Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata

Resumen

Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.

Resumen

La barrera blood - brain (BBB) es un tejido de barrera dinámica que responde a varios estímulos fisiopatológicos y farmacológicos. Tales cambios resultantes de estos estímulos pueden grandemente modular la entrega de la droga al cerebro y, por extensión, causan grandes desafíos en el tratamiento del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Muchos cambios BBB que afectan a la farmacoterapia, involucran proteínas que son localizadas y expresadas en el nivel de las células endoteliales. De hecho, tales conocimientos sobre fisiología BBB en salud y enfermedad ha despertado considerable interés en el estudio de estas proteínas de membrana. Desde un punto de vista de investigación de ciencia básica, esto implica un requisito para un método simple pero robusto y reproducible para el aislamiento de los microvasos del tejido de cerebro de animales experimentales. Para preparar muestras de membrana de microvasos recién aislados, es imprescindible que preparaciones de muestra enriquecidas en células endoteliales pero limitadas en presencia de otros tipos de la célula de la unidad neurovascular (astrocitos, microglía y neuronas, pericitos). Un beneficio adicional es la capacidad para preparar muestras de animales individuales con el fin de captar la verdadera variabilidad de expresión de proteínas en una población experimental. En este manuscrito, se proporcionan detalles con respecto a un método que se utiliza para aislamiento de microvasos de cerebro de rata y preparación de muestras de la membrana. Enriquecimiento de microvasos, de muestras derivadas, se logra con cuatro pasos de centrifugación donde dextrano está incluido en el tampón de muestra. Este protocolo puede ser adaptado fácilmente por otros laboratorios para sus aplicaciones específicas. Muestras generadas de este protocolo se han demostrado para producir datos experimentales sólidos de los experimentos de análisis de proteína que pueden ayudar grandemente a la comprensión de las respuestas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos.

Introducción

La barrera blood - brain (BBB) existe en la interfase entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación sistémica y juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Específicamente, las funciones BBB a precisamente control soluto concentraciones en el líquido extracelular cerebral y suministrar eficientemente los nutrientes requeridos para satisfacer las demandas metabólicas considerable del CNS¹por tejido cerebral. Estas funciones implican que el BBB, que existe principalmente en el nivel de la célula endotelial microvascular, debe poseer mecanismos discretos que permiten algunas sustancias a parénquima cerebral asegurando que xenobióticos potencialmente perjudiciales no se acumulan. De hecho, las células endothelial microvasculares del cerebro no son fenestradas y exhiben limitada pinocitosis, que aseguran que la falta de permeabilidad no selectiva². Además, las células endoteliales de cerebro microvessel expresan firmemente proteínas cruce cruce y adherentes que actúan a la forma física "sello" entre las células endoteliales adyacentes y restringir enormemente difusión paracelular de sustancias transmitidas por la sangre en cerebro parénquima. De hecho, la permeabilidad selectiva de sustancias endógenas y exógenas requiere expresión funcional de transportadores de la absorción y flujo de salida de³. Uniones en generales, firmemente, las uniones y transportistas trabajan en conjunto para mantener las propiedades de la única barrera de la BBB.

El BBB es una barrera dinámica que responde a los estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos. Por ejemplo, se ha demostrado estrés hipoxia/reoxygenation para modular la expresión de proteínas de Unión estrecha crítica (es decir, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que se asocia con permeabilidad paracelular mayor para marcadores vasculares como sacarosa^4,5,6. Observaciones similares se han realizado en el BBB en el ajuste de lesión de cerebro traumática⁷ y dolor inflamatorio periférico^8,9. Estas mismas enfermedades también pueden modular los mecanismos de transporte en el BBB^{10,11,12,13,14}. De hecho, lesión hipoxia/reoxygenation mejora la expresión funcional del anión orgánico transporte polipéptido 1a4 (Oatp1a4) en el BBB, que puede conducir a aumentos significativos en el transporte de sangre al cerebro de sustratos específicos de transporte de Oatp tales como taurocholate de atorvastatina¹³. Propiedades BBB también pueden ser modificados por la farmacoterapia, un mecanismo que puede formar una base para ambos cambios profundos en la eficacia de la droga en el cerebro y las interacciones de los fármacos. Por ejemplo, mecanismos de señalización acetaminofén objetivos del receptor nuclear en las células endothelial microvasculares del cerebro, aumenta la expresión funcional del transportador de eflujo crítica P-glicoproteína (P-gp) y modifica la analgesia dependiente del tiempo conferidos por la morfina, un fármaco analgésico opiáceo y P-gp establecido transportan sustrato¹⁵. Una profunda comprensión de los cambios BBB, que puede ser inducida por enfermedades o por drogas, también requiere la identificación y caracterización de mecanismos específicos que controlan estas modificaciones. De hecho, se han identificado vías de señalización discretas en células endothelial microvasculares del cerebro que controlan la expresión molecular de ensambladura apretada proteínas^16,17 y transportistas^{15, 18,19}. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que vías moleculares complejas están involucradas en la regulación de uniones estrechas BBB y transportadores en salud y enfermedad.

Un reto importante en el estudio de la BBB es el requisito indispensable de un método simple y eficaz para el aislamiento de los microvasos del tejido cerebral derivado de animales de experimentación y posterior preparación de las muestras de la membrana. Estas muestras deben estar preparadas para que sean tanto enriquecidos en las células endothelial microvasculares del cerebro y limitadas en presencia de otros tipos de células. En los últimos años, múltiples metodologías para el aislamiento de la microcirculación del cerebro de roedor se han divulgado en la literatura científica^13,20,21,22. Este artículo describe un método reproducible para el aislamiento de microvasos del cerebro de la rata y para la preparación de las muestras enriquecidas con membrana endoteliales que puede utilizarse para el análisis de expresión de la proteína y simple, robusto. Una ventaja de este protocolo de aislamiento de microvasos es la capacidad para obtener preparaciones de muestra de alta calidad y con la suficiente producción de proteínas de un animal experimental individual. Esto permite la consideración de la variabilidad entre animal en la expresión de la proteína. Tal un avance en el presente Protocolo ha mejorado considerablemente la robustez de los estudios BBB porque sobrestimación o subestimación de la verdadera magnitud de los cambios de la proteína en el BBB ahora puede ser evitada. Además, la inclusión de múltiples pasos de centrifugación con dextrano permite mayor enriquecimiento de microvasos en muestras experimentales facilitando la eliminación de componentes celulares no deseados como las neuronas.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y se ajustan a la investigación Animal e institutos nacionales de salud (NIH): directrices de experimentos (llegar) En Vivo . El flujo de procedimientos para el protocolo se muestra en la figura 1.

1. preparación para el procedimiento

1. Preparar el buffer del microvessel de cerebro (BMB). Inicie pesando 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA y base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (es decir, Tris) 1,46 g en un vaso limpio. Añadir 1,0 L de agua desionizada. Mezclar los componentes del buffer BMB con un agitador magnético. Una vez que la solución se ha mezclado bien, ajustar el pH a 7.4 con 1,0 M de HCl.
2. Preparar solución de dextrano (75.000 MW) 26% (w/v) antes de anestesiar a los animales. Preparar la solución de dextrano como se describe en los pasos siguientes.
   Nota: Es muy importante preparar esta solución antes de tiempo porque dextrano puede tomar aproximadamente 1.5-2 h para disolver en buffer acuoso.
   1. Pesar el dextrano en polvo (26 g por 100 mL de tampón) en un vaso limpio.
   2. Mida el volumen adecuado de BMB y servir en un vaso limpio, separado.
   3. BMB para verter lentamente en el vaso de precipitados que contiene dextrán en polvo. Mezcle manualmente el dextrano en polvo durante verter de BMB con una varilla de vidrio mezclar.
   4. Ajustar el pH a 7.4 con 1,0 M HCl inmediatamente antes de usar.
      Nota: Un aislamiento típico de microvessels cerebrales de las ratas de Sprague-Dawley individuales 12 (hombre o mujer; 3 meses de edad, 200-250 g cada uno) requiere 200 mL de solución de dextrano (es decir, dextrano de 52 g en 200 mL de BMB).

2. extracción de tejido cerebral de ratas Sprague-Dawley

1. Tras el deseado tratamiento experimental, anestesiar ratas Sprague-Dawley con ketamina (50 mg/kg, i.p. de 2,5 mL/kg) y xilacina (10 mg/mL, 2.5 mL/kg I, p.). Diluir la ketamina y xilacina en solución salina 0.9% para una concentración final de 20 mg/mL y 4,0 mg/mL respectivamente. Eutanasia a animales por decapitación usando una afilada guillotina con arreglo a directrices IACUC. Utilice el mismo procedimiento para las ratas de Sprague-Dawley machos y hembras.
2. Resecar la piel del cráneo de ratas haciendo un solo corte transversal usando tijeras quirúrgicas.
3. Con gubias, cuidadosamente retire la placa de cráneo y exponer el cerebro.
4. Quitar el cerebro con una espátula. Separar el cerebro y el tejido cerebral aislado dentro un tubo cónico de 50 mL que contiene 5 mL de BMB. Añadir 1,0 μL de inhibidor de la proteasa cóctel por 1,0 mL de tampón de BMB inmediatamente antes del uso.

3. procesamiento del cerebro

1. Transferir el tejido cerebral del tubo cónico de 50 mL a una placa de Petri limpia.
2. Con unas pinzas, gire suavemente el cerebro en papel de filtro de diámetro de 12,5 cm para quitar las meninges externas, que libremente se adhieren a la corteza cerebral. Suavemente presione el tejido cerebral contra el papel de filtro y gire el tejido otra vez. Gire el papel filtro con frecuencia durante este paso.
3. Separar el plexo coroideo de los hemisferios cerebrales con unas pinzas.
   Nota: El plexo coroide aparece como un tejido membranoso transparente localizado en la superficie de los ventrículos cerebrales.
4. Suavemente aplanar el tejido cerebral y eliminar resto de meninges y bulbos olfativos con unas pinzas.
5. Coloque el tejido cerebral cortical en un mortero de vidrio frío. Añadir 5,0 mL de inhibidor de proteasa que contiene BMB cóctel al mortero.
6. Usando un homogeneizador de tendido eléctrico, homogeneizar el tejido cerebral con 15 arriba y abajo movimientos a 3.700 rpm. Realizar homogeneización usando una amoladora de tejido de mortero de 10 mL. Entre homogeneización de cada muestra individual, limpia el mortero con etanol al 70%.
   Nota: Homogeneización trazos deben ser coherentes en términos de ritmo y magnitud.
7. Vierta el homogeneizado en tubos de centrífuga etiquetados.

4. centrifugación pasos

1. Añadir 8,0 mL de solución de dextrano de 26% a cada tubo de centrífuga etiquetado que contiene homogeneizado de cerebro.
2. Invertir el tubo dos veces y luego vórtice completamente la muestra. Llevar a cabo el Vortex de cada muestra usando ángulos múltiples para asegurar una mezcla completa de solución de homogeneizado de cerebro con solución de dextrano de 26%.
3. Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
   Nota: Para algunos análisis, es útil comparar microvessels cerebrales con la parenquimia del cerebro. Debe ser la evaluación de la expresión de proteínas en el tejido cerebral requiere, el sobrenadante de esta paso de centrifugación (es decir, fracción parenquimatosa cerebral) puede ser recogido y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.
4. Quite el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío y pipeta Pasteur de vidrio.
   Nota: Debe tenerse cuidado para no perturbar el sedimento. De lo contrario, se reducirá cantidad de los microvessels cerebrales recogidos, que disminuirá significativamente la producción de proteína de este procedimiento.
5. Resuspender el sedimento en 5,0 mL de BMB con inhibidor de la proteasa cocktail (es decir, 1,0 μL inhibidor de la proteasa cóctel por 1,0 mL de tampón de BMB). Vórtice de la pelotilla para asegurar una mezcla completa.
6. Añadir 8,0 mL de dextrano de 26% a cada tubo de centrífuga y vortex como se describe en los pasos 4.1 4.2 del presente Protocolo.
7. Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
8. Usando un frasco de vacío y una pipeta de cristal, aspirar el sobrenadante y asegurar que pellet que contiene los microvasos cerebrales no se interrumpa.
   Nota: Material de exceso que se haya adherido a la pared del tubo no contiene microvasos y debe ser cuidadosamente limpiado y quitado.
9. Repita los pasos 4.5 a 4.8 un adicional dos veces.
10. Una vez 4 pasos de centrifugación dextrano se han completado, agregar 5,0 mL de BMB a cada pellet y agitar para Resuspender la muestra.
    Nota: Después de finalización de paso 4.10, todo microvessels pueden recogerse para el análisis de la localización de la proteína. Esto puede lograrse tomando 50 μL alícuota del microvessel suspende de nuevo la pelotilla y manchar en un portaobjetos de vidrio. Microvasos son entonces calor fijo a 95 ° C por 10 min en un bloque de calentamiento seguido de fijación en etanol helada para un adicional mínimo 10 diapositivas luego pueden ser almacenado a 4 ° C hasta que la necesite para los estudios por imágenes.

5. ultracentrifugación para preparar muestras de membranas microvasculares del cerebro Total

1. Transferir las muestras al homogenizador de vidrio frío.
2. Usando un homogeneizador de tendido eléctrico, homogeneizar el tejido cerebral con 8-10 arriba y abajo movimientos a 3.000 rpm. Homogeneización se realiza usando una amoladora de tejido de mortero de 10 mL. Limpiar el mortero con etanol al 70% después de homogeneización de cada muestra individual.
3. Transferir muestras para limpiar tubos de ultracentrífuga. Número y peso de cada tubo individual. Balance y par los tubos antes de cargar el rotor de la ultracentrífuga.
   Nota: Todos los peso y emparejamiento de los tubos de la ultracentrífuga se realizarán con las tapas en para asegurar una medición precisa de pesos tubo.
4. Centrifugar las muestras a 150.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
5. Usando un frasco de vacío y vidrio, pipeta Pasteur, aspirar el sobrenadante utilizando cuidado de no perturbar el sedimento de la membrana capilar.
6. Basado en el tamaño de la pelotilla, añadir un volumen apropiado de búfer de almacenamiento, que se compone de agua desionizada y BMB en una proporción de 1:1 (v/v). Por lo general, Pellet se resuspendió en 400-500 μL de buffer de almacenamiento de información. Añadir cocktail de inhibidores de proteasa en el búfer de almacenamiento en una proporción de 1,0 μL por 1.0 mL de buffer de almacenamiento.
7. Muestras de vórtice para Resuspender el pellet en buffer de almacenamiento.
8. Utilizando un pipeta Pasteur de vidrio, transferir las muestras de la membrana capilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado.
9. Muestra del paso a través de una aguja de jeringa x 5 para la muestra se mezcla bien y que no hay agregados celulares.
10. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta que se para el análisis.
    Nota: El contenido de proteína de cada muestra de membrana de microvasos se mide utilizando el método de Bradford.

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Resultados

El flujo experimental para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de membrana de microvasos se muestra en la figura 1. Utilizando el procedimiento presentado aquí, se demostró acertado aislamiento de microvasos intacto del cerebro de la rata (figura 2A). Estos buques fueron obtenidos después de la centrifugación con dextrano e inmediatamente antes de comenzar la ultracentrifugac...

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Discusión

En este artículo, se describe un método simple y eficaz de preparación de muestras de proteínas de membrana de microvasos recién aisladas de tejido cerebral de rata. Varios enfoques para aislamiento de microvasos de cerebro de rata o generación de las preparaciones de membrana de microvasculatura aislada se han divulgado en la literatura^{13,20,21,22 , 24}....

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Component of brain microvessel buffer
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Component of brain microvessel buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Component of brain microvessel buffer
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	General anesthetic
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	General anesthetic
0.9% saline solution	Western Medical Supply	N/A	General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)	VWR	#28320-100	Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes	Sarstedt	#60.540.386	Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder	DWK Life Sciences	#358039	Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	#H1758	Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps	Fine Science Tools	#91100-12	Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	#352070	Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous	Sigma-Aldrich	#459836	Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	#41121703	Used for ultracentrifugation of samples