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Resumen

Hay una escasez de donantes de hígado significativa, y se han ampliado los criterios de los donantes de hígado. Perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) ha sido desarrollada para evaluar y modificar la función del órgano. Este estudio muestra un modelo de rata de NEVLP y pone a prueba la capacidad de pegilado-catalasa, para mitigar la lesión hepática de preservación.

Resumen

Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante, y en respuesta se han ampliado los criterios de los donantes. Como resultado, perfusión normotérmica ex vivo hígado (NEVLP) se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función del órgano. NEVLP tiene muchas ventajas en comparación con hipotermia y subnormothermic perfusión incluyendo reduce lesiones de preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, evaluación de funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos , remodelación y modificación. Modelos NEVLP murinos y porcinos se han descrito. Nos muestran un modelo de rata de NEVLP y utilizar este modelo para mostrar una de sus importantes aplicaciones, el uso de una molécula terapéutica añadida a la solución de hígado. La catalasa es un limpiador de endógeno reactivas del oxígeno (ROS) las especies y se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio. Aquí, hemos añadido pegilado-catalasa (PEG-CAT) a la solución base y demostrado su capacidad para mitigar la lesión hepática de preservación. Una ventaja de nuestro modelo NEVLP roedor es que es barato en comparación con los modelos animales más grandes. Una limitación de este estudio es que actualmente no incluir perfusión después del trasplante del hígado. Por lo tanto, la predicción de la función del post-trasplante de órganos no se puede realizar con certeza. Sin embargo, el modelo de trasplante de hígado de rata está bien establecido y ciertamente podría ser utilizado en conjunción con este modelo. En conclusión, hemos demostrado un modelo NEVLP barato, simple y fácilmente replicable con ratas. Las aplicaciones de este modelo pueden incluir pruebas de perfusates novela y aditivos de la solución, prueba software diseñado para la evaluación del órgano y experimentos diseñados para reparar órganos.

Introducción

Hay 14.578 pacientes en lista de espera para el trasplante hepático y aproximadamente 7.000 trasplantes se realizan por año1,2. En respuesta a esta escasez de donantes importantes, se han ampliado los criterios de los donantes de hígado; Estos se refieren a menudo como órganos marginales o donantes criterios extendidos y se esperan que realice menos bien después del trasplante de aloinjertos de criterios estándar, con tasas mayores de disfunción primaria del injerto y de la función retardada del injerto3, 4,5,6. Como resultado, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rata de NEVLP y utiliza este modelo para demostrar uno de sus potenciales aplicaciones importantes – las pruebas de aditivos de la novedosa molécula a solución de hígado.

NEVLP se ha evaluado en modelos porcinos y murino (rata), así como en órganos humanos desechados6,8,9. Los resultados de los primeros ensayos humanos de NEVLP recientemente han sido publicados10. Aunque la perfusión hipotérmica de la máquina se ha convertido claramente en el estándar para la preservación del riñón, la temperatura en que máquina hígado ocurre perfusión es aún controversial. NEVLP tiene muchas ventajas propuestas en comparación con hipotermia y perfusión de subnormothermic. Estos incluyen lesión menor preservación, restauración de la función normal del órgano en condiciones fisiológicas, la capacidad para evaluar el funcionamiento del órgano y como una plataforma para la reparación de órganos, remodelación y modificación7,11, 12,13,14,15,16,17.

Se han completado un número significativo de estudios utilizando modelos NEVLP porcinos. Aunque estos modelos son comparativamente baratos teniendo en cuenta modelos descartados los órganos humanos o ensayos clínicos en humanos, son muy caros en comparación con nuestro modelo NEVLP animal pequeño. Un componente significativo de la por experimento costo es la solución. Somos capaces de terminar una perfusión de 4 h con 300 mL de solución a un costo relativamente bajo. Además, el costo de pequeños animales tales como ratas es muy bajo en comparación con el costo de los cerdos.

En comparación con otros modelos de NEVLP en la rata, el modelo presentado aquí es relativamente fácil de implementar y tiene una amplia gama de aplicaciones. El circuito de perfusión puede verse en la figura 1. La solución comienza en el depósito de la solución (1), que es un recipiente con camisa de agua. Solución es extraído del depósito por una bomba de rodillos (2) y empujó en un windkessel (3) y, a continuación, el oxigenador (4). El oxigenador se encuentra gas a contracorriente y flujo de la solución para proporcionar intercambio gaseoso máximo. La solución entonces procede a un calentamiento de la bobina interior (5) la cámara de perfusión para asegurarse de que está a temperatura fisiológica, y una trampa de burbujas (6) para evitar la perfusión de burbujas de aire que son pre-órgano (7) y post-órgano (8) puertos de la muestra, que permiten la solución a ser muestreadas. La solución entonces entra en el hígado a través de la cánula de la vena porta. La cánula de la vena porta está conectada a un monitor de presión que traza los valores en el software de colección de datos. La solución entonces sale del hígado a través de la cánula de la vena cava inferior y desemboca en el bloque de ecualizador de presión (9). Finalmente, la solución es extraída el bloque de presión por la bomba de rodillo y vaciar en el depósito. Este modelo incluye una perfusión continua a la vena porta y deja fuera el flujo pulsátil de la arteria hepática y la diálisis en algunos otros modelos, cada uno de ellos requiere un circuito independiente y adicional, pero anteriormente se han demostrado para no ser requiere9,13.

Para explorar la adición de una molécula terapéutica novedosa para la solución, optamos por la enzima catalasa. La catalasa es un limpiador ROS endógeno que participa en el mecanismo interno de defensa de las células para mitigar los efectos de ROS18. Expresión de catalasa se incrementa en hepática isquemia reperfusión lesiones19. Experimental además de catalasa se ha demostrado para disminuir la isquemia reperfusión en el ojo, cerebro y pulmón20,21,22,23,24. La pegilación ha demostrado a catalasa al endotelio y ayuda en la absorción de catalasa en las células endoteliales25. PEG-CAT se ha administrado sistémicamente con limitada eficacia en la reducción de lesión de la isquemia-reperfusión hepática; sin embargo, la hipótesis de que añadir QUE PEG-CAT a un circuito de perfusión de órgano aislado conduciría a mejores resultados26,27,28. Aquí, añadimos PEG-CAT a nuestra solución base y demostrar su capacidad de mitigar la lesión hepática de preservación.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron realizados según los lineamientos de la atención institucional de Animal y Consejo Nacional de investigación de la guía para el cuidado humanitario y uso de laboratorio de animales (IACUC) y ha sido objeto de aprobación por el Comité de estado de Ohio Universidad IACUC.

1. primera instalación

  1. Preparar la solución de perfusión mediante la combinación de lo siguiente: 86 mL de albúmina 25%, 184 mL de medio de Williams, 30 mL de penicilina/estreptomicina (10 U/mL penicilina y 0.01 mg/mL estreptomicina), insulina (50 U/L), heparina (0.01 U/mL), L-glutamina (0,292 g/L), y hidrocortisona (0,010 g/L) para un volumen total de 300 mL. Para el grupo de PEG-CAT y solución base, añadir 625 U/mL de PEG-CAT.
    1. Tampón de la solución solución tris (hidroximetil) aminometano (THAM) a pH 7,4. Utilice una máquina de gas de sangre arterial para confirmar el pH de la solución.
  2. Establecer el circuito (figura 1).
    1. Encender el baño de agua caliente y ponerlo a 37 ° C. Permita que la cámara de órgano calentar.
    2. Vierta la solución mixta y amortiguada en el tanque y comenzar la circulación.
      Nota: La solución en este paso se preparó en el paso 1.1.1.
    3. Encienda el gas oxigenante (95% oxígeno y 5% dióxido de carbono) el contador de flujo a través del oxigenador en línea.
    4. Abra el software de colección de datos y haga clic en "start" grabar para la duración del experimento.
  3. Configurar el microscopio quirúrgico y la sala de operaciones (figura 2).
    1. Encienda todos los equipos incluyendo la placa de calentamiento, electrocauterización y la anestesia y signos vitales (saturación y oxígeno del corazón), equipo de monitoreo.
      Nota: La configuración del microscopio variará según el microscopio y se puede ajustar a la comodidad del usuario.
    2. Llene la jeringa de anestesia de 10 mL con 10 mL de isoflurano líquido para inhalación (peso molecular 184.5 g/mol) y en la unidad de anestesia.
    3. Coloque una jeringa de 0.5 mL de heparina (50 U), los instrumentos quirúrgicos, 4-0 y 7-0 seda sutura, torundas de algodón estériles y esponjas de Gasa de 4 x 4 cm no tejido adecuadamente (figura 2).
  4. Preparar la cámara de isoflurano.

2. inducción de la anestesia

  1. Use el siguiente equipo de protección personal (EPP): Mascarilla quirúrgica, guantes quirúrgicos, vestido disponible.
  2. Peso de la rata.
    Nota: Utilizamos ratas Sprague-Dawley entre 250-350 g.
  3. Encienda el compresor de oxígeno y el isoflurano. Lugar la rata, después de ser pesado, en la cámara de isoflurano y asegure la tapa. Inducir la anestesia con isoflurano 6% entregado con 2 L/min de oxígeno.
    Nota: La dosis de isoflurano exacta utilizada dependerá el sistema de anestesia específico utilizado.
  4. Uso electrónicos cortauñas de clip pelo abdominal del animal.
  5. Vuelva a colocar el animal en la cámara de isoflurano.
  6. Encienda la unidad de anestesia en el quirófano.
  7. Quite la rata de la cámara de isoflurano cuando completamente se induce la anestesia. Confirmar la profundidad de la anestesia utilizando una pizca del dedo del pie.

3. procedimiento de contratación

  1. Prepare el brazalete portal 16 G (figura 3).
    1. Comenzar con un angiocatéter 16 G. Corte una sección de 7 mm de la tubería. Determinar el punto medio de la sección 7 mm midiendo 3,5 mm. incide en el punto medio y retire la mitad anterior de la tubería.
    2. Use una pinza hemostática para triturar esta porción ahora plana. Utilizar un encendedor para derretir el otro extremo del angiocatéter para crear un labio. No coloque la punta directamente en la llama o se inflama.
  2. Preparar la cánula del conducto biliar.
    1. Tomar un angiocath de 27 G y corte el puerto de inyección dejando sólo el catéter. Conecte una sección de 10 cm de la tubería de canular 27 G.
  3. Posición de la rata con su nariz en el cono de nariz de anestesia y sus cuatro extremidades inmovilizadas. Monitorear los signos vitales conectando el monitor a la extremidad trasera izquierda. Realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar la adecuada profundidad de la anestesia. Continuar la anestesia en el 4% de isoflurano (para animales que pesan > 250 g).
  4. Rocíe el abdomen del animal con alcohol isopropílico al 70%. Deje que se seque. Colocar un paño estéril sobre el animal.
  5. Hacer una incisión de línea media desde el xifoides al pubis usando afiladas tijeras y que se extiende a través de la piel (figura 4). Suavemente entre el peritoneo y haga una incisión en el músculo. Tenga cuidado para evitar daños a la vejiga en el aspecto inferior de esta incisión y el hígado en el aspecto superior de esta incisión.
  6. Extender la incisión lateralmente a la izquierda y derecha para formar una cruz a nivel del borde inferior del hígado.
  7. Gire a la anestesia al 2% (para animales de peso > 250 g).
  8. Retraer el proceso de xiphoid utilizando una pinza de mosquito curva y las costillas con los retractores de la costilla (figura 5).
  9. Corte el falciforme, el frénico y los ligamentos gastrohepático con unas tijeras afiladas.
  10. Localice y amarre la vena frénica con una sutura 7-0 como cerca de su origen como sea posible para evitar fugas.
  11. Desentrañan la rata usando un aplicador de punta de algodón estéril humedecido y envuelva el intestino en una gasa humedecida con solución salina normal 0.9%. Tenga cuidado de no para estirar la vasculatura del intestino.
  12. Disecar en la vena cava inferior (IVC) para eliminar el exceso de tejido. Disecar detrás de la vena cava inferior apenas superior a la bifurcación y pasar un bucle de una sutura de seda 4-0 para su uso posterior (figura 6).
  13. Retraiga el riñón derecho para proporcionar la exposición a la vena suprarrenal derecha. Retracción del lóbulo derecho del hígado superiormente con una gasa. Atar la vena suprarrenal derecha con una sutura de seda 7-0 a la vena cava inferior como sea posible y cauterizar a través de lo distal a la ligadura (figura 7).
  14. Cuidadosamente diseca hacia fuera de la vena esplénica, atar apagado usando dos suturas de seda 7-0 y atraviesan entre las dos suturas.
  15. Atar y ligar las venas adicionales utilizando sutura seda 7-0 para la longitud adicional en la vena porta, si es necesario.
    Nota: A veces hay pequeñas ramas de la infrahepatic IVC entre la vena suprarrenal derecha y el hígado inferior.
  16. Diseccionar alrededor de la arteria gastroduodenal, ate la arteria gastroduodenal con una sutura de seda 7-0 y ligar la arteria gastroduodenal.
  17. Diseccionar alrededor de la arteria hepática y luego un empate de 7-0 sutura seda alrededor (figura 8).
  18. Disecan hacia fuera de la vía biliar.
    1. Comprobar la longitud de la vía biliar. Ate la vía biliar en el extremo distal con una sutura de seda 7-0. Colocar un lazo de sutura seda 7-0 alrededor de la vía biliar proximal como sea posible.
    2. Corte un agujero que es la mitad del diámetro del conducto con una pequeña tijera y colocar un catéter de 27 G en el conducto biliar proximal. Atar el catéter en su lugar usando una sutura de lazo de sandalia romana (figura 9).
  19. Inyectar 0,5 mL de heparina (50 U) en la vena del pene o IVC del animal utilizando una aguja de 27 G.
    Nota: Una jeringa de insulina 27 G puede usarse en su lugar.
  20. Sujetar y atar la vena cava inferior usando previamente colocado sutura seda 4-0.
  21. Ate la arteria hepática utilizando previamente colocado sutura seda 7-0.
  22. Abrazadera de la vena porta con un clip de microcirugía. Canule la vena porta con un angiocatéter de 22 G. Ras, la vena porta con 60 mL de frío 0,9% suero fisiológico con heparina 1 mL (100 U) hasta el hígado palidece (figura 10).
    Nota: Si el hígado no blanch inmediatamente puede ser masajeado con aplicadores de punta de algodón estéril.
  23. Exponer la suprahepática IVC y cortan como alta en el pecho como sea posible.
  24. Realizar una hepatectomía como sigue. Cortar alrededor del diafragma, cortar la arteria hepática, cortar la vena cava inferior, cortar la vena porta, cortar cualquier ligamentos adicionales y sacar el hígado. Colocar el hígado en hielo frío 0,9% solución salina normal (figura 11).
  25. Colocar un manguito vascular 16 G en la vena porta (figura 12). Ponga el hígado sobre el circuito de perfusión hepática normotérmica ex vivo .

4. perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

Nota: La solución utilizada aquí fue preparada en el paso 1.1.1 de protocolo.

  1. Coloque la cánula de la vena porta y la vena porta con manguito (figura 13).
  2. Durante la colocación de la cánula de la vena porta, mantener el flujo de la solución a través del circuito en 2 mL/min para empezar. Mira al monitor para cualquier picos en la presión de la vena porta; Esto puede indicar que el buque ha ocluirse y recolocación de la cánula es necesario.
  3. Sutura en la cánula de la vena cava inferior para el flujo de vuelta de la solución usando una sutura de seda 7-0.
  4. Una vez ambas cánulas, comenzar a subir el flujo de 1 mL/min hasta una presión fisiológica en el rango de 10 – 16 cmH2O.
  5. Tomar una muestra de 1 mL de pre y post-puertos en 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min de la perfusión. Dividir la muestra de 1 mL en dos muestras de 0,5 mL.
    Nota: se utilizará en el paso de protocolo 4.5.2 0.5 mL de este se utilizará en el paso de protocolo 4.5.1 y 0.5 mL.
    1. Snap freeze 0,5 mL de esta muestra en tubos criogénicos de nitrógeno líquido.
    2. Ejecutar un análisis de gas de sangre arterial con la restante 0,5 mL de solución.
    3. Después de ejecutar el análisis del gas de sangre en cada momento (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min) examinar los niveles de pH y el tampón de la solución según sea necesario para volver a pH 7,4.
  6. En la conclusión de 4 h de perfusión, desconecte el hígado desde el circuito de perfusión. Dividen el hígado en segmentos de 0.5 g. Complemento congelar el tejido del hígado en tubos criogénicos de nitrógeno líquido.

5. experimento posterior al análisis

  1. Determinar alanina aminotransferasa (ALT) en la solución a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min usando un kit de ensayo colorimétrico comercial.
    1. En Resumen, incubar la solución con los reactivos de la mezcla de reacción a 37 ° C durante 60 min medida de los valores de la densidad óptica a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
  2. 0.5 g de tejido hepático con 100 μl de tampón de lisis de homogeneizar y analizar el tejido lisado de trifosfato de adenosina (ATP), glutatión (GSH) y malondialdehído (MDA).
    1. En Resumen, medir los niveles de ATP de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar la muestra con el tampón de reacción e incubar a temperatura ambiente durante 30 min medir la densidad óptica a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
    2. Medir los niveles GSH de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar las muestras de tejido con el cóctel de ensayo. Medir los valores de densidad óptica a 405-414 nm.
    3. Medir los niveles MDA de las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de análisis comercial. Mezclar las muestras con TBA y calor a 95 ° C por 60 minutos, centrifugar el reactivo y transferir el sobrenadante a una placa de 96 pocillos. Medir la densidad óptica a 532 nm.
  3. 0.5 g de tejido hepático con 100 μl de tampón de lisis de homogeneizar y analizar el tejido lisado para actividad de caspasa-3/7 relativa utilizando un kit de análisis comercial.
    1. Mezclar el tejido lisado con el tampón de ensayo de caspasa-3-7 reactivo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Medir el nivel de fluorescencia en cada bien con un lector de microplacas.
  4. Determinar el nivel de células apoptóticas en las muestras de tejido del hígado utilizando un kit de detección comercial en situ la muerte.
    1. Tratamiento previo de 0.5 g de tejido secciones con 10 U/mL proteinasa K durante 10 minutos y luego incubar con la mezcla de reacción a 37 ° C durante 60 minutos realizar el análisis utilizando un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Se utilizó un tamaño de muestra de tres ratas por grupo. ALT se midió a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min de la perfusión. Utilizamos del estudiante t-pruebas para comparar resultados entre la solución base y solución base más grupos PEG-CAT en cada momento. En la comparación de la solución base y solución base más grupos PEG-CAT, que es significativamente menor (p < 0,05) ALT en la solución base plus grupo PEG-CAT de 150, 180, 210 y 240 min (

Discusión

Existe una escasez importante de allografts del hígado para el trasplante y en respuesta criterios de donante han ampliado1,2,3,4,5. Como consecuencia de la escasez de donantes, NEVLP se ha introducido como un método para evaluar y modificar la función de órgano6,7. Hemos diseñado un modelo de rat...

Divulgaciones

Todos los autores informan que no tienen ninguna información relevante.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH T32AI 106704-01A1 y T. Flesch fondo para trasplante de órganos, la perfusión, ingeniería y regeneración en la Universidad Estatal de Ohio.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusate
8% AlbuminCLS Behring, King of Prussia, PA0053-7680-32
Williams MediaSigma Aldrich, St. Louis, MOW1878
Penicillin/StreptomycinSigma Aldrich, St. Louis, MOP4333
InsulinEli Lilly, Indianapolis, IL0002-8215-91
HeparinFresnius Lab, Lake Zurich, ILC504701
L-glutamineSigma Aldrich, St. Louis, MOG3126
HydrocortisoneSigma Aldrich, St. Louis, MOH0888
THAMHospira, Inc,0409-1593-04
Polyethylene Glycol - CatalaseSigma AldrichS9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical MaskGenericN/A
Protective GownGenericN/A
Surgical GlovesGenericN/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley RatHarlan Sprague Dawley Inc.250 -350 grams
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Charcoal CanistersKent ScientificSOMNO-2001-8
IsofluranePiramal HealthcareN/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe Valco Instruments Co, Inc.SOMNO-10ML
Electrosurgical UnitMacanMV-7A
Warming PadBraintree ScientificHHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RT
Isoflurane chamberKent ScientificSOMNO-0530LG
SurgiVetIsotecCDS 9000 Tabletop
OxygenPraxair98015
Rib retractorsKent ScientificINS600240
GenieTouchKent ScientificGenieTouch
Normal SalineBaxterNDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven SpongesCriterion104-2411
Sterile Q-TipsHenry Schein Animal Health1009175
U-100 27 Gauge Insulin SyringeTerumo22-272328
5mL SyringeBDREF 309603
4-0 Braided Silk SutureDeknatel, Inc.198737LP
7-0 Braided Silk SutureTeleflex MedicalREF 103-S
16 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4252586-02
14 gauge CathetersBBraun Introcan Safety4251717-02
Bile Duct Cannular TubingAltec01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath WarmerLauda Ecoline StareditionE103
Data Collection SoftwareADInstruments Labchart 7
Liver Perfusion CircuitHarvard Apparatus73-2901
Membrane OxygenatorMediac SPAM03069
Roller PumpIsmatecISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide)Praxair98015
Organ ChamberHarvard ApparatusILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic TubeUSA Scientific1418-7410
MucasolSigma-AldrichZ637181
Microsurgical Instruments
Small ScissorsRobozRS-5610
Large ScissorsS&TSAA-15
Forceps - Large AngledS&TJFCL-7
Forceps - Small AngledS&TFRAS-15 RM-8
Clip ApplierROBOZRS-5440
Scissors - non microFST 14958-1114958-11
Forceps - Straight TipS&TFRS-15 RM8TC
Large Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-01
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-02
Small Microsurgical ClipFine Scientific Tools18055-03
Small Mosquito ClampsGenericN/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay KitBioVisionK354
Glutathione Assay KitCayman Chemical703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay KitAbcamab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay SystemsPromegaG8090
POLARstar OMEGA Microplate ReaderBMG LABTECHN/A

Referencias

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