Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Resumen

In vivo, la activación, proliferación y función de las células inmunes todos se producen en un entorno tridimensional (3D), por ejemplo en los ganglios linfáticos o tejidos. Hasta la fecha, la mayoría en vitro sistemas se basan en dos dimensiones (2D) las superficies, como las placas de cultivo celular o cubreobjetos. A óptimo imitan las condiciones fisiológicas en vitro, utilizamos una matriz de colágeno 3D simple. Colágeno es uno de los principales componentes de la matriz extracelular (ECM) y ha sido ampliamente utilizado para constituir matrices de 3D. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) se presenta con alta velocidad, la profundidad de penetración grande, blanqueo bajo y fotocitotoxicidad. Además, microscopia de la hoja de luz es particularmente ventajosa para medición a largo plazo. Aquí se describe un protocolo optimizado cómo configurar y manejar las células inmunes humanas, por ejemplo primario humano los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células natural killer (NK) en la matriz de colágeno 3D para uso con la microscopia de luz-hoja para la proyección de imagen de células vivas y muestras fijadas. Se presentan el procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de la migración de la célula. Especial atención se da a resaltar pasos críticos y los factores para preparación de muestras y análisis de datos. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en una matriz de colágeno 3D y no se limita a las células inmunes.

Introducción

Más conocimiento acerca de la migración las células viene de 2D^1,2,3, los experimentos que se realizan normalmente en una superficie de vidrio o plástico de una cultura/proyección de imagen de plato. Sin embargo, una situación fisiológica requiere, en la mayoría de los casos, un microambiente 3D, en el que la matriz extracelular (ECM) juega un papel decisivo. ECM no sólo proporciona lo esencial de la estructura en 3D para mantener la morfología de la célula adecuada sino también ofrece señales de supervivencia o las señales direccionales para un óptimo funcionamiento de muchas células^4,5 . Por lo tanto, un entorno 3D es necesario para identificar mejor las funciones celulares y comportamiento en un entorno que mejor reflejan el contexto fisiológico.

En el cuerpo humano, la mayoría de las células especialmente las células inmunes, ejercen sus funciones bajo un escenario 3D. Por ejemplo, las células T activadas patrullan tejidos buscando las células blanco, células ingenuas T migran a través de los ganglios linfáticos en busca de sus cognadas células presentadoras de antígeno, durante la cual el modo de migración y las máquinas se adaptan a las correspondientes extracelular medio ambiente^3,6,7. El gel de colágeno 3D ha sido ampliamente utilizado como un 3D bien establecidas y bien caracterizadas de la célula cultura sistema^8,9,10. Nuestro trabajo previo demuestra que los linfocitos humanos primarios son muy móviles y migran a una velocidad promedio de aproximadamente 4.8 μm/min en una matriz de colágeno de 0.25%¹¹. Reordenamiento del citoesqueleto desempeña un papel clave en la migración celular del¹². La acumulación de pruebas demuestra que los linfocitos no se aplican solamente un solo modo de la migración pero pueden alternar con cierto comportamiento de migración dependiendo de la ubicación, microambiente, citoquinas, gradientes quimiotácticos, señales extracelulares que tune la comportamiento migratorio en diferentes formas ³.

Para analizar con fiabilidad las funciones inmunes celulares y comportamiento, por ejemplo, migración, formación de las protuberancia o transporte vesicular, es de gran ventaja ser capaz de adquirir imágenes en volúmenes relativamente grandes de 3D de manera rápida y confiable. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) ofrece una solución satisfactoria^13,14. Durante la adquisición de imágenes, se genera una hoja fina de luz estática para iluminar la muestra. De esta manera, en el plano de enfoque, un área grande se puede iluminar al mismo tiempo sin afectar las células off-plane. Esto permite una alta velocidad con un blanqueo drásticamente reducida y la fotocitotoxicidad. En este papel, describimos cómo visualizar las células inmunes humanas primarias mediante microscopía de luz de hoja y cómo analizar la migración en un escenario 3D.

Protocolo

Investigación realizada para este estudio con el material humano (cámaras sistema reducción de leucocitos de donantes de sangre humana) está autorizado por el Comité de ética local (declaración de 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) y sigue las pautas correspondientes.

1. preparación de solución de colágeno neutralizado (500 μl)

1. Transfiera 400 μL de solución stock de colágeno refrigerado (10,4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL estéril debajo de la campana de la cultura de célula. Lentamente, añada 50 μl de frío 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 μL de solución stock de colágeno refrigerados. Mezcle la solución por mosaico suavemente el tubo.
   Nota: Todas las medidas en la parte 1 deben realizarse bajo una campana de cultivo celular.
2. Añadir 8 μl de 0,1 M NaOH en 500 μl de la solución de colágeno de 1.1. para ajustar el pH a 7.2-7.6. Utilizar tiras reactivas de pH (rango de pH: 6-10) para determinar el valor de pH de la mezcla.
   Nota: Los volúmenes pueden variar para diferentes lotes de colágeno. Solución de NaOH tiene que mezclarse lentamente para evitar burbujas de aire. La mezcla debe mantenerse en hielo para evitar la gelificación de colágeno.
3. Añadir 2 μl de ddH estéril₂O para hacer el volumen final de 500 μl. Mezcle bien y almacene esta solución de colágeno (8,32 mg/mL) en hielo o a 4 ° C hasta su uso posterior.
   Nota: En esta condición, neutralizado colágeno puede utilizarse para h. 24 alícuotas no se recomiendan para evitar burbujas de aire.

2. preparación para microscopía de fluorescencia de luz-hoja con capilares

1. Etiqueta fluorescente las células vivas de interés con los tintes fluorescentes primaria deseada¹⁵ o proteínas fluorescentes¹¹ como se describió anteriormente.
2. Transferencia de 1 × 10⁶ de células en un tubo de 1,5 mL estéril bajo una campana de cultivo celular. Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de medio de cultivo.
   Nota: La densidad celular de 5 x 10⁶ células/mL se recomienda para la visualización de la migración de células inmunes humanas, especialmente de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células asesinas naturales (NK).
3. Añadir 85,9 μl de solución de colágeno neutralizado de 1.3. en la suspensión celular de 2.2. y mezclar correctamente para llegar a una concentración de 2,5 mg/mL de colágeno. Dejar la mezcla de colágeno de la célula en el hielo en la campana.
   Nota: Suponga que la concentración de colágeno es N mg/mL, el volumen de neutralizado solución de colágeno (para la suspensión de la célula de 200 μL) = 200 × N /(8.32-N)
4. A continuación, poner el pistón correspondiente en el capilar (diámetro interior ~ 1 mm) hasta que el émbolo es de 1 mm en el tubo capilar. Moje el émbolo por inmersión en medio de cultivo (figura 1A).
   Nota: Este paso puede ayudar a prevenir las burbujas de aire cuando el tubo capilar se sumerge en la mezcla de colágeno de la célula. El capilar y el buzo no debe de ser estéril.
5. Sumerja el capilar en la mezcla de colágeno de la célula de 2.3. Tire lentamente del émbolo hacia atrás para 10-20 mm (figura 1B). Limpie la pared exterior del tubo capilar con una toalla de papel humedecida con rocío de etanol 70% para eliminar la solución restante de colágeno.
6. Monte el tubo capilar con plastilina en la pared interior de un tubo de 5 mL y empuje la mezcla de colágeno de la célula hacia el borde del tubo capilar (figura 1).
7. Mantenga el tubo capilar a 37 ° C con 5% CO₂ para 1 h para la polimerización de colágeno.
8. Añadir el medio de cultivo (aproximadamente 1-2 mL) a un tubo de 5 mL. Presione con cuidado la varilla de colágeno polimerizado por en medio y alrededor de 3/4 del colágeno en el medio (figura 1).
9. Mantenga el tubo capilar, así, a 37 ° C con 5% CO₂ para otro 30 min para equilibrar la barra del colágeno con el medio.
   Nota: Luego, la barra de colágeno puede ser jalada hacia atrás a capilar y culta más antes de seguir usándolo.

3. imagen adquisición mediante microscopía de luz hoja

1. Conjunto de la cámara de la muestra según las instrucciones del fabricante.
2. Encienda la incubación y el microscopio para calentar la cámara de la muestra a 37 ° C (para celular directo imágenes solamente).
3. Coloque el capilar en el compartimiento de muestra y localizar la muestra para encontrar el área de interés para adquisición de imágenes.
4. Activar el oambos correspondiente. Establecer los siguientes ajustes: láser de potencia, tiempo de exposición, tamaño de paso de la posición z-stack, el inicio y el final de z-stack y el intervalo de tiempo para la proyección de imagen de células vivas.
   Nota: por ejemplo, la muestra en la figura 2 era reflejada cada 40 s por 6 h a 37 ° C con un tamaño de paso de 1 μm (grueso total: 538 μm). La energía del laser fue 1% con un tiempo de exposición de la Sra. 30 el tamaño del pixel en dirección x-y es 0.23 μm.
5. Iniciar la adquisición de la imagen.

4. automatizado de análisis de seguimiento

1. Abrir el convertidor de archivo, haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos imagen que se convertirá en el formato de archivo de software (*.ims). Haga clic en examinar y seleccione una carpeta para guardar los archivos convertidos. Haga clic en Inicio todos.
2. Abra el software de análisis. Haga clic en superar. Ir a archivo y haga clic en abrir, luego seleccionar el archivo imagen a ser analizada.
   Nota: Si el tamaño del archivo es grande este paso puede tomar tiempo. Archivos mayores de 1 Terabyte (TB) no se recomiendan para un experimento simple como el proceso de archivos tan grandes son capacidad computacional altamente exigentes.
3. Haga clic en agregar nuevos puntos. Marque la casilla Proceso toda imagen finalmente. Haga clic en siguiente.
4. Introduzca las coordenadas x e y (en píxeles) para definir la región de interés. Introduzca el número de marcos de tiempo y posición z para analizar. Haga clic en siguiente.
5. Seleccione el canal de destino, que contiene los objetos a ser seguido, en la lista desplegable de Canales de origen. Ingrese Estimado xy diámetro (en μm). Haga clic en siguiente.
   Nota: Estimado xy el diámetro es el diámetro promedio en la dimensión de x-y de los objetos para ser rastreados.
6. Haga clic en calidad. Definir un umbral, en el que debe incluirse la mayoría de las células (objetos). Haga clic en siguiente.
7. Elija el algoritmo deseado (se recomiendaMovimiento autorregresivo ). Introduzca la distancia máxima (se recomienda20 μm ) y el tamaño máximo vacío (se recomienda 3 o 2). Haga clic en todo el proceso de la imagen finalmente.
   Nota: Distancia de Max y Max brecha tamaño son dos umbrales para romper las pistas. Más concretamente, en dos cuadros continuos cuando la distancia entre el objeto mismo supera la distancia máxima, este objeto en el fotograma más adelante se considerará como un nuevo objeto. A veces durante la adquisición, el mismo objeto puede desaparecer por unos marcos y apareces otra vez. En este caso, solamente cuando este objeto vuelve a aparecer en el tamaño máximo del espacio, se considerará como el mismo objeto.
8. Tipo de filtro , haga clic en y elija la opción de excluir pistas no deseadas.
   Nota: Este paso es opcional.
9. Haga clic en siguiente y haga clic en Finalizar.
   Nota: Este paso puede tardar horas hasta días dependiendo el rendimiento informático.
10. Haga clic en Editar pistas y elija Deriva correcta. Seleccionar el algoritmo adecuado (se recomiendaDeriva traslacional ). Seleccione el deseado Tamaño de conjunto de datos de resultados (Nuevo tamaño igual al tamaño actual se recomienda). Haga clic en Aceptar.
    Nota: Este paso sólo es necesario cuando el colágeno se desvió durante la adquisición de la imagen.
11. Haga clic en estadísticas y elija Configurar lista de estadísticas valores visibles. Compruebe las opciones de interés para ser exportaron (por ejemplo, coordenadas, velocidad y así sucesivamente). Haga clic en Aceptar.
12. Haga clic en Todas las estadísticas de exportación a archivo e introduzca el nombre de archivo.

5. fijación y la inmunofluorescencia, tinción de células en Matrices de colágeno

1. Transferencia 1.000 μl de paraformaldehído al 4% (PFA, en PBS) en un tubo de 5 mL bajo una campana química.
   Nota: PFA debe ser equilibrado a temperatura ambiente.
2. Sumerja el capilar con colágeno polimerizado de 2.9. en la solución de la PFA (para ~ 5 m m) y Monte el tubo capilar en la pared interna del tubo de 5 mL con plastilina (como se muestra en la figura 1).
3. Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución de la PFA (figura 1). Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4. Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Sacar el tubo capilar y deseche PFA.
5. Montar el tubo capilar en un tubo nuevo y añadir 1 mL de PBS. Asegúrese de que el tubo capilar se sumerge en el PBS.
6. Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución. Monte el tubo capilar en la pared interior con plastilina.
7. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
8. Repita el 5.4. -5.7 por otro 2 veces.
9. Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Descartar el PBS. Transferencia de 1-2 mL de tampón de bloqueo/permeabilización (PBS + BSA de 1% + 0.1% de tensioactivo no iónico) en el tubo y repetir 5.6.
   Nota: La BSA (1%) puede ser sustituida por 5% de suero de los animales en que AB secundario creció.
10. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30-60 min.
11. Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Deseche el buffer de permeabilización. Transfiera 200-500 μl del anticuerpo primario en buffer de bloqueo/permeabilización y expulsa la varilla en la solución.
12. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 1 h.
13. Lave la varilla del colágeno 3 veces con SAFT (PBS + 0.1-% de tensioactivo no iónico) como descrito en 5.4. -5.8.
14. Incubar la varilla en el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo/permeabilización durante 1 h a temperatura ambiente. Impedir que la luz.
15. Lave la varilla del colágeno 3 veces con PBS descrito en 5.4. -5.8.
16. Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Mantenga las muestras en PBS hasta que la proyección de imagen.
17. Análisis de las muestras como se describe en 3.

Resultados

Formación saliente durante la migración de la célula de T es un proceso altamente dinámico, que es dependiente de actina. Para visualizar la formación saliente del CTL humana primaria, nos transfectadas transitoriamente una proteína mEGFP fundido para etiquetar el citoesqueleto de actina en CTL como se describe antes del¹¹. Un día después de la transfección, las células fueron embebidas en la matriz de colágeno. Pilas de imágenes fueron adquiridas cada ...

Discusión

Mayoría en vitro ensayos se llevan a cabo sobre una superficie 2D, por ejemplo en las placas de cultivo celular, platos de Petri o en cubreobjetos, mientras que en vivo las células, especialmente las células inmunes, sobre todo un microambiente 3D la experiencia. Emergentes de la evidencia muestran que los patrones de migración de células inmunes diferencian entre 2D y 3D escenarios¹⁷. Por otra parte, los perfiles de expresión de las células tumorales también son diferent...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data