneles inferiores) de los pasos secuenciales cuando se realiza el ensayo de Miles en el ratón. (A) mepiramina maleato se inyecta por vía intraperitoneal para evitar la liberación de la histamina endógena 10 a 30 minutos antes de la inyección intravenosa de (B) 100 μL 1% vena Evans blue en la cola del ratón. (C) 30 min después, vascular fuga es inducida por inyección intradérmica del agente (50 ng de VEGF-A; verde círculos) versus el control del vehículo (PBS; círculos de color blanco). (D, E) Para acceder a sitios de acumulación de azul de Evans, el ratón sacrificados 20 minutos después de las inyecciones intradérmicas y la piel de ambos flancos disecado inmovilizados. intraperitoneal: intraperitoneal; i.v.: intravenoso; identificación: intradérmica; bares, 1 cm. de la escala por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: cuantificación de salida vascular en el ensayo Miles. (A) Evans tinte azul se extrae en formamida de muestras de piel obtenidas de cada inyección intradérmica en la figura 1 y cargado en una placa de 96 pocillos para absorbancia con un espectrofotómetro de lectura. (B, C) Representación gráfica de las lecturas de absorbancia de múltiples experimentos mediante la representación de cualquiera de los dos valores (B) la absorbancia normalizado (densidad óptica, OD) de ambos el agente induce permeabilidad (VEGF-A; oscuro verde círculos) y vehículo (PBS; gris círculos), o (C) el doble cambio de OD para el agente versus vehículo (barras de error: SEM). Las lecturas de absorbancia de la PBS por triplicado muestras de VEGF-A que se muestra en (A) son un promedio y se muestra en (B, C) como círculos blancos o verdes, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Desde su primera descripción en 1952¹⁷, el ensayo de Miles ha proporcionado los investigadores un método relativamente rápido, sencillo y fiable para estudiar los mecanismos moleculares de la hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el ensayo de Miles se ha utilizado para probar la capacidad o potencia de los diferentes agentes para inducir la hiperpermeabilidad^19,20,21 para probar la eficacia de la hiperpermeabilidad bloqueando agentes^{8 ,22,23}. Como otro ejemplo, agentes que inducen la permeabilidad vascular se han probado en ratones modificados genéticamente y sus controles de littermate para determinar los requerimientos de receptores específicos y la señal de transducción de proteínas inducida por el ligando de la hiperpermeabilidad respuestas^{10,11,12,13,14,15,20,23}. Varias versiones modificadas del ensayo Miles han ya utilizadas, por ejemplo con respecto al trazador utilizado. Así, el azul de Evans ha sido sustituida en algunos estudios con dextranos marcados con fluorescencia de diferentes tamaños o microesferas^11,13.

La principal ventaja del ensayo Miles sobre otros ensayos para investigar mecanismos de hiperpermeabilidad vascular es que es comparativamente fácil de realizar y no requiere de equipo costoso. Además, como una técnica en vivo , esta salida vascular de modelos de análisis en el contexto de vasos intactos, frente a la fuga a través de la medición en vitro ensayos tales como trans bien ensayos de flujo o trans endotelial resistencia eléctrica ( Ensayos de TEER), que se centran, exclusivamente, en la monocapa endotelial. Los ensayos alternativos en vivo de hiperpermeabilidad vascular pueden diferir el análisis de Miles aquí descrito utilizando una ruta de entrega diferentes para el agente de inducción de hiperpermeabilidad o mediante el análisis de fuga vascular en diferentes sitios, para ejemplo de la entrega sistémica de un agente a través de la vena de la cola seguido del examen de salida vascular en los pulmones o la tráquea^11,13,15. Una limitación del análisis de Miles es que la inyección intradérmica de ciertos agentes puede, en principio, también influyen en la presión arterial y el flujo además de alteración de barrera endotelial y, por lo tanto, influyen también indirectamente en la permeabilidad vascular. Sin embargo, este ensayo se ha demostrado recientemente para medir la permeabilidad vascular inducida por VEGF-A independientemente de efectos sobre la presión arterial sistémica¹⁵. Otra limitación del análisis de Miles es que camas vasculares en diferentes tejidos pueden responder diferentemente a agentes de promoción de la permeabilidad y los resultados obtenidos con un ensayo de Miles en la piel, por lo tanto, no sean representante, por ejemplo, de lo que ocurre en la pulmón o el cerebro.

Edad y peso del animal pueden influir en la fuga observada en el ensayo Miles. Para minimizar el efecto de estas variables, los investigadores deben utilizar hermanos de camada o similar tamaño y de ratones como controles. Evaluación de mutantes de ratón para un determinado gen de interés, se deben generar ratones a través de un heterocigoto versus crianza heterozigótico estrategia y wildtype hermanos de camada utilizados como controles. Por otra parte, es recomendable utilizar anestésicos gas rápidamente reversible, como el isoflurano, para evitar la vasoconstricción, que ha sido descrita por algún fármaco anestésico administrado por vía parenteral inyecciones^24,25. La inyección de colorante azul de Evans en la vena lateral de la cola de ratón es un paso crítico en este protocolo y puede influir grandemente en la calidad de la experiencia y los datos. Así, los investigadores deben ser competentes en la ejecución de las inyecciones de vena de la cola y es probable que necesite previa experiencia o práctica antes de empezar que las millas ensayo experimentarán. También, los investigadores pueden utilizar otras rutas intravenosa para entregar a Evans blue, como la inyección de retro-orbital si tienen experiencia con él. Inyección intradérmica de permeabilidad-promover soluciones pueden dañar independiente del agente a la piel. Por lo tanto, inyecciones intradérmicas no debe exceder 20 μl en el volumen, deben siempre ser realizadas en presencia del inhibidor de la histamina y normalizadas a las inyecciones de control del vehículo.

El ensayo de millas se ha utilizado por muchos investigadores a evaluar los componentes de la vía señalización de VEGF-A, por ejemplo, debido a la permeabilidad vascular inducida por el VEGF-A provoca ascitis en pacientes de cáncer¹⁶ y edema pérdida de visión en varios neovascular ojo la enfermedad⁷. Por lo tanto, nosotros y otros hemos utilizado el ensayo de Miles para comparar VEGF-A salida vascular inducida en ratones que han sido modificados genéticamente para carecer de componentes específicos del VEGF-A señalización cascada^{12,13,14, 15 , 20 , 23}. nuestro reciente estudio usando este acercamiento reveló que la principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, señala a través de un complejo de VEGFR2 y NRP1, en el que el dominio citoplásmico NRP1 promueve la activación mediada por la cinasa ABL de quinasas familia SRC para evocar una respuesta de hiperpermeabilidad¹⁴. VEGFA también promueve el crecimiento de vasos sanguíneos y por lo tanto, podría ser utilizado terapéuticamente para restablecer el flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos si sus actividades de hiperpermeabilidad pueden ser inhibidas específicamente. Investigación elucidar el mecanismo molecular que VEGF-A las respuestas de las células endoteliales vasculares hacia la hiperpermeabilidad vascular podría, por lo tanto, identificar las vías que se pueden manipular selectivamente inhibiendo patológico edema inducida por VEGF-A en enfermedades como cáncer o enfermedad ocular isquémico. El ensayo de millas, sin duda, seguirá siendo un método útil para apuntalar estos y muchos otros tipos de estudios funcionales para aclarar moleculares reguladores y efectores de la hiperpermeabilidad vascular.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyrilamine maleate salt	Sigma-Aldrich	P5514-5G	Resuspend in PBS
Deionised Formamide	Sigma-Aldrich	S4117	Use in fume cupboard
Microlance Needles 30g x 0.5"	BD	305106
Sterile Plastipak 1ml Luer	BD	309659
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G	BD	324826
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Mouse restrainer
Heat chamber
Hair clippers
Isoflurane	Merial	ap/drugs/220/96
Scalpal
Blunt scissor
Forceps
Eppendorf tubes
Heatblock
Cork board
Benchtop refrigerated centrifuge
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165	Reliatech	M30-004