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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Resumen

Interneuronas GABAérgicas (INs) son componentes esenciales de las redes neuronales que cognición y comportamiento. INs destinada a rellenar la corteza migrar tangencialmente de su lugar de origen en el telencéfalo ventral (incluyendo de las eminencias ganglionares mediales y caudales (MGE, CGE)) a la placa cortical dorsal en respuesta a una variedad de intrínseco y extrínseco señales. Diferentes metodologías se han desarrollado en los años genético manipular vías específicas e investigar cómo regulan los cambios citoesqueléticos dinámicos necesarios para la correcta migración. En el útero de la electroporación se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la represión del gen o sobreexpresión en IN específico subtipos al evaluar el impacto en la morfología y posición final. Sin embargo, mientras que este enfoque se utiliza fácilmente modificar radialmente migración de las células piramidal, es técnicamente más difícil cuando dirigidos a electroporación pulg en el útero genera un bajo rendimiento dado las tasas de disminución de la supervivencia de los cachorros cuando la electroporación se lleva a cabo antes de e14.5, como es habitual al estudiar INs derivados de MGE. En un enfoque alternativo, MGE explantes proporcionan un fácil acceso al MGE y facilitan la proyección de imagen de INs modificados genéticamente. Sin embargo, en estos explantes, INs emigran en una matriz artificial, carente de orientación endógena claves y entradas talámicas. Esto nos incitó a optimizar un método donde el INs puede migrar en un ambiente más naturalista, al eludir los desafíos técnicos de los enfoques en el útero . En este papel, describimos la combinación de la electroporación ex útero de ratón embrionario cerebro seguido organotypic rebanada culturas fácilmente, imagen y reconstruir genéticamente modificados INs migrando a lo largo de sus senderos naturales en respuesta a señales endógenas. Este enfoque permite tanto la cuantificación de los aspectos dinámicos de migración con la proyección de imagen confocal Time-lapse, así como el análisis detallado de diversos parámetros morfológicos usando reconstrucciones neuronales tejido immunolabeled fijo.

Introducción

Interneuronas GABAérgicas corticales (INs) son diversos en cuanto a sus propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y conectividad, y median diversas funciones en redes maduro1,2,3 ,4,5. La especificación de subtipos diferentes de INs cortical es estrictamente regulada a través de cascadas genéticas que han sido extensivamente estudiados1,2. La mayoría (70%) de los INs GABAérgicas corticales origina de progenitores en la eminencia ganglionar medial (MGE), una estructura embrionaria ubicada ventralmente y debe migrar a través de distancias relativamente largas para llegar a la placa cortical1, 2 , 6. mientras que las células piramidales corticales migran radialmente desde la zona ventricular (VZ) a la placa cortical a lo largo del andamio de la glia radial, la migración tangencial del INs, que no están vinculados a estos andamios, requiere una variedad de intrínseca y señales extrínsecas para atraer las neuronas migrantes hacia la placa cortical, al mismo tiempo guiándolos lejos de estructuras no corticales2,7,8. Después de salir del ciclo celular, INs son repelidos de la MGE por quimio-repulsivo señales expresadas en VZ de MGE, que desencadena la migración tangencial a la placa cortical9,10. Migración de INs evitar el estriado con la ayuda de diferentes señales repulsivas11 y, después de llegar a la placa cortical, cambia de una tangencial a una migración radial y llegar a su posición final laminar, en parte en respuesta a señales del piramidal las células de12 y otras poblaciones celulares13. La migración de los INs, en cuanto a otras poblaciones neuronales, implica varios cambios morfológicos dinámicos para permitir el movimiento real de la neurona. Este supuesto locomoción neuronal se caracteriza por ciclos repetitivos de tres pasos sucesivos: el alargamiento de un proceso principal, un movimiento activo anterograde del núcleo (nucleokinesis) y la retracción del proceso final14. EN migración está regulada por numerosas señales intrínsecas y extrínsecas que la ramificación y la remodelación activa del proceso principal para guiar el INs en la dirección correcta, determinar la orientación y la velocidad de migración14,15 ,16.

Los determinantes de regulación cortical en la migración se han estudiado ampliamente en los últimos años1,2,7,17,18,19,20 y alteración en algunos de estos agentes moleculares se ha postulado para dar lugar a trastornos del neurodesarrollo, como el pediátrico refractaria epilepsia o Autismo espectro trastornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por lo tanto, el desarrollo de diversos enfoques in vitro e in vivo se ha seguido para impulsar significativamente nuestra capacidad para el estudio de este proceso dinámico, como previamente ha25. Los métodos in vitro , incluyendo el análisis de la cámara de Boyden y el análisis de la elección de raya, proporcionan el medio más rápido y más reproducible de evaluación del requisito e impacto célula Autónoma de proteínas o genes específicos durante la migración neuronal, sin la influencia de otros factores25. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se combinan con imágenes en vivo8,26,27. Con estas técnicas, son fácilmente Obtenido de e13.5 MGE y aislado por la disociación enzimática y mecánica, después de que se pueden investigar diferentes vías de señalización y señales de orientación, como se ilustra anteriormente8,28 . Sin embargo, estos ensayos tienen lugar en una matriz extracelular artificial en la ausencia de la arquitectura tridimensional del tejido, que puede modificar propiedades de comportamiento y de la célula neuronales, afectando potencialmente a migración y supervivencia de la célula25. Para evitar estas limitaciones, los explantes MGE ex vivo se han desarrollado como una herramienta alternativa para cuantificar los dinámicos cambios morfológicos que ocurren durante la migración junto con parámetros como la velocidad y orientación14, 29. Generación de MGE explantes es relativamente sencilla y ha sido ampliamente descrito en otra parte30. Implica la chapa de un pequeño extracto de la MGE en una monocapa de células corticales mixtas o en una mezcla de matrigel y colágeno en presencia de señales atractivo o repulsivo25, siendo este último opcional31. MGE explantes permiten alta resolución imágenes de células escasamente marcadas, simplificar el estudio de los procesos intracelulares, como remodelación citoesqueleto durante proceso principales de ramificación, como se mostró anteriormente32,33 ,34 y en el presente estudio. Explantes MGE se han utilizado con éxito para evaluar cambios dinámicos del citoesqueleto durante la migración en un entorno 2D, por ejemplo después de manipulaciones farmacológicas o quimiotácticas específicas (véase, por ejemplo, Tielens et al 201633) . Sin embargo, con este enfoque, INs migran dentro de una matriz artificial, y esto podría alterar en comportamiento y la reproducibilidad y el significado de los resultados experimentales.

Por el contrario, en el útero la electroporación permite la manipulación genética de los INs en su ambiente nativo y es un método ampliamente usado para evaluar rápida y eficientemente el impacto de la ganancia y pérdida de función del gen mientras que eludir las limitaciones de golpe de gracia costosa y desperdiciadora de tiempo y knock-in estrategias25,35. Electroporación en el útero puede ser inclinada hacia en progenitores mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y colocando los electrodos hacia las estructuras ventromedial, incluyendo el MGE36. Además, en el útero la electroporación permite la oportuna expresión de construcciones experimentales en 1-2 días, en comparación con el 7-10 días necesarios para la construcción de expresión utilizando viral vectores25. Sin embargo, en el útero la electroporación de en progenitores tiende a ser bajo rendimiento. De hecho, si bien progenitores de células piramidales en la zona ventricular dorsal pueden ser transfectadas eficientemente usando en el útero electroporación, dirigidas a las estructuras más ventral situadas, como el MGE, es más técnicamente difícil, especialmente en pequeños e13.5 embriones y la alta tasa de letalidad embrionaria más reduce el rendimiento experimental25.

Para eludir algunas de las limitaciones técnicas asociadas con in vitro MGE presentaron experimentos y electroporación en vivo en el útero , ex vivo organotypic rebanada culturas se han desarrollado8,37, 38,39. Cerebro organotypic rebanada culturas ofrecen la ventaja de la mímica en vivo de las condiciones, mientras que siendo menos costosos y desperdiciadores de tiempo de modelos de animales genera25. De hecho, estas preparaciones permiten un acceso fácil a la MGE, junto con la visualización específica del INs y pueden combinarse con electroporación focal para investigar vías moleculares específicas en INs migración en medio ambiente más fisiológico8 , 39 , 40 , 41. por lo tanto, hemos optimizado una aproximación por organotypic culturas38, que combinamos con electroporación ex utero y la proyección de imagen confocal Time-lapse, para evaluar el proceso morfológico y dinámico que ocurre durante la migración tangencial de MGE-INs. El presente Protocolo fue adaptado y optimizado de otros que han usado ex útero o en el útero cerebro electroporación organotypic rebanada culturas y estudiar la migración de las células piramidales42,43 y cortical INs36,39,44. Específicamente, embriones de ratón son decapitados y el MGE es electroporated ex vivo después de la inyección intraventricular de la plásmidos experimental, lo que permite más eficiente y precisa selección de progenitores MGE que lo que puede lograrse con electroporación en el útero . Luego se extraen los cerebros y seccionado en rebanadas coronales todo el cerebro que pueden ser cultivados por unos pocos días, lo que permite la continua seguimiento y proyección de imagen de transfected INs. Este enfoque etiquetas típicamente 5-20 INs migración tangencial por rebanada del cerebro, minimizando el número de iteraciones experimentales necesaria para alcanzar significación estadística, mientras etiquetado una población neuronal lo suficientemente escasa para asegurar la fácil separación de neuronas individuales para la reconstrucción y evaluación morfológica fina. Además, en comparación con explantes MGE, culturas organotypic aseguran que migrar INs están expuestos a un ambiente más natural, incluyendo entradas de aferentes talámicos y quimiocinas secretadas localmente. Este enfoque es apropiado para cuantificar la direccionalidad y la ruta migratoria adoptada por INs transfected, ofreciendo información anatómica suficiente para permitir la caracterización de procesos dinámicos más finos como principal proceso de ramificación, nucleokinesis y al final proceso de retracción.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) en el centro de investigación de CHU Sainte-Justine y fueron conducidos de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre guía de cuidado de animales el cuidado y uso de animales de experimentación (Ed. 2).

El protocolo descrito aquí fue optimizado para la electroporación de embriones en el día embrionario (e) 13.5, a la vez cuando INs derivados de MGE activamente generados, antes de la deriva máxima de CGE INs producción45,46. Además, para sesgar la electroporación hacia INs GABAérgico, utilizamos un promotor expresado selectivamente en el INs (por ejemplo, el promotor de Dlx5/6 con su potenciador mínimo)47.

1. preparación de soluciones para electroporación y culturas Organotypic rebanada

  1. Preparar 125 mL de medio de cultivo estéril.
    1. Medir 125 mL regular neurona-específica del medio de cultivo (véase Tabla de materiales para la formulación) en una botella esterilizada en un gabinete de bioseguridad UV-esterilizado previamente rociado con etanol al 70%. Añadir 2.25 mL de 50 x suplemento libre de suero enolase, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentración final de 0,5 mM) y 6,25 mL de suero de caballo inactivado con calor previamente alícuotas bajo condiciones estériles. Mezclar bien, alícuota de 15 mL tubos cónicos estériles y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Medio de cultivo preparado puede almacenarse hasta por 3 semanas a 4 ° C.
    2. Dividir 100 X solución de N-2 formulación48 de Botteinstein 150 alícuotas μl bajo condiciones estériles y congelar a-20 ° C hasta su uso.
  2. Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial estéril (ACSF).
    1. Medir 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 25,67 g de sacarosa, 5,08 g de cloruro de sodio (NaCl), 2,18 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 1,80 g de glucosa, 0,19 g de cloruro de potasio (KCl), 0.15 g de fosfato monobásico de sodio anhidro (NaH2PO4), 1 mL de 1 M stock CaCl2 .2 h2O y 2 mL de 1 M stock MgSO4.7H2O. remover para disolver a temperatura ambiente. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L.
    2. Usa un filtro de 0,22 μm, filtrar la solución en un frasco estéril en un gabinete de bioseguridad esterilizar y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Preparar una solución fresca de agarosa al 4% en ACSF antes de cada experimento.
    1. Medir 25 mL de la ACSF previamente preparado en un tubo cónico estéril de 50 mL y añadir 1 g de agarosa de punto de bajo punto de fusión.
    2. Calor de 45 s en un horno de microondas. Para evitar derrames, interrumpir la calefacción cada 3-4 s cuando la ebullición comienza, abrir el tubo para que la presión hacia fuera, vuelva a cerrar y agitar manualmente para mezclar la agarosa. Repita hasta que la solución de agarosa es homogénea. Mantener la solución de agarosa a 42 ° C durante el resto del experimento para evitar la solidificación.
      Nota: Las temperaturas más elevadas dañará los tejidos del cerebro.

2. preparación de plásmidos para la inyección

  1. Tire una pipeta de microinyección de vidrio
    1. Establezca el tirador de la micropipeta con los parámetros apropiados, garantizar el capilar de vidrio en el espacio proporcionado y asegúrese de que esté centrado con el filamento.
    2. Presione el botón de extracción.
    3. Retire cuidadosamente las pipetas de microinyección recién hecha desde el extractor de calor y el lugar en un cuadro o caja de Petri limpia hasta su uso posterior para evitar dañar la punta.
  2. Configuración la seguridad de la biotecnología con todos los instrumentos necesarios para esto experimentar (ver figura 1A), rocíe generosamente todos los instrumentos en el gabinete de seguridad de la biotecnología con etanol al 70% y esterilizar los instrumentos y el medio ambiente con la luz UV durante 15-20 min.
  3. Durante la etapa de esterilización, descongelar plásmidos en hielo (4 ° C).
  4. Medir 10 μl del plásmido de una solución stock (4 μg/μl) en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 0.01% de verde rápido FCF. Mezclar suavemente, hacer girar brevemente y no en hielo hasta su uso.
    Nota: Maxi-prep DNA debe estar preparado según protocolo del fabricante usando un kit libre de endotoxina maxi-prep. ADN puede ser solubilizado en buffer TE, o libre de nucleasa H2O y la preparación del plásmido con tinte solución puede, pero no no tiene que ser realizada bajo condiciones estériles. Plásmidos de Maxi-prep deben ser alícuotas para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo. Plásmidos alícuotas no se deben mezclar con el tinte más 2 h antes de su uso y no se deben congelar para su uso posterior.
  5. Después de la esterilización, preparar el inyector de nano como sigue.
    1. Elija uno de la pipeta de microinyección de vidrio preparadas previamente almacenada en una caja limpia o placa de Petri y uso pinzas pequeñas para cortar la punta de la pipeta en forma biselada para alcanzar un diámetro exterior de aproximadamente 15 μm.
      Nota: El diámetro externo dado aquí es una medida aproximada para dar al usuario una idea de lo que usamos en nuestros experimentos y se ha optimizado para facilitar la perforación del cráneo para la inyección de plásmidos sin dañar el cerebro, permitiendo al fluido carga y liberación de la DNA. El diámetro exterior puede medirse observando el corte punta de la pipeta de microinyección de vidrio apposed a una barra de escala micrométrica bajo un microscopio de campo brillante.
    2. Utilice una jeringa para llenar la micropipeta con aceite mineral de su unpulled extremo (para expulsar todo el aire).
    3. Inserte la micropipeta de vidrio lleno en el nano-inyector siguiendo las instrucciones del fabricante.
    4. Vacío 2/3rds de la micropipeta de vidrio (manteniendo suficiente aceite para evitar la entrada de aire).
  6. Cuidadosamente insertar la micropipeta dispuesta en el tubo que contiene la solución de plásmido/tinte y llene la micropipeta de vidrio con la solución de plásmido/tinte.

3. recolección de embriones de ratón de hembras preñadas

  1. Supervisar diariamente las hembras de cría a evaluar para el taponamiento vaginal, preferiblemente al mismo tiempo todos los días (mediodía). Día e0.5 corresponde al primer día, cuando se observa un tapón vaginal.
    Nota: Los experimentos descritos aquí se pueden realizar en ratones de tipo salvaje. Sin embargo, para facilitar la identificación de la MGE y etiquetar todos INs GABAérgico (o subconjuntos específicos como INs MGE-derivado), animales transgénicos se pueden utilizar (por ejemplo: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre con un alelo de Cre-reportero, etc.47,49). En esta situación, el plásmido experimental inyectado debe expresar otro fluoróforo (por ejemplo mCherry o TdTomato) para permitir la visualización de los INs transfected (amarillo) que puede ser comparado con no transfectadas in (verde).
  2. La mujer en el día embrionario e13.5, de sacrificio por dislocación del cuello.
    Nota: Los agentes anestésicos en el momento del sacrificio pueden afectar en la migración y la supervivencia50,51 y deben evitarse.
  3. Recoger embriones por cesárea como sigue.
    1. Rocíe generosamente el abdomen femenino con etanol al 70%. Levante la piel del abdomen con un par de pinzas esterilizadas y con la otra mano, utilice tijeras quirúrgicas esterilizadas para cortar la piel del abdomen.
    2. Con un segundo par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de la fascia abdominal y cortarlo evitando cuidadosamente el útero.
    3. Con un tercer par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de los cuernos uterinos y cortar fuera de la cavidad pélvica. Colocar los cuernos uterinos disecados en un plato de petri 60 mm estéril llenado de nervios basado en el medio de cultivo suplementado con aminoácidos, vitaminas y sales inorgánicas (véase Tabla de materiales para productos comercialmente disponibles).
  4. En un gabinete de bioseguridad estéril, usar dos pares de Pinzas finas (una en cada mano) para diseccionar los embriones de la placenta y aislar las cabezas por decapitación.
  5. Corte de bisel la punta de una pipeta de transferencia plástica estéril 3 mL, aspirar las cabezas y transferencia en una nueva placa de petri estéril 60 mm capas con cera negra solidificada y llena con la misma base de nervios suplido medio de cultivo como el anterior.
    Nota: Este paso minimiza a la transferencia de contaminantes (pelo de ratón, sangre). La cera negra se utiliza para estabilizar la cabeza durante la disección. Medios de cultivo no necesita ser oxigenada durante estos procedimientos.

4. intraventricular plásmido inyecciones y electroporación Ex Vivo de la MGE

Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en condiciones estériles en el gabinete de bioseguridad previamente preparado.

  1. Capas de lugar el plato de petri de 60 mm con cera negra y que contiene las cabezas decapitadas en neural basado suplido medio de cultivo con los prismáticos en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  2. Estabilizar la cabeza, la parte rostral hacia la derecha, con las pinzas finas con la mano izquierda y use el inyector de nano en la mano derecha para inyectar 1-2 μl de la solución de plásmido/tinte de ventrículo lateral derecho.
    Nota: Pueden ser experiencias de coexpresión realizado por co-electroporating un plásmido de rescate y un plásmido del shRNA-expresión mezclando ambos plásmidos en concentraciones equimolares.
  3. Electroporate el cerebro inyectado.
    1. Coloque la cabeza entre los electrodos con el electrodo negativo situado dorsalmente y paralelo a la cabeza y el electrodo positivo hacia el lado ventral de la cabeza para apuntar el MGE.
    2. Una vez que los electrodos están bien posicionados, entregar 4 pulsos cuadrados de 40 V de 50 ms a ms 500 pulsos entre intervalos.
    3. Quitar cualquier tejido residual de los electrodos mediante pinzas ya colocadas en la bioseguridad gabinete.
      Nota: Estos parámetros se han optimizado específicamente para la electroporator utilizado en nuestros experimentos. Recomendamos que los usuarios realizan pruebas optimizando previamente si se utiliza un tipo diferente de electroporator.
    4. Repita los pasos 4.1 a 4.3 para todos los cerebros restantes.
      Nota: Aunque este protocolo describe las manipulaciones necesarias para un cerebro, es posible inyectar hasta 4 cerebros secuencialmente antes de electroporating cada cerebro, aumentando así el rendimiento. Esta estrategia es especialmente ventajosa cuando 2 o más diferentes plásmidos se inyectan secuencialmente (control o experimental plásmido) durante el mismo experimento (permitiendo comparación entre hermanos de camada). Además, es posible inyectar y electroporate simultáneamente ambos lados del cerebro para aumentar el rendimiento, colocando los electrodos completamente paralelo a la superficie del cerebro.

5. disección y culturas Organotypic rebanada del cerebro

  1. Mientras manipula aún en el ambiente estéril de la gabinete de bioseguridad, diseccionar el cerebro fuera del cráneo.
    1. Estabilizar la cabeza en la capa de cera negra insertando una aguja en cada ojo evitando cuidadosamente el cerebro.
    2. Use un par de Pinzas finas para sostener el lado izquierdo del cuello y un segundo par de Pinzas finas para rasgar la piel del cráneo, de atrás hacia delante.
    3. Manteniendo la cabeza lateralmente con las pinzas en una mano, utilice otro par de pinzas en la otra mano para cortar con cuidado el cráneo a nivel del tronco encefálico y tire suavemente el cráneo hacia arriba. Con cada pinza, corte del cráneo en el plano sagital (línea media) hacia el frente y luego incidir lateralmente para liberar a los fragmentos de cráneo.
    4. Levante el tronco del encéfalo y corte cuidadosamente las meninges y nervios craneales hasta el cerebro está completamente fuera del cráneo.
      Nota: Todos los pasos descritos en 5.1 deben realizarse bajo estrictas condiciones de esterilidad en un gabinete de bioseguridad.
  2. Incrustar el cerebro en 4% agarosa de punto de bajo punto de fusión para seccionamiento.
    1. Llenar un plato de petri de 35 mm con la solución de agarosa preparada anteriormente (mantenerse líquido a 42 ° C).
    2. Transferir rápidamente un cerebro de electroporated al plato lleno de agarosa utilizando la pipeta de transferencia anteriormente cortado. Mantener el plato a temperatura ambiente.
    3. Revuelva la agarosa con un palo de metal para mantener el cerebro en el medio del pozo (para evitar el hundimiento) y colocar el cerebro en un rostro caudal plano paralelo al plato. Dejar de revolver cuando la agarosa se solidifique, para evitar cualquier daño de cerebro.
    4. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la agarosa que rodean el cerebro para formar un bloque rectangular, dejando un margen de 1-2 milímetros alrededor del cerebro. Asegúrese de que la parte rostral del cerebro es perpendicular al límite anterior del bloque para facilitar la orientación para los pasos posteriores de seccionamiento.
    5. Repita para cada cerebro.
      Nota: Es posible cortar más de un cerebro a la vez (máximo 3) formando bloques de agarosa separado mientras cada cerebro en distintas alturas.
  3. Secciones coronales de vibratome y sector cultura.
    1. Descongelar una alícuota de 100 X N-2 suplemento (150 μL) en el hielo y añadir al medio de cultivo alícuotas de 15 mL en condiciones estériles.
    2. Transferencia de 750 μl del medio de cultivo (con suplemento de X N2 1) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos.
    3. Con una pinza curva, coloque una célula cultura (diámetro de 30 mm, 0,4 μm de tamaño de poro, PTFE) en cada bien llenas de medio.
    4. Llene el baño vibratome con ACSF continuamente oxigenada. Enfriar a 4 ° C con hielo alrededor de la bañera, o utilizar un vibratome refrigerado.
    5. Ajustar la velocidad de vibratome a 0.150 mm/s y la frecuencia de 80 hertzios.
    6. Pegar el bloque de agarosa en la plataforma de vibratome, borde rostral hacia abajo y ventral borde frente al usuario.
    7. Cortar el cerebro en secciones coronales para obtener 250 μm de espesor secciones (a 4 ° C).
    8. Con espátulas estériles, recoger secciones de 2-3 que contiene el MGE y lugar insertar todas las secciones del cerebro de un animal en una sola membrana de 30 mm, evitando cuidadosamente la superposición entre las secciones. Coloque el inserto en un pozo de una placa de cultivo de 6 pozos (contiene 750 μl de medio de cultivo suplementado, como se describe anteriormente). Por otra parte, cada sección puede colocarse en una membrana independiente de 13 mm de diámetro en una placa de cultivo de 12-bien llenada con medio de cultivo de 500 μl suplido. La cantidad de medio de cultivo recomendado para cada pozo permite que las secciones del cerebro ser alimentado por los medios de comunicación sin ser sumergido.
      Nota: Los pasos descritos en 5.3.6 y 5.3.7 no llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad completadas, a menos que el vibratome puede ser esterilizado y usado en un gabinete de bioseguridad. Por lo tanto, es crucial para llevar a cabo estos pasos con cuidado para evitar cualquier contaminación. Equipo de protección adecuado (mascarilla limpia, guantes quirúrgicos y bata de laboratorio) se debe usar en todo momento y partes del cuerpo, incluso cubiertas, tales como pelo, cara y manos, nunca debe pasar por placas (con o sin medio de cultivo). También se recomienda rociar etanol al 70% con frecuencia en los guantes y espátulas que se utiliza para recoger las secciones de la cerebral.
    9. Coloque la placa de cultivo en una ventilado incubadora estéril a 37 ° C con 60% humedad y 5% CO2 para 48 o 72 h.
      Nota: Estos tiempos de incubación fueron optimizados para la proyección de imagen de Time-lapse de INs derivados de MGE y proyección de imagen confocal de rodajas fijas, respectivamente. Tiempos de incubación óptimo deben analizarse previamente para cada diseño experimental. Además, si la incubación elegida es de 72 h y bajo, es necesario cambiar el medio de cultivo. Tiempos más largos de incubación, el medio de cultivo debe cambiarse cada 2-3 días.
    10. Después de la hora deseada de la incubación, transferir las secciones de interés a un cubreobjetos de 8 cámaras y añadir 3-5 μl de medio de cultivo. Lugar el cubreobjetos en una cámara ambiental (37 ° C, 60% de humedad, 5% CO2) conectado a un invertido de giro confocal de disco equipado con un software de adquisición informática para instalar la sesión Time-lapse de imágenes.
      Nota: Como alternativa, las secciones se pueden fijar con paraformaldehído al 4% (durante la noche a 4 ° C o 2 h a temperatura ambiente) y posteriormente immunostained con anticuerpos diferentes para la visualización de las características morfológicas del electroporated INs bajo un confocal microscopio. Aunque eGFP y mCherry pueden visualizarse por microscopía confocal sin ningún procedimiento contra manchas, se recomienda realizar inmunohistoquímica contra GFP y mCherry para mejorar la señal ya que el proceso de fijación puede reducir la fluorescencia, reduciendo la detección de los componentes más finos de neuronas embrionarias, como pequeñas ramas en los procesos principales o finales.

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Resultados

En esta sección, ofrecemos resultados representativos obtenidos tras la electroporación ex utero de un plásmido de control, o de un plásmido experimental dirigido a un gen de interés, en el MGE de embriones de ratón e13.5 seguido organotypic rebanada culturas se incubó a 37 ° C durante 48 h (para la proyección de imagen de Time-lapse) o 72 h (para fijación y etiquetado immunohistochemical) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Ejempl...

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Discusión

En este artículo, nos proporcionan un método confiable para realizar ex útero electroporación del ratón MGE en e13.5 y para la generación de culturas organotypic de rebanadas del cerebro embrionario. Aunque en vitro métodos, tales como el análisis de la cámara de Boyden, son relativamente fáciles de realizar y pueden utilizarse para evaluar los roles específicos de diferentes genes y proteínas sin la interferencia de otros factores, impide la investigación de IN dinámica de migración con ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar. Las opiniones aquí expresadas no necesariamente representan las opiniones de la Ministra de salud o el gobierno de Canadá.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Saboya y la Fundación de epilepsia de la curación de funcionamiento y por el equipo de becas de la Fundación Canadiense para la innovación E.R (microscopio confocal) y G.H (microscopio confocal de disco de spinning). E.R. recibe un premio de carrera de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Premio clinician-Scientist) así como de los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR; Premio al investigador joven). G.H. es un erudito principal del FRQ-S. L.E es el destinatario del Premio Steriade Saboya posdoctoral de la Fundación de Saboya, la formación postdoctoral CHU Sainte-Justine Fundación y el Premio de formación postdoctoral FRQ-S, en colaboración con la Fundación de las estrellas. Este proyecto ha sido posible por el Canadá de cerebro a través del fondo de investigación cerebral de Canadá, con el apoyo financiero de Canadá de la salud, otorgado a L.E.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103049Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplementThermoFisher Scientific1750404450X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11415064Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Horse serum, heat inactivatedMillipore-SigmaH1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100XWisent305-016Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mLVWR89132-062
Class II Type A Biosafety CabinetNuaireNU-540
SucroseBioShopSUC700.1
Sodium ChlorideBioShopSOD001.1
Sodium bicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
D+ glucoseMillipore-SigmaG7528-250G
Potassium ChlorideThermoFisher ScientificP217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrousBioShopSPM400.500
Calcium chloride dihydrate ThermoFisher ScientificC79-500
Magnesium sulfate heptahydrateBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.547.004
1.5 mL centrifuge tubesSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette pullerSutter Instruments Co.Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary TubeDrummond scientific1-000-800/12
EthanolVWRE193
5 mL syringeBecton Dickinson & Co309646
Mineral Oil (heavy)Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5World Precision Instruments50451111 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7World Precision Instruments50450411.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC TweezersWorld Precision Instruments50461711 cm, Straight, flat
Operating scissorsWorld Precision Instruments50122516 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing ForcepsWorld Precision Instruments50121712.5 cm, straight, serrated
Iris ForcepsWorld Precision Instruments50447810.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue ForcepsWorld Precision Instruments50199615 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded endsFisherScientific21-401-5You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.390160-mm dish
Tissue culture dishSarstedt83.180035-mm dish
Black WaxFisherScientificS17432
Transfer pipettes Ultident170-CTB700-2123 mL, small bulb
Stereo MicroscopeLeica BiosystemsLeica M80In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtomeLeica BiosystemsVT1000S
GEM, Single edge razor bladeElectron Microscopy Sciences71952-10Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 wellIbidi80827Pack of 15
Millicell cell culture insertMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscopeLeica MicrosystemsN/A
Spinning disk confocal head Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 acquisition softwareImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage top incubation systemPathology devicesLC30030Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscopeLeica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Gift from Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25G25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

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